B4GALT1通過多水平調(diào)控PD-L1的表達(dá)來促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-10-10
B4GALT1通過將β-1,4鏈半乳糖轉(zhuǎn)移到受體糖,參與N-糖基化的形成,越來越多的證據(jù)表明該蛋白與腫瘤的生物學(xué)和進(jìn)展相關(guān)......



       隨著肺癌篩查的普及和計(jì)算機(jī)斷層掃描在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用,檢出的肺結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加,其中許多為原位腺癌(AIS)、微浸潤性腺癌(MIA)和浸潤性腺癌(IAC)。手術(shù)切除后,AIS和MIA的5年生存率均接近100%,而IAC則沒有如此好的生存獲益。多個(gè)專業(yè)學(xué)會(huì)修訂了肺腺癌(LUAD)及其癌前病變的分類,包括從不典型腺瘤樣增生(AAH)到AIS、MIA和最終IAC的逐步進(jìn)化譜。之前的研究描述了AIS、MIA和IAC的基因組、免疫和代謝情況,這可能有助于早期癌癥的檢測和預(yù)防。然而,對于早期肺腺癌從MIA到IAC的發(fā)展軌跡,仍然缺乏深入的分子事件。多原發(fā)肺癌(MPLC)是指同一患者存在多個(gè)獨(dú)立來源的腫瘤,常以多個(gè)肺結(jié)節(jié)的形式出現(xiàn),多為MIA或IAC。同一腫瘤龕內(nèi)不同病灶的比較可以排除患者遺傳背景差異造成的偏倚,從而更深入地了解MIA向AIS進(jìn)展過程中腫瘤內(nèi)部的分子改變。β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1(B4GALT1),一個(gè)與N-糖合成相關(guān)的基因,在早期肺腺癌的進(jìn)展中至關(guān)重要。N-糖基化模式有助于許多致癌蛋白的穩(wěn)定性和活性,從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。B4GALT1通過將β-1,4鏈半乳糖轉(zhuǎn)移到受體糖,參與N-糖基化的形成,越來越多的證據(jù)表明該蛋白與腫瘤的生物學(xué)和進(jìn)展相關(guān)。然而,B4GALT1在肺癌中的作用及其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》,IF:11.3。
技術(shù)路線


主要研究結(jié)果
1. B4GALT1是早期肺腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子
       作者收集了4例MPLC患者的8例LUAD樣本,圖1A總結(jié)了其影像組學(xué)特征和臨床病理特征。每例患者的兩個(gè)原發(fā)腫瘤病理類型不同,MIA或IAC。然后,作者進(jìn)行了RNA測序,以探索驅(qū)動(dòng)這些樣本中侵襲前LUAD進(jìn)展為侵襲性LUAD的關(guān)鍵分子事件(圖1B)。隨后,作者利用UMAP對RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了無監(jiān)督聚類,發(fā)現(xiàn)了與這4例患者的MIA和IAC病變完全對應(yīng)的兩個(gè)聚類(圖1C),提示MIA和IAC具有不同的轉(zhuǎn)錄特征。GO和KEGG分析顯示,IAC中高表達(dá)的基因顯著富集于葡萄糖代謝通路(圖1D)。此外,隨著β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性信號(hào)通路的富集,N-糖的生物合成也被發(fā)現(xiàn),表明糖基化在早期肺癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。作為糖基化的一種類型,N-糖基化模式可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,而β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是參與N-糖基生物合成的關(guān)鍵酶。B4GALT1,一個(gè)編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因,是IAC樣本中上調(diào)最顯著的基因。因此,作者推測B4GALT1可能在早期肺腺癌MIA向IAC演變過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對TCGA-LUAD數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明,B4GALT1 mRNA表達(dá)確實(shí)在早期LUAD中隨著分期增加而增加,但在晚期LUAD中沒有(圖1E)。此外,GSE166720數(shù)據(jù)集根據(jù)病理分級(jí)將53例早期肺腺癌分為惰性(AIS和MIA)和浸潤性腫瘤(IAC),結(jié)果顯示侵襲性腫瘤中的B4GALT1 mRNA表達(dá)高于惰性腫瘤(圖1F)。此外,B4GALT1高表達(dá)預(yù)測TCGA-LUAD患者較差的DFS和OS(圖1G-H)。在GSE31210數(shù)據(jù)集的I期和II期LUAD患者中,高B4GALT1也預(yù)示著較差的OS(圖1I)。綜上所述,B4GALT1可能在早期肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。


