YY1液滴復(fù)合物澆灌M2巨噬極化導(dǎo)致前列腺癌進(jìn)展

       腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要是M2極化表型，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子重塑腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)YY1的轉(zhuǎn)基因小鼠證明了YY1在M2巨噬細(xì)胞中的作用，并研究了靶向M2巨噬細(xì)胞YY1治療前列腺癌（PCa）的潛力。此外，YY1通過(guò)調(diào)節(jié)相分離和增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞中IL- 6的轉(zhuǎn)錄、從而重塑腫瘤微環(huán)境。本文于2023年4月發(fā)表在《Journal of Immunotherapy of Cancer》IF: 11.4期刊上。
技術(shù)路線(xiàn)

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、在體內(nèi)YY1過(guò)表達(dá)增加M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和PCa進(jìn)展
       從oe-YY1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中提取腹腔源性巨噬細(xì)胞（PCDM）和骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）。流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，oe- YY1小鼠巨噬細(xì)胞中CD163+ M2的比例明顯增加，而CD86 + M1的比例沒(méi)有明顯增加（圖1A-C）。此外，oe- YY1小鼠的PCa腫瘤負(fù)荷比野生型生長(zhǎng)更快（圖1D）。免疫熒光顯示離體腫瘤中CD163+ M2的顯著更高其oe- YY1小鼠顯著多于野生小鼠（圖1E）。在oe- YY1小鼠中還觀(guān)察到低豐度的CD4和CD8細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖1F）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)oe- YY1小鼠腫瘤中M2細(xì)胞比較更高，CD8毒性T細(xì)胞比例更低（圖1G），且伴隨更低的IFNγ的表達(dá)（圖1H），說(shuō)明過(guò)表達(dá)YY1降低T細(xì)胞的抗腫瘤活性。隨后構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)YY1帶來(lái)的腫瘤生成效果被巨噬細(xì)胞清除劑clodronate liposomes所抑制（圖1I）。將oe- YY1小鼠來(lái)源的骨髓細(xì)胞注射至野生小鼠構(gòu)建嵌合小鼠，然后皮下成瘤，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，YY1過(guò)表達(dá)組小鼠的腫瘤更大（圖1J）。
       隨后將M2巨噬細(xì)胞靶向肽（M2pep）合成至脂質(zhì)體載體上，其轉(zhuǎn)染了YY1 siRNA（M2pep-siYY1）用于靶向M2巨噬細(xì)胞的YY1。M2pep-siYY1和對(duì)照siNC尾靜脈注射至oe- YY1小鼠PCa肺轉(zhuǎn)移小鼠中。結(jié)果顯示M2pep-siYY1組的存活顯著延長(zhǎng)（圖1K），PD-1抑制劑聯(lián)合處理進(jìn)一步顯著延長(zhǎng)小鼠存活并減少轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖1L）。HE和IHC染色顯示M2pep-siYY1和PD-1處理顯著降低肺結(jié)節(jié)并增加CD8和CD4T細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖1M）。總之，以上結(jié)果表明在體內(nèi)YY1過(guò)表達(dá)增加M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和PCa進(jìn)展。

圖1在體內(nèi)YY1過(guò)表達(dá)增加M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和PCa進(jìn)展

2、YY1在人前列腺癌中與CD163 + M2巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)
       為驗(yàn)證YY1和巨噬細(xì)胞的關(guān)系，作者利用IHC檢測(cè)了臨床隊(duì)列PCa和癌旁樣本中YY1和CD163的表達(dá)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)YY1不僅在惡性細(xì)胞上表達(dá)，而且在CD163 +巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤基質(zhì)中，特別是在巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中，也表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平（圖2A）。多色I(xiàn)HC顯示，YY1在CD163巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤機(jī)制中表達(dá)（圖2B-C）。IHC組織芯片結(jié)果顯示YY1得分在腫瘤基質(zhì)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中都顯著高于正常對(duì)照（圖2D-E）。此外，YY1得分越高的腫瘤基質(zhì)中CD163的表達(dá)越高（圖2F）。YY1得分高于不良預(yù)后相關(guān)（圖2G），而YY1和CD163得分都高的患者預(yù)后也更差（圖2H）。綜上所述，通過(guò)對(duì)臨床組織的分析，我們發(fā)現(xiàn)YY1在前列腺腫瘤浸潤(rùn)的M2巨噬細(xì)胞上表達(dá)，并且腫瘤基質(zhì)中YY1的表達(dá)也與CD163 +巨噬細(xì)胞的含量呈正相關(guān)。

