姜黃素激活ROS/KEAP1/NRF2/miR-34a/b/c級聯(lián)抑制結直腸癌轉移

       姜黃素是從姜黃根中分離出來的一種天然植物化學物質，是預防和治療結直腸癌/CRC的候選藥物。作者使用遺傳方法來確定p53/miR-34通路作為姜黃素作用的中介作用。將三種p53、miR-34a和/或miR-34b/c基因缺失的等基因CRC細胞系暴露于姜黃素中并進行細胞生物學分析。通過siRNA介導的NRF2抑制和異位表達，并對其靶基因進行Western blot、qPCR和qChIP分析。將結直腸癌細胞靜脈注射到NOD/SCID小鼠體內，通過縱向無創(chuàng)成像確定肺轉移的形成。在結直腸癌細胞中，姜黃素誘導細胞凋亡和衰老，并以p53不依賴的方式抑制細胞的遷移和侵襲。姜黃素通過誘導ROS激活KEAP1/NRF2/ARE通路。此外，姜黃素以ROS/ NRF2依賴和p53獨立的方式誘導miR-34a和miR-34b/c的表達。NRF2通過占據(jù)miR-34a和miR-34b/c啟動子區(qū)域的多個ARE基序直接誘導miR-34a和miR-34b/c。姜黃素逆轉了IL-6和缺氧誘導的miR-34a和miR-34b/c的抑制。缺失miR-34a和miR-34b/c可顯著降低姜黃素誘導的細胞凋亡和衰老，阻止姜黃素或異位NRF2對遷移和侵襲的抑制。在結直腸癌細胞中，姜黃素誘導MET并以miR34a依賴的方式阻止小鼠肺轉移的形成。此外，作者發(fā)現(xiàn)姜黃素可以增強5-FU對缺乏p53和miR-34a/b/c的CRC細胞的治療作用。KEAP1/NRF2/miR-34a/b/c軸的激活可介導姜黃素的腫瘤抑制活性，為激活腫瘤中miR-34基因以達到治療目的提供了一種新的途徑。本文于2023年5月發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》IF：12.4期刊。

技術路線

主要實驗結果
1、姜黃素對結直腸癌細胞的p53非依賴性作用
       姜黃素處理HCT116細胞后，p53蛋白的數(shù)量增加(圖1A)。為了確定p53與姜黃素對CRC細胞影響的相關性，作者用野生型p53和純合缺失p53的等基因HCT116細胞與姜黃素濃度增加一起處理48小時。存在p53的細胞顯示IC₅₀為21.49 μM，而缺乏p53的細胞的IC₅₀為18.03 μM (圖1B)。在p53存在或p53缺乏的RKO和SW48 CRC細胞系中觀察到類似的效果。姜黃素濃度為15 μM，略低于p53缺陷細胞的IC50值，用于后續(xù)實驗。通過阻抗測量(圖1C)證明了暴露于姜黃素強烈降低了p53缺陷和p53存在的HCT116細胞的增殖，并且在最終時間點證實了細胞數(shù)量的變化(圖1D)。姜黃素在結直腸癌細胞系RKO和SW48中也觀察到類似的p53非依賴性作用。姜黃素誘導的細胞活力和增殖速度的下降在p53缺陷細胞中更為明顯。因此，盡管p53在姜黃素治療后會積累，姜黃素對CRC細胞的這些作用是獨立于p53的。
       接下來，作者分析了哪些過程可能是姜黃素介導的增殖抑制的基礎。姜黃素導致細胞中sub-G₁ DNA含量增加，表明凋亡增加，與p53狀態(tài)無關(圖1E)。姜黃素處理后24小時，p53缺陷細胞表現(xiàn)出更多的G2/ m -阻滯，而WT p53細胞的G0/G1積累更多。膜聯(lián)蛋白V/ PI檢測顯示，與p53正常細胞相比，p53缺陷細胞的凋亡增加更為明顯(圖1F和S1G)。這些結果通過檢測被切割的parp、被切割的Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白得到了證實(圖1G、S1H和S1I):在p53缺失的細胞中，24小時檢測到Bax和被切割的Caspase 3的增加，而p53成熟的細胞顯示這些蛋白的誘導延遲了48小時。此外，通過檢測β-gal pH 6，姜黃素在p53精通和p53缺乏的HCT116細胞中誘導HCT116細胞衰老的程度相似(圖1H)。最后，姜黃素抑制了p53精通和p53缺乏的HCT116細胞的遷移和侵襲，后者顯示出更高的基礎遷移和侵襲水平(圖1I, J)。綜上所述，姜黃素抑制了細胞活力、增殖、遷移和侵襲，而以不依賴p53的方式誘導結直腸癌細胞的凋亡和衰老。

