化療后存活的癌細(xì)胞更易衰老和轉(zhuǎn)移？
轉(zhuǎn)移是鼻咽癌（NPC）治療失敗的主要原因。作者的III期臨床試驗顯示吉西他濱和順鉑誘導(dǎo)化療可以消除局部區(qū)域晚期鼻咽癌患者的微轉(zhuǎn)移并延長生存期。然而，化療耐藥患者屈服于轉(zhuǎn)移，確切的潛在機(jī)制尚不清楚。新的研究表明，化療引起的DNA損傷不僅會導(dǎo)致細(xì)胞毒性死亡，還會引發(fā)原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞衰老。衰老是一種多方面的狀態(tài)，細(xì)胞在這種狀態(tài)下細(xì)胞周期停滯，并對腫瘤的發(fā)展起抑制或促進(jìn)作用。最近的發(fā)現(xiàn)表明，化療誘導(dǎo)的衰老可通過腫瘤細(xì)胞獲得的衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的有害作用促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，抑制SASP的有害作用可能有助于預(yù)防化療后衰老腫瘤的轉(zhuǎn)移。
促炎細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的分泌是SASP的主要特征。核因子κB（NF-κB）是參與SASP生成的關(guān)鍵分子模塊。累積的基因組研究報道，在鼻咽癌中，身體變化和EB病毒（EBV）協(xié)同維持炎性NF-κB激活。然而，個體NPC患者的軀體變異率相對較低，維持組成型NF-κB激活的內(nèi)源性分子尚不清楚。環(huán)狀RNA（circRNAs）的特征在于它們的結(jié)構(gòu)共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，并且在真核生物中廣泛存在。它們已被證明在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)。最近的研究表明，circRNAs在NF-κB信號調(diào)控中起著重要作用。然而，有關(guān)circRNAs參與鼻咽癌中SASP相關(guān)的NF-κB活化的研究尚不清楚。
在這項研究中，利用全球表達(dá)譜，作者確定了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中與衰老相關(guān)的表型，并將CircWDR37作為關(guān)鍵的參與調(diào)節(jié)因子。CircWDR37基因缺失使鼻咽癌細(xì)胞對化療誘導(dǎo)的衰老敏感，但抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上，CircWDR37與雙鏈核糖核酸激活的蛋白激酶R相互作用，促進(jìn)其同源二聚化和磷酸化，并激活NF-κB信號，誘導(dǎo)SASP組分基因轉(zhuǎn)錄。臨床上，CircWDR37低表達(dá)的鼻咽癌患者可從誘導(dǎo)化療中獲益。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)揭示了化療誘導(dǎo)衰老和轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，并為鼻咽癌提供了有前景的治療靶點。本文于2023年3月發(fā)表在《Advanced Science》IF: 15.1期刊上。
主要技術(shù)路線
1、鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的衰老相關(guān)表型特征
為了探索衰老對腫瘤轉(zhuǎn)移的貢獻(xiàn)，作者重新分析了作者先前發(fā)表的微陣列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自局部區(qū)域晚期鼻咽癌組織（n=24）和沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（n=24）的根治性化療后的鼻咽癌組織。基因集濃縮分析（GSEA）顯示，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，衰老和SASP相關(guān)信號顯著豐富（圖1a）。在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的137個鼻咽癌組織中差異表達(dá)的mRNAs中（圖1a），有22個與衰老和SASP相關(guān)，其中90.9%在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中顯著上調(diào)（圖1b）。上調(diào)的SASP信號包括那些編碼生長因子和趨化因子的信號，如C-X-C基序趨化因子配體10（cxcl 10；倍數(shù)變化= 1.92847，p = 0.02894）和C-X-C基序趨化因子配體16（cxcl 16；倍數(shù)變化= 1.80415，p = 0.00187）?；?2個信號表達(dá)的主成分分析（PCA）揭示了有和沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC患者之間的區(qū)別。