圖2 YY1在人前列腺癌中與CD163 + M2巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)

3、YY1通過(guò)IL- 4/STAT6通路上調(diào)，參與M2巨噬細(xì)胞極化
       鑒于上述結(jié)果，作者開(kāi)始檢測(cè)YY1是否調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化。利用THP-1誘導(dǎo)M0和M2巨噬細(xì)胞（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了CD206標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞的比例（圖3B）。巨噬細(xì)胞M2極化也被qRT- PCR和WB證實(shí)，且YY1的表達(dá)在M2巨噬細(xì)胞中顯著高于M0巨噬細(xì)胞（圖3C-D）。因此，成功誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞且YY1在其內(nèi)表達(dá)。
       有趣的是，作者觀(guān)察到Y(jié)Y1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化和M0誘導(dǎo)M2極化的變化類(lèi)似（圖3E-F）。此外，YY1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)M2相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)抑制M1標(biāo)志物表達(dá)（圖3G），并顯著促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的比例（圖3H）。這些結(jié)果表明YY1促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)STAT6是YY1啟動(dòng)子結(jié)合的參與M2極化調(diào)控IL-4信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。雙熒光素酶和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該結(jié)果（圖3I-J）。IL-4誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞中STAT6高度磷酸化。綜上，YY1通過(guò)IL- 4/STAT6通路上調(diào)，參與M2巨噬細(xì)胞極化。

圖3 YY1通過(guò)IL- 4/STAT6通路上調(diào)，參與M2巨噬細(xì)胞極化

4、YY1增加M2巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的前列腺癌惡性表型
       通過(guò)使用M0和M2巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM）共培養(yǎng)PCa細(xì)胞系證實(shí)了M2巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用（圖4A）。隨后，利用YY1過(guò)表達(dá)或抑制的M2巨噬細(xì)胞CM孵育PCa細(xì)胞，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，YY1過(guò)表達(dá)M2的CM顯著促進(jìn)細(xì)胞的遷移，增殖和集落形成，敲低則相反（圖4B-F）。與oe- YY1 PBMC來(lái)源的巨噬細(xì)胞CM培養(yǎng)14天后，PCa患者的人原發(fā)性癌細(xì)胞類(lèi)器官的平均半徑和面積也有所增加（圖4G）。與oe- YY1 M2 RAW264.7細(xì)胞混合的皮下成瘤模型腫瘤的體積和重量都顯著增加（圖4H），肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)也顯著增多（圖4I）。隨后，對(duì)oe- YY1 M2巨噬細(xì)胞CM或?qū)φ誄M處理的LNCaP細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組上調(diào)的基因主要富集至NF-κB和JAK- STAT信號(hào)通路（圖4J-K），且WB證實(shí)了STAT3和p65的高表達(dá)。

圖4 YY1增加M2巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的前列腺癌惡性表型

5、M2巨噬細(xì)胞中YY1上調(diào)IL- 6可增加前列腺癌惡性表型
       作者在oe- YY1和si- YY1 M2巨噬細(xì)胞CM以及nc- YY1 M2 CM中進(jìn)行了27種與腫瘤免疫相關(guān)的細(xì)胞因子液懸芯片檢測(cè)。與對(duì)照組相比，oe- YY1組M2巨噬細(xì)胞CM中IL- 6水平顯著上調(diào)，YY1抑制組IL- 6水平顯著下調(diào)（圖5A-B）。WB證實(shí)YY1過(guò)表達(dá)促進(jìn)IL-6的表達(dá)，敲除YY1則相反（圖5C-E）。因此，接下來(lái)探究IL-6是否是YY1誘導(dǎo)促腫瘤的關(guān)鍵，進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)IL-6（rIL-6）顯著促進(jìn)因YY1敲除引起的腫瘤抑制（圖5F-I），相反加IL-6抗體沉淀IL-6則顯著逆轉(zhuǎn)YY1過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤惡性表型的影響（圖5J-M）。這些結(jié)果表明YY1通過(guò)IL-6促進(jìn)PCa的惡性表型。