圖1姜黃素對結直腸癌細胞的p53非依賴性作用

2、姜黃素在結直腸癌細胞中通過ROS激活NRF2
       接下來，作者確定姜黃素對CRC細胞影響的機制。暴露于姜黃素48小時后，HCT116細胞的ROS水平顯著升高(圖2A)。以ROS誘導劑過氧化叔丁基(tBHP)為陽性對照，姜黃素的作用被抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制(圖2A，左)。在RKO和SW48細胞中觀察到類似的結果。有趣的是，缺乏p53的HCT116細胞中的ROS水平高于p53存在的HCT116細胞，這表明p53抑制姜黃素產生ROS(圖2A，右)。值得注意的是，在p53存在和p53缺乏的HCT116細胞中，姜黃素對細胞活力的抑制被NAC部分逆轉(圖2B)。在RKO和SW48細胞中觀察到類似的結果。NAC完全抑制PARP的裂解，從而抑制姜黃素誘導的細胞凋亡(圖2C)。KEAP1/ NRF2通路是細胞對氧化應激反應的中心介質。當暴露于ROS時，轉錄因子NRF2從Keap1釋放，并從細胞質轉運到細胞核，激活其靶基因的轉錄。姜黃素在p53存在和p53缺乏的HCT116細胞中誘導NRF2易位至細胞核(圖2D)。。暴露于姜黃素后，NRF2蛋白在HCT116細胞的核部分增加，而在細胞質部分減少(圖2E)。姜黃素不影響NRF2 mRNA的表達。NQO1是NRF2的保守靶基因，常用于監(jiān)測NRF2通路的活性。與NRF2的激活一致，姜黃素處理后NQO1 mRNA和蛋白的表達增加(圖2F, G)。重要的是，核易位和NRF2激活的誘導在很大程度上被NAC抑制ROS逆轉(圖2D、F、G)。在RKO和SW48細胞中都能觀察到上述類似的結果。

圖2姜黃素在結直腸癌細胞中通過ROS激活NRF2

3、姜黃素不依賴于p53來上調miR-34a和miR-34b/c的表達
       作者先前發(fā)表的觀察結果表明，miR-34a是由姜黃素誘導的，因此，作者確定了姜黃素在一組p53缺失的等基因CRC細胞系中誘導miR-34基因是否需要p53。結果表明，姜黃素誘導了HCT116細胞中獨立于p53狀態(tài)的pri-miR-34a和pri-miR-34b/c初級轉錄本的表達(圖3A-B)。在CRC細胞系SW48和RKO中也獲得了類似的結果(圖3C-F)。在p53存在和p53缺乏的HCT116細胞中，姜黃素也上調了成熟miR-34a的水平(圖3G)。由于NAC可以阻止姜黃素對pri-miR34a和pri-miR34b/c的誘導，因此作者認為它是由ROS介導的(圖3H, I)。綜上所述，這些結果表明，姜黃素在結直腸癌細胞系中以p53獨立和ROS依賴的方式誘導miR-34a和miR-34b/c的表達。