圖1 B4GALT1是早期肺腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子


2. B4GALT1在體內(nèi)外調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移
       通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證B4GALT1對細(xì)胞增殖的影響。MTT結(jié)果顯示,B4GALT1敲低后細(xì)胞活力明顯下降。相反,B4GALT1過表達(dá)增加了細(xì)胞活力(圖2A)。同樣,EdU實(shí)驗(yàn)顯示B4GALT1對LUAD細(xì)胞增殖有顯著影響(圖2B)。集落形成實(shí)驗(yàn)表明B4GALT1表達(dá)對克隆形成能力也有影響(圖2C)。此外,B4GALT1敲低顯著誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞凋亡(圖2D)。然后,作者確定B4GALT1是否通過改變細(xì)胞周期影響LUAD細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,B4GALT1敲低伴隨著G1/G0期的細(xì)胞周期阻滯(圖2E)。


圖2 B4GALT1在體內(nèi)外調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞的增殖


       接下來,作者檢測了B4GALT1對細(xì)胞遷移和侵襲的潛在影響。在傷口愈合試驗(yàn)中,B4GALT1表達(dá)顯著損害了傷口閉合(圖3A)。Transwell實(shí)驗(yàn)也表明B4GALT1的敲低阻礙了腫瘤的遷移。相反,B4GALT1過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移(圖3B)。此外,B4GALT1敲低抑制了LUAD細(xì)胞通過基質(zhì)侵襲,而B4GALT1過表達(dá)促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的侵襲(圖3C)。
       作者將A549細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠皮下,以確定B4GALT1是否影響體內(nèi)LUAD腫瘤的生長。B4GALT1敲低組的腫瘤體積較對照組明顯減小。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),B4GALT1敲低組的腫瘤平均重量顯著低于對照組(圖3D)。此外,Ki67染色顯示,在B4GALT1敲低形成的腫瘤中,Ki67陽性細(xì)胞的比例降低(圖3E)。


圖3 B4GALT1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲


3. B4GALT1限制了CD8+T細(xì)胞的浸潤和活性
       通過對IAC中高表達(dá)基因的GO分析,作者還發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)功能的基因的富集(圖1D)。既往研究報(bào)道,在從MIA到IAC的LUAD進(jìn)展過程中,免疫抑制增強(qiáng)。因此,作者應(yīng)用CIBERSORT算法來估計(jì)MIA和IAC腫瘤中免疫細(xì)胞的相對豐度。作者發(fā)現(xiàn),與MIA相比,IAC的CD8+T細(xì)胞浸潤較少(圖4A)。隨后的免疫熒光染色分析也表明,IAC腫瘤中的CD8+T細(xì)胞比MIA腫瘤中的少(圖4B)。關(guān)鍵CD8+T細(xì)胞效應(yīng)分子GZMB的免疫組織化學(xué)染色顯示,IAC腫瘤的GZMB水平較低,表明IAC腫瘤中CD8+T細(xì)胞的活性減弱(圖4C)。為了確定B4GALT1是否引起了這種免疫狀態(tài)的改變,作者對這些樣本進(jìn)行了BGALT1的免疫組織化學(xué)染色(圖4D),發(fā)現(xiàn)B4GALT1的水平與CD8 +T細(xì)胞的數(shù)量之間存在明顯的負(fù)相關(guān),GZMB的水平也存在明顯的負(fù)相關(guān)(圖4E)。
       為了確定B4GALT1是否為功能失調(diào)T細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子,作者研究了在小鼠癌細(xì)胞與特異性靶向癌細(xì)胞抗原的小鼠原代T細(xì)胞共培養(yǎng)的背景下,公開可用的規(guī)律成簇的分散短回文重復(fù)序列(CRISPR)篩查的數(shù)據(jù)?;?個(gè)獨(dú)立研究中的9個(gè)這樣的篩選,作者發(fā)現(xiàn)靶向B4GALT1的gRNAs一致被負(fù)向選擇(圖4F)。這些結(jié)果表明,B4GALT1可能導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能障礙,并可能使肺腺癌細(xì)胞在失活時(shí)更容易受到CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論,作者進(jìn)行了T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn),以測試B4GALT1表達(dá)對CD8+T細(xì)胞活性的影響,CD8+T細(xì)胞活性是從健康供者的外周血和C57BL/6小鼠的脾臟中分離出來的(圖4G)。正如預(yù)期,B4GALT1抑制顯著增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的LUAD細(xì)胞死亡,并且在A549和LLC細(xì)胞系中,B4GALT1上調(diào)使LUAD細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞更具抗性(圖4H)。