圖5 M2巨噬細(xì)胞中YY1上調(diào)IL- 6可增加前列腺癌惡性表型

6、YY1通過(guò)調(diào)節(jié)p300、p65和CEBPB來(lái)調(diào)節(jié)IL- 6的表達(dá)
       為進(jìn)一步研究YY1在巨噬細(xì)胞中調(diào)控IL- 6的詳細(xì)機(jī)制，根據(jù)JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了IL- 6啟動(dòng)子區(qū)域的主要轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，在IL- 6啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了四個(gè)YY1結(jié)合位點(diǎn)(P1-P4)，還發(fā)現(xiàn)YY1、CEBPB和p65的基序位于IL- 6啟動(dòng)子附近（圖6A）。使用生物信息學(xué)分析了這4個(gè)蛋白的互作，發(fā)現(xiàn)YY1與其它三個(gè)蛋白結(jié)合并處于中心地位（圖6B）。ChIP-qPCR結(jié)果證實(shí)YY1、CEBPB和p65都結(jié)合至IL-6的啟動(dòng)子區(qū)域（圖6C-E）。ChIP- on- ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)4個(gè)蛋白都結(jié)合在IL-6啟動(dòng)子的P4區(qū)域（圖6F）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了YY1、CEBPB和p65都結(jié)合IL-6的啟動(dòng)子區(qū)域并增強(qiáng)該區(qū)域的活性（圖6G-J）。這些結(jié)果表明YY1、p300、p65和CEBPB作為上游轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合IL- 6啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)IL- 6轉(zhuǎn)錄。
       從M2巨噬細(xì)胞中提取總蛋白，對(duì)YY1、p65、CEBPB和p300進(jìn)行共免疫沉淀和免疫印跡，以驗(yàn)證它們之間的相互作用（圖6K-M）。p300基因敲除或復(fù)合物抑制劑金絲桃素可抑制它們之間的相互作用（圖6N、O）。此外，金絲桃素不僅減少了M2巨噬細(xì)胞中IL- 6 mRNA的表達(dá)（圖6P），還降低了與M2巨噬細(xì)胞CM孵育的PCa細(xì)胞的增殖和遷移（圖6Q、R）。

圖6 YY1通過(guò)調(diào)節(jié)p300、p65和CEBPB來(lái)調(diào)節(jié)IL- 6的表達(dá)