圖3姜黃素不依賴于p53來上調miR-34a和miR-34b/c的表達

4、姜黃素誘導的NRF2直接激活miR-34a和miR-34b/c
       接下來，作者假設被姜黃素誘導的ROS激活的NRF2可能是miR-34a和miR-34b/c表達的直接誘導因子。事實上，4種不同siRNA對NRF2的抑制阻止了姜黃素在p53缺陷HCT116細胞中誘導pri-miR-34a和pri-miR-34b/c的表達。相反，異位NRF2表達增加了攜帶突變型p53的SW480細胞中pri-miR-34a和pri-miR-34b/c的表達，以及成熟的miR-34a、NQO-1 mRNA和蛋白的表達(圖4C- D)。通過檢測miR-34a和miR-34b/c啟動子區(qū)域的基因組序列，作者在miR-34a位點鑒定了三個潛在的NRF2結合位點(TGAG/CnnnGC)，即所謂的ARE(抗氧化反應元件)，在miR-34b/c位點鑒定了一個潛在的NRF2結合位點(圖4E-G)。qChIP檢測證實姜黃素處理48小時后，miR-34a和miR-34b/c啟動子內四個ARE位點的NRF2占用增強(圖4H)。因此，作者認為姜黃素通過激活NRF2誘導miR-34a和miR-34b/c基因的表達，NRF2直接結合miR-34a和miR-34b/c啟動子并誘導其轉錄。并且miR-34的這種激活模式是與p53無關的。

圖4姜黃素誘導的NRF2直接激活miR-34a和miR-34b/c

5、miR-34a和miR-34b/c介導姜黃素對結直腸癌細胞的作用
       為了確定姜黃素的作用是否需要誘導miR-34a和miR-34b/c的表達，作者采用了使用CRSPR/CAS9方法使miR-34a和/或miR-34b/c基因缺失的等基因HCT116細胞。姜黃素處理后，miR34a-或miR-34a/b/c缺陷的HCT116細胞的活力顯著高于miR-34-存在的HCT116細胞(圖5A)。與miR-34a/b/c缺失的HCT116細胞相比，miR-34b/c缺失的細胞表現(xiàn)出中等的生存能力。與miR-34a/b/c精通的HCT116細胞相比，miR-34a/b/c缺乏導致姜黃素對細胞凋亡的增強減弱(圖5B)。在miR-34a/b/c存在的HCT116細胞中，姜黃素處理誘導了caspase 3的強烈裂解，而在mir -34缺失的細胞中未檢測到裂解的caspase 3(圖5C)。在miR-34a/b/c存在的HCT116細胞中，姜黃素抑制了已知的miR-34靶點抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并誘導了促凋亡蛋白BAX的表達(圖5C)。單獨或聯(lián)合缺失miR-34a和miR-34b/c的HCT116細胞顯示Bcl-2的表達升高，姜黃素處理后Bcl-2的表達超過未處理的WT細胞，這種影響在miR-34a/b/c缺陷的HCT116細胞中最為明顯。此外，在miR34a/b/c缺乏的HCT116細胞中，姜黃素對BAX的誘導作用減弱(圖5C)。因此，miR-34a/b/c對Bcl-2的抑制有助于姜黃素誘導細胞凋亡。
       通過測定在pH 6.0下檢測β-半乳糖苷酶活性來檢測，結果表明，姜黃素處理后miR-34a、miR-34b/c和miR-34a/b/c缺陷細胞的衰老沒有增加，而WT HCT116細胞的衰老明顯增加(圖5D)。最后，姜黃素誘導的對miR-34a、miR-34b/c和miR-34a/b/c缺陷細胞的遷移和侵襲的抑制明顯低于miR-34存在的HCT116細胞(圖5E-F)。在所有這些實驗中，聯(lián)合滅活miR-34a和miR-34b/c的細胞對姜黃素表現(xiàn)出最強的抗性。siRNA敲低NRF2部分阻止了姜黃素抑制細胞活力(圖5G)、遷移(圖5H)和侵襲(圖5I)。此外，在沒有姜黃素處理的情況下，NRF2的異位表達抑制了miR-34存在的HCT116細胞的遷移和侵襲(圖5J-K)。然而，在miR-34a/b/c缺陷的HCT116細胞中，異位NRF2對遷移和侵襲沒有影響，這表明miR-34a和miR-34b/c是NRF2功能所需的介質。綜上所述，作者的研究結果表明NRF2介導的miR-34a和miR-34b/c基因的激活是姜黃素影響細胞凋亡、衰老、遷移和侵襲的必要介質。