為了驗證NPC轉(zhuǎn)移的表達(dá)模式，作者采用了一對具有高（S18）和低（S26）轉(zhuǎn)移能力的NPC細(xì)胞模型進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。正如預(yù)期的那樣，S18 NPC細(xì)胞顯示出類似的衰老相關(guān)和SASP相關(guān)信號豐度的表達(dá)改變（圖1b）。綜上所述，這些結(jié)果表明患有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC患者表現(xiàn)出衰老特征，并且參與衰老的基因可能有助于NPC轉(zhuǎn)移。
2、CircWDR37是NPC衰老和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
新的證據(jù)表明，circRNAs通過直接或間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在腫瘤進(jìn)展和治療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了研究circRNA是否參與鼻咽癌的衰老相關(guān)轉(zhuǎn)移，作者分析了S18和S26細(xì)胞系中circRNA的表達(dá)譜。在高轉(zhuǎn)移潛能的S18細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的56個CircRNA中，有48個在CircBase數(shù)據(jù)庫中被注釋，40個在腫瘤特異性CircRNA數(shù)據(jù)庫（CSCD）中通過4種不同的算法進(jìn)一步驗證。值得注意的是，hSA_CIRC_0000206，被稱為CircWDR37，在CircRNA候選序列中顯示了最高的CircRNA/宿主線性mRNA表達(dá)比率，這表明CircWDR37相對于其線性WDR37mRNA的表達(dá)水平較高（圖1c）。
CircWDR37是WDR37基因第6-9外顯子的頭部到尾部剪接；Sanger測序證實了連接位置（圖1D）。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證circWDR37在鼻咽癌細(xì)胞（S18、S26、HONE1和HK1）中的表達(dá)。結(jié)果證實，與低轉(zhuǎn)移能力的S26細(xì)胞相比，circWDR37在高轉(zhuǎn)移能力的S18細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)（p < 0.05，圖1e）。使用反向轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)引物，circWDR37可以在cDNA中用不同的引物擴(kuò)增，但不能在相應(yīng)的基因組DNA中擴(kuò)增（圖1f）。經(jīng)Dactinomycin處理后，CircWDR37表達(dá)的半衰期明顯長于線性WDR37表達(dá)的半衰期（p<0.05，圖1g；圖S1d，支持信息）。對RNase R消化的抗性進(jìn)一步證實了CircWDR37的閉環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1h）。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離以及熒光原位雜交（FISH）分析表明，circWDR37主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1i，j）。這些數(shù)據(jù)表明circWDR37在具有高轉(zhuǎn)移潛力的鼻咽癌細(xì)胞中是一個真正上調(diào)的circRNA。
為了研究CircWDR37的功能，作者首先設(shè)計了針對CircWDR37的反向剪接位點的短干擾RNA（SiRNA），在不改變線性WDR37 mRNA表達(dá)的情況下特異性地下調(diào)CircWDR37的表達(dá)（p<0.05）。然后進(jìn)行RNA測序（RNA-seq）分析，檢測circWDR37敲低和不敲低的S18細(xì)胞的表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circWDR37敲低后，S18細(xì)胞中有267個基因上調(diào)，256個基因下調(diào)。GSEA分析顯示，circWDR37表達(dá)后，與轉(zhuǎn)移、SASP和鼻咽癌相關(guān)的基因特征顯著富集（FDR < 0.05，圖1k）。此外，KEGG分析表明，細(xì)胞衰老途徑中差異表達(dá)基因顯著富集（圖1l）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circWDR37是與鼻咽癌衰老和轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵circRNA。
圖1 CircWDR37是NPC衰老和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