圖4 B4GALT1限制了CD8+T細(xì)胞的浸潤和活性


4. B4GALT1與PD-L1相互作用并通過介導(dǎo)其糖基化增強(qiáng)PD-L1蛋白穩(wěn)定性,從而促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸
       越來越多的證據(jù)表明,免疫抑制與免疫檢查點(diǎn)的失調(diào)有關(guān)。因此,作者在B4GALT1高表達(dá)和低表達(dá)的腫瘤之間比較了著名的免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平(圖5A)。值得注意的是,CD274(PD-L1)在B4GALT1高表達(dá)的腫瘤中比在B4GALT1低表達(dá)的腫瘤中表達(dá)最顯著。在A549和LLC細(xì)胞中,敲低或過表達(dá)B4GALT1均可引起PD-L1 mRNA和蛋白水平的降低或升高(圖5B-C)。因此,作者有理由假設(shè)B4GALT1通過影響肺腺癌中PD-L1的表達(dá)來介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能障礙。在過表達(dá)B4GALT1的LUAD細(xì)胞中,敲低CD274可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞殺傷能力,這證實(shí)了這一推測(圖5D)。
       接下來,作者研究了B4GALT1如何影響PD-L1水平。B4GALT1是參與N-糖基生物合成的關(guān)鍵基因,參與N-糖基化的形成。因此,作者推測N-糖基化可能通過涉及翻譯后修飾的機(jī)制參與B4GALT1介導(dǎo)的PD-L1調(diào)控。首先,在CHX處理后,作者發(fā)現(xiàn)B4GALT1敲除降低了A549和LLC細(xì)胞中PD-L1蛋白的半衰期,而B4GALT1穩(wěn)定表達(dá)顯著增加了PD-L1蛋白的穩(wěn)定性(圖5E)。此外,co-IP驗(yàn)證了B4GALT1與PD-L1之間的相互作用(圖5F)。為了在生物化學(xué)上證實(shí)兩者的相互作用,作者表達(dá)并純化了含有B4GALT1的GST融合蛋白,并進(jìn)行了GST pull down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,GST-B4GALT1可以下調(diào)A549細(xì)胞裂解液中的PD-L1(圖5G)。然后,作者試圖研究B4GALT1是否通過N-連接糖基化來調(diào)節(jié)PD-L1蛋白。用衣霉素(N-連鎖糖基化抑制劑)處理A549和LLC細(xì)胞,與未處理細(xì)胞相比,PD-L1表達(dá)顯著下調(diào),與B4GALT1敲低一致。此外,衣霉素恢復(fù)了B4GALT1過表達(dá)誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)(圖5H)。為了進(jìn)一步鑒定PD-L1的N-連接糖基化位點(diǎn),作者首先使用NetNGlyc 1.0服務(wù)器工具預(yù)測了PD-L1的N-連接糖基化基序。然后,使用flag標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B4GALT1過表達(dá)細(xì)胞,這些質(zhì)粒攜帶PD-L1的全長編碼序列,或者含有N35、N192或N200處突變的N-連鎖糖基化位點(diǎn)的編碼序列,用于CHX分析(圖5I)。結(jié)果顯示,即使在B4GALT1過表達(dá)的情況下,突變N192和N200的N-糖基化位點(diǎn)也顯著降低了PD-L1蛋白的穩(wěn)定性,提示這些殘基是B4GALT1修飾的PD-L1的N-糖基化位點(diǎn)。綜上所述,B4GALT1通過介導(dǎo)PD-L1的糖基化與PD-L1相互作用,從而促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸。