圖5 miR-34a和miR-34b/c介導姜黃素對結直腸癌細胞的作用

6、NRF2介導H₂O₂和tBHP對miR-34a/b/c的誘導
       先前有研究表明，H₂O₂處理誘導的ROS可誘導miR-34a的表達。因此，作者驗證了這種調節(jié)是否由NRF2介導。首先，作者分析了H₂O₂處理后CRC細胞系的細胞活力，并測定了表達p53突變體的HCT116細胞、p53缺失HCT116細胞和SW620細胞的IC₅₀值分別為92.61、48.35和61.52μM。用H₂O₂或tBHP處理p53存在和p53缺乏的HCT116細胞以及SW620細胞，導致NRF2靶基因NQO1的誘導，表明H₂O₂和tBHP激活NRF2(圖6A)。并且，H₂O₂和tBHP誘導miR-34a/b/c的表達，而siRNA介導的NRF2抑制可以阻止miR-34a/b/c的表達(圖6B-C)。

7、姜黃素誘導的NRF2逆轉缺氧或IL-6對miR-34a/b/c的抑制作用
       作者之前已經證明缺氧和IL-6介導的STAT3激活抑制了p53缺陷的CRC細胞中miR-34a/b/c的表達。為了確定姜黃素是否可以逆轉缺氧介導的miR-34a/b/c的抑制，作者在缺氧條件下培養(yǎng)p53缺陷的HCT116細胞并用姜黃素處理它們。結果表明，姜黃素完全逆轉了缺氧介導的miR-34a/b/c表達抑制(圖6D-E)。然而，當siRNA抑制NRF2時，這種逆轉明顯減弱(圖6D-E)，表明姜黃素的這種作用在很大程度上是由NRF2激活介導的。另外，IL-6介導的miR-34a和miR-34b/c的抑制被姜黃素完全逆轉(圖6F-G)。