7、YY1通過(guò)M2特異性增強(qiáng)子促進(jìn)IL- 6轉(zhuǎn)錄
       作者對(duì)PCa的腫瘤組織和癌旁組織的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與前列腺正常組織巨噬細(xì)胞相比，YY1和輔因子CEBPB在PCa巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性均顯著升高，均排在前20位轉(zhuǎn)錄因子列表（圖7A）。對(duì)M2巨噬細(xì)胞和THP- 1細(xì)胞進(jìn)行了H3K27ac和YY1的ChIP- seq，發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)在M2極化過(guò)程中發(fā)生變化的獲得或丟失的增強(qiáng)子（圖7B）。在M2極化過(guò)程中，共有15241個(gè)增強(qiáng)子被鑒定為M2特異性增強(qiáng)子。THP- 1細(xì)胞中M2特異性增強(qiáng)子的H3K27ac信號(hào)較低，M2巨噬細(xì)胞中M2特異性增強(qiáng)子的YY1 ChIP- seq信號(hào)也富集（圖7C）。無(wú)論如何，M2特異性增強(qiáng)子的YY1 ChIP- seq信號(hào)顯著下降，表明YY1在M2巨噬細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。
       為鑒定IL- 6的不同增強(qiáng)子，使用Hi-C數(shù)據(jù)鑒定增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用。發(fā)現(xiàn)M2特異性IL-6增強(qiáng)子與IL- 6啟動(dòng)子直接相互作用（圖7B，D），并且在其周?chē)忻黠@更強(qiáng)的H3K27ac和YY1ChIP- seq 信號(hào)在極化的M2巨噬細(xì)胞中，與THP- 1細(xì)胞比較（圖7C）。為證實(shí)位于Hi- C數(shù)據(jù)中的IL- 6增強(qiáng)子的作用，構(gòu)建一個(gè)熒光素酶基因質(zhì)粒，其中含有四個(gè)片段（E1-4區(qū)）的增強(qiáng)子片段（圖 7E）。然后和過(guò)表達(dá)YY1載體共轉(zhuǎn)染到M2巨噬細(xì)胞中，通過(guò)熒光素酶檢測(cè)和染色體構(gòu)象捕獲（3C）實(shí)驗(yàn)，確定了E1區(qū)（增強(qiáng)子片段的遠(yuǎn)端）是YY1的結(jié)合位點(diǎn)（圖7F-G）。用CRISPR- Cas9敲除M2巨噬細(xì)胞中的E1區(qū)（sg-E1），ELISA和qRT- PCR顯示IL- 6表達(dá)量減少（圖7H-I）。溴域抑制劑JQ1抑制了增強(qiáng)子信號(hào)也下調(diào)了IL- 6的表達(dá)（圖7J）。這些結(jié)果表明這些結(jié)果表明，M2-特異性IL-6增強(qiáng)子對(duì)IL- 6轉(zhuǎn)錄的重要作用。
       接下來(lái)，進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證M2特異性增強(qiáng)子對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化和功能的影響。首先，經(jīng)JQ1處理的巨噬細(xì)胞中ARG-1和IL-10的mRNA表達(dá)量較低，表明JQ1抑制了M2的極化（圖7K）。此外，當(dāng)在DU145細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中加入JQ1時(shí)，與陰性對(duì)照相比，惡性細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制（圖7L）。為精確檢驗(yàn)M2特異性增強(qiáng)子對(duì)M2巨噬細(xì)胞功能的影響，用sg- E1 M2 CM培養(yǎng)DU145細(xì)胞。在sg- E1組中，PCa細(xì)胞的惡性行為降低（圖7M）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小鼠皮下注射腫瘤2周后，連續(xù)腹腔注射JQ1和CPI- 637（分別是針對(duì)BRD4和p300/CBP溴鏈的增強(qiáng)子抑制劑）3周后再收獲腫瘤，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積與陰性對(duì)照組相比明顯縮?。▓D7N）?？傊琘Y1復(fù)合物通過(guò)M2-特異性增強(qiáng)子上調(diào)IL-6，從而促進(jìn)PCa的進(jìn)展。