3、circWDR37缺陷抑制化療誘導(dǎo)的鼻咽癌衰老細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移
為了驗證circWDR37在NPC中的功能，作者進(jìn)行了體外Transwell和衰老實驗。與GSEA結(jié)果一致，與相應(yīng)的對照相比，circWDR37敲低顯著抑制了NPC細(xì)胞系的遷移和侵襲能力（p < 0.05，圖2a），而circWDR37過表達(dá)顯著促進(jìn)了這些表型（p < 0.05）。接下來，作者試圖確定circWDR37是否影響衰老細(xì)胞的遷移和侵襲性。由于順鉑和吉西他濱是NPC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案并且能夠誘導(dǎo)衰老，作者用順鉑或吉西他濱處理鼻咽癌細(xì)胞以誘導(dǎo)衰老，并進(jìn)行β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，這是一種標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞衰老標(biāo)記。結(jié)果顯示circWDR37缺失顯著降低了用順鉑或吉西他濱治療的NPC細(xì)胞中的細(xì)胞生長（p < 0.05，圖2b）并增加了SA-β-gal的表達(dá)（圖2c）。此外，在用順鉑和吉西他濱治療的NPC細(xì)胞中，circWDR37敲除顯著增強(qiáng)了p16INK4a（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2a，CDKN2A）的表達(dá)，p16INK4A是細(xì)胞衰老的最具代表性的標(biāo)志（圖2d）。總之，這些數(shù)據(jù)表明circWDR37下調(diào)增強(qiáng)了NPC順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
盡管最近的研究表明化療誘導(dǎo)的衰老通過SASP促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但作者驚訝地發(fā)現(xiàn)，在順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)衰老后，circWDR37敲低顯著抑制了NPC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（p < 0.05，圖2e）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明circWDR37缺陷促進(jìn)了化療誘導(dǎo)的衰老，但削弱了衰老NPC細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移能力。
圖2 CircWDR37缺陷抑制化療誘導(dǎo)的衰老NPC細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移
4、CircWDR37刺激NF-κB激活以促進(jìn)化療誘導(dǎo)的促炎SASP基因轉(zhuǎn)錄
接下來作者闡明了circWDR37調(diào)節(jié)NPC衰老和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。RNA-seq轉(zhuǎn)錄組圖譜的GSEA顯示，與NF-κB信號通路相關(guān)的基因集與circWDR37表達(dá)顯著正相關(guān)（FDR < 0.05，圖3a）。發(fā)現(xiàn)circWDR37敲低后，一組18個NF-κB靶基因在NPC細(xì)胞中下調(diào)。RT-qPCR 分析驗證，與siSCR對照相比，circWDR37敲低顯著降低了HONE1、S18和HK1細(xì)胞中10個NF-κB靶基因的表達(dá)（p < 0.05，圖3b）。雙熒光素酶測定證實，circWDR37缺失顯著抑制NPC細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性（p < 0.05，圖3c）。
上述下調(diào)的基因包括多種細(xì)胞因子和趨化因子編碼基因，例如白細(xì)胞介素1α（IL1A）、白細(xì)胞介素1β（IL1β）、白細(xì)胞介素8（IL8，也稱為CXCL8）和C-C基序趨化因子配體20（CCL20），都是關(guān)鍵的促炎SASP因子?？紤]到SASP是衰老最重要的特征，對于衰老促進(jìn)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，作者進(jìn)一步評估了circWDR37是否影響化療誘導(dǎo)后的SASP。結(jié)果表明，circWDR37缺陷確實顯著抑制了順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的SASP獲得，如IL1A、IL1B、IL8和CCL20豐度降低所示（圖3d）。