p53 GOF突變體與ERG通過β-Catenin激活和嘧啶合成促進前列腺癌
TP53腫瘤抑制基因是人類癌癥中最常見的突變基因。在約50%的前列腺癌癥（PCa）患者中會發(fā)生ETS相關基因（ERG）與TMPRSS2基因融合。在本研究中，作者確定p53功能獲得（GOF）突變體基因的反式激活功能，并揭示β-Catenin是p53 GOF突變體的轉錄靶基因，也是TMPRSS2-ERG和p53 GOF突變體陽性PCa驅動和治療靶點。該研究于2023年8月發(fā)表在《nature communications》，IF：16.6。
技術路線
1. 前列腺腫瘤中TMPRSS2- ERG轉基因與Trp53缺失協(xié)同和p53 GOF突變體的作用
在TCGA數(shù)據(jù)與轉移性PCa SU2C隊列數(shù)據(jù)中，作者確定TMPRSS2-ERG融合與TP53失活在前列腺癌患者中同時發(fā)生（圖1a，b）。
作者以前列腺特性（Pb）驅動的Cre重組酶轉基因小鼠（Pb-Cre4）、Pb-TMPRSS2-ERG（T2-ERG）轉基因小鼠、Trp53loxp-top-loxp-R172H/loxp小鼠為基礎，共產(chǎn)生六組基因工程小鼠（GEM）：（1）野生型（WT）對照；（2） 前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因（Pb-T2-ERG）；（3）前列腺細胞特異性Trp53敲除（Pb-Cre+;Trp53p/p或Trp53pc-/-）；（4）前列腺細胞特異性Trp53敲除和R172H突變體敲入（Pb-Cre+;Trp53R172H/p或Trp53pcR172H/-）；（5）前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因和Trp53敲除（Pb-Cre+；Pb-T2-ERG;Trp53p/p或Pb-T2-RG;Trp53pc-/-）；（6）前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因和Trp53敲除/敲入（Pb-Cre+;Pb-T2-ERG;Trp53R172H/p或Pb-T2-RG;Trp53pcR172H/-）（圖1c）。TP53 R175H被認為是GOF突變。TMPRSS2-ERG過表達和Trp53缺失誘導10月齡Trp53pc-/-小鼠局灶性低前列腺上皮內(nèi)瘤變（LGPIN）和約50% 15月齡小鼠高PIN（HGPIN）和局灶性腺癌（圖1c，d）。重要的是， PbT2 ERG';Trp53pcR172H/-小鼠在10月齡時發(fā)展為HGPIN和腺癌，約90%小鼠在15個月齡時發(fā)展為侵襲性HGPIN和/或腺癌（圖1c，d）。值得注意的是， IHC結果顯示，這些癌癥和PIN病變均為雄激素受體（AR）陽性（圖1c）。與之前的報道一致，在10月齡Pb-T2-ERG小鼠中未觀察到PIN；然而，20%的小鼠在15月齡時出現(xiàn)局灶性LGPIN病變（圖1d）。作者所觀察到的年齡依賴性疾病發(fā)展進一步支持ERG過表達通過與其他基因改變協(xié)同促進前列腺腫瘤發(fā)生。在Pb-T2-ERG;Trp53pc-/-和Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠兩個年齡段中，組織學變化與增加的Ki67染色一致。
除R175H突變，在人前列腺癌細胞系VCaP（TMPRSS2-ERG（ERGΔN39）/TP53R248W/-DBD突變體陽性）中，作者證明ERG或p53 DNA結合域（DBD）突變體單獨敲除或雙敲除抑制VCaP細胞生長（圖1g，h）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，小鼠Trp53中R172H和人TP53中R248W等突變分別作為GOF突變驅動小鼠前列腺腫瘤發(fā)生和人前列腺癌細胞生長。