圖6 NRF2軸對H2O2、姜黃素、缺氧和IL-6調控miR-34a/b/c的影響

8、姜黃素誘導MET并通過誘導miR-34a抑制肺轉移形成
       接下來，作者打算在移植到小鼠體內后研究這些細胞，作者表征了姜黃素對SW620-Luc2細胞的影響，SW620-Luc2細胞穩(wěn)定表達熒光素酶。結果表明，姜黃素以劑量依賴性的方式抑制SW620-Luc2細胞的活力。MTT法測定IC₅₀為14.49 μM。隨后使用了這種濃度的姜黃素，在SW620-Luc2細胞暴露于姜黃素48小時后，pri-miR-34a和成熟的miR-34a的表達上調(圖7A-B)。與成熟的miR34a相比，成熟的miR-34b和miR-34c在暴露于姜黃素的SW620-Luc2細胞中的表達水平非常低。因此，作者重點分析了miR-34a在姜黃素對SW620-Luc2細胞的影響中的作用。作者之前的研究表明，miR-34a在p53誘導的CRC細胞間充質-上皮轉化(MET)中起關鍵作用。因此，作者驗證姜黃素誘導的miR-34a是否可能介導MET。結果表明，姜黃素處理SW620-Luc2細胞導致間質標記物Vimentin (VIM)、SNAIL、SLUG和ZEB1的抑制(圖7E)。此外，姜黃素的這種抑制作用被miR-34a特異性拮抗劑所消除。使用拮抗劑沉默miR-34a來確定姜黃素以miR-34a依賴的方式抑制SW620-Luc2細胞的入侵和遷移 (圖7C-D)。
       最后，作者進行了小鼠異種移植實驗，以確定姜黃素是否會影響結直腸癌細胞形成肺轉移的能力。因此，作者在體外用姜黃素或/和miR-34a特異性拮抗劑處理SW620-Luc2細胞48小時。隨后，將這些細胞注射到NOD/SCID小鼠的尾靜脈中，以評估肺轉移的形成?？v向無創(chuàng)成像顯示，姜黃素治療SW620-Luc2細胞在注射后5周內完全消除了轉移形成(圖7F-G)。然而，拮抗劑同時抑制miR-34a部分恢復姜黃素治療后的轉移形成(圖7F-G)。注射后5周，注射姜黃素處理的SW620-Luc2細胞的小鼠，切除的肺部沒有宏觀可見的轉移(圖7H)。HE染色證實姜黃素處理的細胞注射小鼠中沒有轉移結節(jié)(圖7H-I)。然而，當SW620-luc2細胞同時接受miR-34anantagomirs和姜黃素處理時，會形成肺轉移(圖7H-I)。綜上所述，這些結果表明姜黃素通過誘導miR-34a抑制轉移的形成。

圖7姜黃素誘導MET并通過誘導miR-34a抑制肺轉移形成

9、p53和miR-34a/b/c調節(jié)對姜黃素和/或5-FU的敏感性
       最后，作者研究了姜黃素聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)對結直腸癌細胞活力的影響，該藥物被廣泛用于結直腸癌的治療。為此，作者使用臨床相關且可耐受濃度的5-FU (2mg /L)和姜黃素(15μM)。姜黃素和5-FU聯(lián)合處理HCT116細胞，與單獨處理任何一種化合物相比，顯示出更強的細胞活力抑制(圖8A)。與存在p53的細胞相比，缺乏p53的細胞對姜黃素更敏感，但對5-FU的抗性更強。然而，姜黃素和5-FU處理后，p53缺失細胞和p53存在細胞之間沒有差異(圖8A)。與wt細胞相比，miR-34a-和miR-34a/b/c缺陷細胞對姜黃素的抗性更強，但對5-FU的抗性僅略強。然而，miR34a-和miR-34a/b/c缺乏導致對姜黃素和5-FU聯(lián)合的抵抗力明顯提高(圖8B)。miR-34a-或miR-34a/b/c缺陷細胞中p53的進一步缺失增加了它們對5-FU的抗性。另外，p53的失活逆轉了miR-34a-或miR-34a/b/c缺陷細胞對姜黃素和姜黃素與5-FU聯(lián)合的耐藥性(圖8C, D)。人結腸上皮細胞(HCEC-1CT)和人腸成纖維細胞(CCD-18Co細胞)對姜黃素和5-FU的敏感性低于HCT116細胞(圖8E-F)。綜上所述，這些結果表明姜黃素可能增強5-FU對CRC細胞的治療作用。

圖8 p53和miR-34a/b/c調節(jié)對姜黃素和/或5-FU的敏感性

實驗方法
MTT實驗，RNA分離，qRT-PCR，Western blot，染色質免疫沉淀反應，細胞ROS檢測，異種移植小鼠模型的轉移形成，細胞遷移實驗，細胞劃痕實驗，RNA敲降，熒光素酶報告實驗
參考文獻
Liu CF, Rokavec M, Huang ZK, Hermeking H. Curcumin activates a ROS/KEAP1/NRF2/miR-34a/b/c cascade to suppress colorectal cancer metastasis. 2023, May. doi: 10.1038/s41418-023-01178-1.