作者還注意到，在敲除circWDR37的NPC細(xì)胞中，化療后NF-κB靶基因Cyclin D1（CCND1）的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著降低（圖3d，e）。CCND1是一種p16抑制劑，可激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6），通過G1/S期檢查點誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展以克服細(xì)胞周期停滯，這可能解釋了circWDR37缺陷通過下調(diào)Cyclin D1表達(dá)使NPC細(xì)胞對順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的衰老敏感的機(jī)制。這些結(jié)果表明circWDR37缺失抑制化療誘導(dǎo)的促炎性SASP。
I-kappaB激酶α/β（IKKα/β）、NF-κB抑制因子α（IκBβ）和RELA（又稱p65）的磷酸化是經(jīng)典的NF-κB信號激活的關(guān)鍵步驟。作者發(fā)現(xiàn)，CircWDR37基因敲除顯著抑制了IKKα/β、IκBβ和p65的磷酸化，而不影響它們的總蛋白表達(dá)（圖3f），而CircWDR37過表達(dá)顯著增強(qiáng)了它們的磷酸化。核因子NF-κB p50/p65異源二聚體的磷酸化和移位有助于靶基因的轉(zhuǎn)錄。作者發(fā)現(xiàn)，CircWDR37基因敲除后，磷酸化p65的核位置顯著減少（圖3G），而CircWDR37過表達(dá)則起到相反的作用。免疫熒光試驗也證實了circWDR37敲除后p65的核轉(zhuǎn)位減少（p < 0.05，圖3h）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明circWDR37激活NF-κB信號以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中化療誘導(dǎo)的促炎性SASP成分基因轉(zhuǎn)錄。
圖3 CircWDR37刺激NF-κB介導(dǎo)的化療誘導(dǎo)的促炎性SASP基因轉(zhuǎn)錄
5、CircWDR37誘導(dǎo)PKR同二聚化和磷酸化
為了研究circWDR37激活NF-κB途徑的機(jī)制，作者使用生物素標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄的circWDR37進(jìn)行了RNA pull-down分析，然后進(jìn)行了質(zhì)譜分析。在pull-down的蛋白質(zhì)中，circWDR37被發(fā)現(xiàn)與雙鏈RNA激活的蛋白激酶R（PKR）相互作用，PKR是一種與NF-κB激活相關(guān)的雙鏈RNA傳感器（圖4a）。RNApull-down試驗后的Western印跡分析進(jìn)一步證實，與反義RNA相比，生物素標(biāo)記的circWDR37與鼻咽癌細(xì)胞中的PKR特異性結(jié)合（圖4b）。用抗PKR抗體進(jìn)行的RNA免疫沉淀（RIP）分析顯示circWDR37顯著富集（p < 0.05，圖4c）。一致地，免疫熒光測定證明circWDR37在細(xì)胞質(zhì)中與PKR共定位（圖4d）。接下來，為了確定PKR與circWDR37結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，作者產(chǎn)生了一系列PKR缺失突變體并進(jìn)行RIP分析。隨后的RT-qPCR分析顯示，PKR N末端的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dsRBMs）與全長PKR結(jié)合circWDR37的效率一樣高（p < 0.05，圖4e），這表明dsRBMs結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑KR結(jié)合circWDR37是至關(guān)重要的。
已經(jīng)確定PKR可以在感染和腫瘤促進(jìn)炎癥過程中啟動NF-κB激活，作者進(jìn)一步評估了PKR是否誘導(dǎo)NPC中NFκB級聯(lián)的激活。結(jié)果表明PKR敲除顯著抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化（圖4f）。此外，p65的核轉(zhuǎn)位在PKR缺陷下減弱（圖4g，h），這與circWDR37敲除的影響一致。鑒于NF-κB級聯(lián)的激活是由磷酸化的PKR誘導(dǎo)的，作者進(jìn)一步評估circWDR37對NF-κB激活的影響是否依賴于PKR的磷酸化。值得注意的是，PKR在Thr446和Thr451這兩個對PKR激活至關(guān)重要的磷酸化位點的磷酸化被circWDR37沉默所抑制（圖4i）。相反，強(qiáng)制circWDR37表達(dá)能夠誘導(dǎo)PKR磷酸化，這表明circWDR37通過結(jié)合PKR并誘導(dǎo)其磷酸化來激活NF-κB途徑。