圖1：TMPRSS2-ERG融合和TP53失活協(xié)同誘導小鼠前列腺腫瘤發(fā)生
2. ERC與p53 GOF突變體上調(diào)PSGs
作者對六組GEM的前列腺組織進行RNA-seq分析。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，來源于Pb-T2-ERG;Trp53pc-/-小鼠和Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/- PIN病變的前列腺腫瘤共享有370個上調(diào)基因，各自有901個和304個獨特上調(diào)靶點（圖2a）。通過對這組基因數(shù)據(jù)和先前報道的GEM模型中TMPRSS2-ERG前列腺腫瘤產(chǎn)生的ERG ChIP-seq數(shù)據(jù)整合分析，作者從Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠中鑒定出531個前列腺腫瘤中高度上調(diào)的ERG靶基因（圖2b，c）。IPA分析表明，這些基因中多數(shù)與癌癥相關（圖2d）。與來自對照組小鼠的前列腺組織相比，PSGs亞群，包括Umps、Rrm1、Rrm2 和 Tyms在Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-腫瘤中上調(diào)（圖2a，c-g）。這些結果通過Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠腫瘤RT-qPCR進一步得到驗證（圖2h，i）。這些數(shù)據(jù)表明，p53 GOF突變體與T2-ERG協(xié)同上調(diào)前列腺癌PSG表達。
圖2：ERG和p53GOF突變體對GEM前列腺腫瘤和人前列腺癌細胞系嘧啶合成基因的協(xié)同調(diào)控
3. CTNNB1被鑒定為p53 GOF突變體的轉錄靶基因
為確定p53 GOF突變體是否通過與PSG基因組位點結合來調(diào)節(jié)PSG表達，作者使用抗p53抗體在VCaP細胞中進行p53 ChIP-seq。共鑒定到1116個與p53 GOF突變體R248W顯著結合的峰（P＜1E-10），這些峰定位于啟動子和非啟動子區(qū)域，并與615個基因相關（圖3a）。但在VCaP細胞中沒有檢測到p53 GOF突變體R248W與典型p53靶基因的結合，也沒有檢測到R248W在PSG上的結合位點。這表明p53 GOF突變體間接調(diào)控PSG表達。
為明確介導p53 GOF突變體調(diào)控PSG表達的下游效應因子，作者對p53突變體R248W結合基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)其富集于轉錄共調(diào)節(jié)因子結合途徑（圖3b），并在CTNNBI基因啟動子中檢測到R248W結合峰，該基因編碼β-Catenin (圖3c)。在VCaP細胞中通過ChIP-qPCR進一步驗證該結果（圖3d）。
接下來，作者對p53 R248W ChIP qPCR進行分析（圖3e）。他們發(fā)現(xiàn)R248W突變體特異性占據(jù)VCaP細胞中ChIP-seq峰的中心（圖3e，f）。使用VCaP細胞裂解物和生物素標記的雙鏈DNA探針進行電泳遷移率偏移測定（EMSA）確定突變型p53結合序列（MP53BS）（圖3e）。在測定中添加競爭性未標記探針或抗p53抗體，MP53BS探針的EMSA信號顯著減弱（圖3h，i）。另外，作者還證實，p53所有DBD突變體都與MP53BS探針結合（圖3j），表明p53 DBD突變體直接與CTNNB1啟動子的MP53BS結合。