圖7 YY1通過(guò)M2特異性增強(qiáng)子促進(jìn)IL- 6轉(zhuǎn)錄

8、YY1在M2巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中形成LLPS
       對(duì)YY1進(jìn)行免疫熒光時(shí)，IL- 4刺激的M2巨噬細(xì)胞核內(nèi)液滴數(shù)量較PMA- THP- 1 M0細(xì)胞明顯增加（圖8A），表明YY1可能通過(guò)LLPS形成凝析油。接下來(lái)，根據(jù)PONDR評(píng)分預(yù)測(cè)YY1的大IDRs（圖8B）。通過(guò)熒光顯微鏡，觀(guān)察到LLPS液滴的密度隨YY1- IDR- EGFP蛋白濃度的增加而增加（圖8C），但在使用1,6- 己二醇（1,6- Hex）處理后，液滴密度下降，因?yàn)?,6- Hex 會(huì)破壞介質(zhì)中的弱疏水鍵。在YY1-非-IDR-EGFP細(xì)胞中檢測(cè)不到液滴（圖8C）。
       接著，將YY1- IDR- EGFP、YY1-非 IDR-EGFP 和EGFP標(biāo)記的YY1全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到M2巨噬細(xì)胞中，并在共聚焦熒光顯微鏡下觀(guān)察活細(xì)胞。與YY1-非IDR- EGFP組相比，YY1- EGFP組和YY1-IDR-EGFP組的液滴數(shù)量明顯增加（圖8D）。此外，還在一些液滴中觀(guān)察到融合和裂解（圖8E），并且在光漂白目標(biāo)病灶后，核穿刺點(diǎn)的熒光強(qiáng)度可以恢復(fù)（圖8F），這表明巨噬細(xì)胞中的核凝聚物是由LLPS形成的。為進(jìn)一步明確YY1液滴在巨噬細(xì)胞中的位置以及IDR區(qū)在液滴形成中的作用，在細(xì)胞固定后染色DAPI，并通過(guò)全長(zhǎng)YY1 CRISPR/Cas9敲除YY1-IDR區(qū)，以及在M2巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)非IDR區(qū)（sg- YY1- IDR）。發(fā)現(xiàn)YY1液滴主要位于M2巨噬細(xì)胞核內(nèi)，YY1- IDR敲除后液滴數(shù)量顯著減少（圖8G,H）。
       此外，YY1/p300/p65/CEBPB 復(fù)合物中預(yù)測(cè)的YY1結(jié)合位點(diǎn)位于YY1- IDR 段（圖6B）。用EGFP抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果表明在M2巨噬細(xì)胞中p65、p300和CEBPB與YY1- IDR- EGFP相互作用（圖8I）。還觀(guān)察到Y(jié)Y1的LLPS凝聚物與p300、p65和CEBPB的共定位（圖8J）。同時(shí)，在抑制p300、p65和CEBPB表達(dá)的siRNA以及p300/p65復(fù)合物抑制劑金絲桃素的干預(yù)下，M2巨噬細(xì)胞中的YY1凝聚物被化解（圖8K）。簡(jiǎn)而言之，這些結(jié)果表明YY1- IDR區(qū)段在YY1 LLPS中的關(guān)鍵作用以及YY1/p300/p65/CEBPB復(fù)合物促進(jìn)了在M2巨噬細(xì)胞中形成YY1介導(dǎo)的LLPS。此外，與陰性對(duì)照相比，用1,6-Hex預(yù)處理或轉(zhuǎn)染sg-YY1-IDR后，IL- 4-刺激的巨噬細(xì)胞中M2標(biāo)記（ARG-1和IL-10）和IL- 6的相對(duì)表達(dá)明顯降低（圖8L、M）。此外，敲除YY1復(fù)合體中的輔因子也降低了ARG- 1和IL- 10的表達(dá)（圖8N）?？傊?，YY1復(fù)合物在M2極化過(guò)程中形成了LLPS并且YY1介導(dǎo)的LLPS上調(diào)了M2巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。

圖8在M2巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中，YY1形成液-液相分離

實(shí)驗(yàn)方法
臨床組織樣本采集，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，CRISPR-Cas9敲除技術(shù)，RT-qPCR，流式細(xì)胞術(shù)，WB，熒光素酶實(shí)驗(yàn)，ChIP，ELISA，RNA測(cè)序，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建，單細(xì)胞測(cè)序，相分離液滴實(shí)驗(yàn)，光漂白后熒光恢復(fù)（FRAP）試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Chen S, Lu K, Hou Y, You Z, Shu C, Wei X, Wu T, Shi N, Zhang G, Wu J, Chen S, Zhang L, Li W, Zhang D, Ju S, Chen M, Xu B. YY1 complex in M2 macrophage promotes prostate cancer progression by upregulating IL-6. J Immunother Cancer. 2023 Apr;11(4):e006020. doi: 10.1136/jitc-2022-006020.