圖5 B4GALT1與PD-L1相互作用并通過介導(dǎo)其糖基化增強(qiáng)PD-L1蛋白穩(wěn)定性,從而促進(jìn)早期肺腺癌的免疫逃逸


5. B4GALT1通過調(diào)控TAZ糖基化促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄
       以上數(shù)據(jù)表明,B4GALT1可以增強(qiáng)PD-L1蛋白的穩(wěn)定性。此外,作者注意到B4GALT1敲低或過表達(dá)后CD274 mRNA的變化(圖5B)。這些結(jié)果表明,B4GALT1也可能對CD274有轉(zhuǎn)錄作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè),作者進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測,結(jié)果顯示B4GALT1過表達(dá)增強(qiáng)了CD274啟動(dòng)子活性(圖6A)。此外,有趣的是,作者發(fā)現(xiàn)IAC腫瘤中高表達(dá)的基因在Hippo信號(hào)通路中富集(圖1D)。在之前的研究中,作者發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子——含WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(TAZ)可以通過增加CD274啟動(dòng)子的活性來誘導(dǎo)PD-L1的上調(diào)。在本研究中,作者還驗(yàn)證了TAZ在肺腺癌中對CD274的調(diào)控作用。TAZ敲低導(dǎo)致A549和LLC細(xì)胞中CD274 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖6B-C)。進(jìn)一步的報(bào)告基因分析表明,TAZ敲低降低了全長CD274啟動(dòng)子的活性,但對缺失區(qū)域的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)無影響(圖6D)。重要的是,B4GALT1過表達(dá)不影響帶有缺失區(qū)域的CD274啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的活性,表明B4GALT1通過TAZ影響CD274啟動(dòng)子的活性(圖6E)。此外,TAZ敲低顯著降低了B4GALT1誘導(dǎo)的全長CD274啟動(dòng)子活性和CD274 mRNA水平的增加(圖6F-G),表明B4GALT1通過TAZ介導(dǎo)了CD274的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外,TAZ敲低逆轉(zhuǎn)了B4GALT1誘導(dǎo)的PD-L1蛋白水平(圖6H)。
       作者進(jìn)一步探索了B4GALT1影響TAZ水平的機(jī)制。通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)集的分析,作者觀察到B4GALT1的表達(dá)在蛋白水平而不是mRNA水平與TAZ水平顯著相關(guān),這與qRT-PCR和WB結(jié)果一致(圖6I-J)。因此,作者懷疑TAZ蛋白可能通過獲得N-糖基修飾而在翻譯后水平受到B4GALT1的調(diào)節(jié)。通過CHX分析,作者發(fā)現(xiàn)B4GALT1可以增加TAZ蛋白的穩(wěn)定性(圖6K)。此外,co-IP(圖6L)和GST pull-down實(shí)驗(yàn)(圖6M)表明B4GALT1直接與TAZ相互作用。此外,在B4GALT1過表達(dá)細(xì)胞中,衣霉素處理后TAZ蛋白水平顯著降低(圖6N),表明TAZ的N-連接糖基化受B4GALT1調(diào)節(jié)。然后,作者應(yīng)用NetNGlyc 1.0服務(wù)器工具預(yù)測TAZ的潛在N-連接糖基化位點(diǎn),并突變N184和N256位點(diǎn)(圖6O)。CHX分析結(jié)果表明,B4GALT1過表達(dá)不能促進(jìn)TAZ蛋白穩(wěn)定性,但N256位點(diǎn)發(fā)生了突變,提示N256是B4GALT1修飾的TAZ的N-糖基化位點(diǎn)。
       這些結(jié)果表明,B4GALT1/TAZ介導(dǎo)了PD-L1的翻譯修飾。


圖6 B4GALT1通過調(diào)控TAZ糖基化促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄


6. 抑制B4GALT1可增強(qiáng)抗PD-1治療LUAD的療效
       為了評估B4GALT1在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用,作者使用LLC小鼠LUAD細(xì)胞系在免疫正常的C57BL/6小鼠中構(gòu)建皮下異種移植瘤,然后使用PD-1 mAb或IgG同型CTRL(IgG2a)處理移植瘤(圖7A)。作者發(fā)現(xiàn),與對照組相比,B4GALT1敲低限制了腫瘤生長,這與PD-1單抗治療一致。此外,與其他組相比,B4GALT1抑制和PD-1阻斷聯(lián)合治療組的腫瘤負(fù)荷下降最顯著,且未觀察到體重減輕和其他常見毒性作用(圖7B-F)。在治療結(jié)束時(shí)收集腫瘤樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析,免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)分析表明,B4GALT1缺陷顯著降低了PD-L1水平,增加了CD8+T細(xì)胞和CD8+GZMB+細(xì)胞密度(圖7G-H)。特別是,PD-1 mAb和B4GALT1抑制聯(lián)合治療導(dǎo)致了腫瘤區(qū)域中活化CD8+T細(xì)胞的最顯著富集(圖7H)。這些結(jié)果證實(shí)抑制B4GALT1通過下調(diào)PD-L1表達(dá)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞浸潤和功能,從而提高抗PD-1治療的療效。綜上所述,這些結(jié)果表明B4GALT1通過上調(diào)PD-L1表達(dá)和抑制CD8+T細(xì)胞浸潤促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。


圖7 抑制B4GALT1可增強(qiáng)抗PD-1治療LUAD的療效


結(jié)論
       基于獨(dú)特的MPLC模型,作者揭示了B4GALT1促進(jìn)了早期LUAD的免疫逃避和腫瘤發(fā)生,并確定了B4GALT1在轉(zhuǎn)錄水平通過穩(wěn)定TAZ蛋白調(diào)節(jié)PD-L1,在翻譯后水平直接通過PD-L1的N-連接糖基化蛋白修飾來調(diào)節(jié)PD-L1的新機(jī)制。該研究為將B4GALT1作為LUAD的潛在治療靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法
RNA測序,qRT-PCR,蛋白質(zhì)印跡,MTT增殖測定,菌落形成測定,細(xì)胞遷移和侵襲測定,流式細(xì)胞術(shù),動(dòng)物實(shí)驗(yàn),免疫組織化學(xué)(IHC),免疫熒光,免疫共沉淀,GST pull-down,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測
參考文獻(xiàn)
Cui Y, Li J, Zhang P, Yin D, Wang Z, Dai J, et al. B4GALT1 promotes immune escape by regulating the expression of PD-L1 at multiple levels in lung adenocarcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 12;42(1):146.