作者使用CRISPR/Cas9敲除了DU145細胞中CTNNB1啟動子MP53BS序列并產(chǎn)生4個MP53BS敲除克隆。在這4個克隆當中，CTNNB1 mRNA和β-Catenin表達均顯著下調(diào)（圖3k，l）。雖然p53 GOF突變體敲除顯著降低對照DU145細胞中β-Catenin mRNA和蛋白質(zhì)表達，但它未能進一步降低MP53BS KO細胞中β-Catenin表達（圖3m，n）。這些數(shù)據(jù)表明β-Catenin是p53 GOF突變體的調(diào)節(jié)靶點，并通過CTNNB1啟動子中MP53BS介導。
圖3：GOF突變體p53與啟動子結合并反式激活CTNNB1基因表達
4. TMPRSS2-ERG與p53 GOF突變體協(xié)調(diào)β-Catenin表達
RNA-seq與RT-qPCR結果顯示，Ctnnb1 mRNA在Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠前列腺腫瘤中上調(diào)（圖4a，b，c）。CTNNB1 mRNA僅在SU2C隊列的ERG融合和TP53突變雙陽性患者樣本中顯著上調(diào)（圖4d）。作者不僅發(fā)現(xiàn)ERG與CTNNB1啟動子結合，而且還鑒定出MP53BS相鄰的ERG結合序列（ERGBS）（圖4e）。ChIP和re-ChIP證實突變型p53和ERG與VCaP細胞中CTNNB1啟動子同一區(qū)域結合（圖4f）。VCaP細胞中ERG敲低下調(diào)CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平（圖4g，h），支持GOF突變型p53在調(diào)節(jié)PCa細胞β-Catenin表達中的主要作用。通過敲低VCaP細胞中ERG或p53突變體，降低了H3K27Ac（基因轉錄的活性標記物）在CTNNB1啟動子處的富集（圖4i）。螢光素酶報告基因分析結果顯示，CTNNB1啟動子活性通過不同的p53 GOF突變體單獨表達而增加，而不是通過單獨表達ERG；然而，p53突變體和ERG共表達顯著增強啟動子活性（圖4j）。這些數(shù)據(jù)表明TMPRSS2-ERG與p53 GOF突變體協(xié)同調(diào)節(jié)PCa細胞中CTNNB1表達。
圖4：ERG和GOF突變型p53共調(diào)節(jié)β-Catenin表達
5. TMPRSS2-ERG與β-Catenin協(xié)調(diào)PSG表達
β-Catenin與PSG的啟動子和/或非啟動子區(qū)域結合，包括UMPS、RRM1、RRM2和TYMS（圖5a）。ChIP-qPCR進一步證實ERG和β-Catenin在這些基因座的啟動子或增強子上的存在（圖5b，c）。
β-Catenin單獨敲低抑制VCaP細胞中PSG mRNA和蛋白表達（圖5d，e），ERG或p53 R248W敲低則不會導致PSG mRNA和蛋白在β-Catenin缺失細胞系中進一步降低表達（圖5d，e）。
作者敲低VCaP細胞中內(nèi)源性ERGΔN39和p53突變體R248W，并測定嘧啶合成的三個關鍵中間體UMP、dTTP和dTDP水平（圖2e）。UMPS、RRM1和RRM2這三種嘧啶合成的關鍵酶單獨或同時耗竭（圖2e）在很大程度上抑制VCaP細胞生長（圖5i，j）。同時，作者證明Dox誘導的PSG敲低在很大程度上抑制了小鼠中VCaP腫瘤生長（圖5k，l）。Dox給藥也降低了腫瘤重量（圖5m）。這些數(shù)據(jù)表明，ERG和p53突變體誘導上調(diào)關鍵的PSG，如UMPS、RRM1和RRM2，這對于體外體內(nèi)TMPRSS2-ERG和p53突變體雙陽性PCa細胞的生長很重要。
圖5：ERG與β-Catenin共占據(jù)PSG位點并共調(diào)控其表達
6. β-Catenin抑制劑在體內(nèi)體外抑制PSG表達與TMPRSS2-ERG/ p53突變體陽性PCa細胞生長
ICG-001與PRI-724是β-Catenin抑制劑。這兩種藥物在p53突變體R248W陽性VCaP細胞中表現(xiàn)出更強的生長抑制作用（圖6a，b）。ICG-001處理VCaP細胞降低了PSG 表達，以及β-Catenin靶基因CCND1和c-MYC mRNA和蛋白水平的表達，并以劑量依賴性方式抑制細胞生長（圖6c–e）。用PRI-724處理VCaP細胞也獲得了類似的結果（圖6f–h）。接下來，作者在體內(nèi)檢測了β-Catenin抑制劑ICG-001的抗癌作用。ICG-001給藥顯著抑制了小鼠VCaP異種移植物腫瘤生長（圖6i–k）。IHC顯示，ICG-001處理降低了嘧啶合成酶如UMPS、RRM1和Ki67的表達，但沒有降低CREB結合蛋白（CBP）表達（圖6l，m）。
圖6：β-Catenin抑制劑抑制PSG表達和小鼠PCa異種移植物生長
7. β-Catenin-LEF/TCF是TMPRSS2-ERG/ p53突變體陽性
β-Catenin通過與DNA結合伴侶LEF/TCF家族蛋白（包括LEF1、TCF1、TCF3和TCF453）形成蛋白質(zhì)復合物來反式激活靶基因。作者最近報道基于寡核苷酸的PROTACs（O’PROTACs或OP）開發(fā)，以靶向LEF1進行蛋白質(zhì)破壞。有效的LEF1 O’PROTAC（OP-V1）幾乎完全溶解VCaP細胞中LEF1蛋白。這種O’PROTAC也在一定程度上下調(diào)TCF3和TCF4蛋白，這與LEF/TCF蛋白家族成員共享相似核心DNA靶序列（例如TCAAAG）觀察結果一致（圖7a，b）。重要的是，這種LEF1/TCF OP還抑制關鍵嘧啶合成酶蛋白質(zhì)表達和培養(yǎng)中VCaP細胞生長（圖7b，c）。據(jù)報道，LuCaP 23.1 PDX及其雄激素依賴（去勢抗性）亞系LuCaP 23.1AI是TMPRSS2-ERG基因融合陽性，并且TP53缺失一個等位基因。與LuCaP 23.1AI報道一致，作者證實親代LuCaP 23.1-PDX腫瘤在p53 DBD中也存在C238Y突變（圖7d）。突變型p53 C238Y與CTNNB1啟動子MP53BS結合（圖3j），shRNA敲低該突變型可顯著降低LuCaP 23.1 PDX衍生的類器官（PDXO）中β-Catenin表達（圖7e）。
作者證明，LEF1/TCF OP處理不僅抑制關鍵嘧啶合成酶蛋白表達，而且有抑制LuCaP 23.1 PDXO生長（圖7f–h）。補充dTTP/dCTP幾乎完全逆轉這種作用，但補充dATP/dGTP脫氧核苷三磷酸鹽沒有顯著效果（圖7g，h）。LEF1/TCF OP處理顯著阻礙LuCaP 23.1 PDX腫瘤的生長，而不會導致小鼠體重發(fā)生降低（圖7i–l）。ILEF1/TCF-OP不僅降低LEF/TCF蛋白和嘧啶合成酶如UMPS和RRM1表達水平，而且減少了Ki67陽性細胞數(shù)量（圖7m，n）。這些結果表明，O’PROTAC通過靶向LEF/TCF蛋白抑制β-Catenin和PSG表達，體內(nèi)外有效阻斷了TMPRSS2-ERG和GOF-p53突變陽性PCa生長。
圖7：LEF1/TCF O 'PROTAC抑制PSG表達和TMPRSS2- ERG和突變型p53陽性PCa PDX腫瘤生長
結論
在本研究中，作者確定p53 GOF突變體基因的反式激活功能，并揭示β-Catenin是p53 GOF突變體的轉錄靶基因，也是TMPRSS2-ERG和p53 GOF突變體陽性PCa驅動和治療靶點。
實驗方法
IHC，CRISPR/Cas9，RT-qPCR，Western blot，RNA-seq
參考文獻
Ding D, Blee AM, Zhang J, Pan Y, Becker NA, Maher LJ 3rd, Jimenez R, Wang L, Huang H. Gain-of-function mutant p53 together with ERG proto-oncogene drive prostate cancer by beta-catenin activation and pyrimidine synthesis. Nat Commun. 2023 Aug 3;14(1):4671. doi: 10.1038/s41467-023-40352-4. PMID: 37537199.