作者接下來探索circWDR37如何啟動PKR磷酸化和激活。據(jù)報道，TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）和PKR蛋白激活因子（PACT）是兩種雙鏈RNA結(jié)合蛋白，對PKR發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。因此，作者想知道circWDR37是否影響了PKR和PACT/TRBP之間的互動。然而，在circWDR37缺失后，PKR與PACT或TRBP的結(jié)合沒有明顯變化（圖4j）。最近的證據(jù)表明，長鏈非編碼RNA在雙鏈RBM上與PKR結(jié)合，誘導(dǎo)PKR單體形成同質(zhì)體并隨后磷酸化。然后，作者進(jìn)一步研究了circWDR37是否修飾PKR同型二聚化的形成。結(jié)果顯示，circWDR37沉默減少了HA與flag標(biāo)記的PKR之間的相互作用（圖4k），這表明circWDR37誘導(dǎo)了PKR的同二聚化。綜上所述，這些結(jié)果表明circWDR37在dsRBMs結(jié)構(gòu)域與PKR結(jié)合，誘導(dǎo)PKR二聚體化和磷酸化，從而激活NF-κB信號傳導(dǎo)（圖4l）。
圖4 CircWDR37誘導(dǎo)PKR二聚體化和磷酸化
6、CircWDR37在非依賴于PKR激酶活性下促進(jìn)PKR刺激的IKKβ磷酸化
為了闡明circWDR37對PKR啟動的NF-κB激活的調(diào)節(jié)作用，作者首先進(jìn)行了共免疫沉淀（co-IP）分析來評估circWDR37是否與NF-κB蛋白結(jié)合。然而，circWDR37和IKKβ、p65或IκBα之間沒有觀察到直接的相互作用。然后，作者評估circWDR37是否影響PKR與NF-κB成分的結(jié)合。首先，co-IP分析證明異位表達(dá)的PKR與IKKβ相互作用（圖5a），谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）pull-down分析證實了它們的直接相互作用（圖5b）。為了探索PKR - IKK/β相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，作者生成了IKKβ截斷突變體，包括IKKβ-1（僅具有n端激酶結(jié)構(gòu)域（KD））、IKKβ-2,4（具有泛素化類域（ULD）和NEM結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD））、IKKβ-2,3（ULD與二聚化所需的非旋支架/二聚化結(jié)構(gòu)域（SDD）結(jié)合）和IKKβ-3,4（SDD與NBD結(jié)合）（圖5c）。進(jìn)一步的co-IP分析揭示了IKKβ-2,4和IKKβ-3,4突變體，但是沒有NBD結(jié)構(gòu)域的突變體與PKR的結(jié)合效率不如全長的IKKβ（圖5d），并且PKR的KD結(jié)構(gòu)域與IKKβ特異性相互作用（圖5e）。這些結(jié)果表明，IKKβ和PKR之間的相互作用特別依賴于IKKβ的NBD結(jié)構(gòu)域和PKR的KD結(jié)構(gòu)域。
接下來，作者評估了circWDR37是否促進(jìn)了PKR和IKKβ之間的相互作用。co-IP分析顯示，在circWDR37過表達(dá)后，PKR與IKKβ的結(jié)合增強(qiáng)（圖5f）。盡管先前的研究報道PKR通過磷酸化IKKβ啟動NF-κB激活，但是調(diào)節(jié)機(jī)制是否依賴于PKR激酶活性仍不清楚。使用體外激酶試驗，作者發(fā)現(xiàn)純化的GST標(biāo)記的PKR以劑量依賴的方式直接磷酸化GST-真核起始因子2（eIF2α），一種公認(rèn)的PKR底物，但不磷酸化GST-IKKβ。綜上所述，上述發(fā)現(xiàn)表明circWDR37促進(jìn)PKR與IKK-β的結(jié)合，從而以獨立于PKR激酶活性的方式誘導(dǎo)IKK-β磷酸化。
7、CircWDR37-磷酸化PKR與抑制性IκB結(jié)合并釋放p65
P65與p50的復(fù)合體是含量最豐富的NF-κB蛋白。之前的一項研究報告稱PKR并不直接相互作用或磷酸化p65。令人驚訝的是，作者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞中PKR缺失后p65磷酸化減弱（圖4f）。此外，co-IP實驗顯示PKR與p65結(jié)合（圖5g），GST pull-down實驗進(jìn)一步證實了這一點（圖5h）。為了研究與PKR-p65結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，作者根據(jù)p65的功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了p65截斷突變體：Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）（圖5i）。co-IP分析表明，p65中的RHD結(jié)構(gòu)域與PKR的結(jié)合效率與p65的全長一樣，而TAD結(jié)構(gòu)域則沒有p65的結(jié)合能力（圖5j）。此外，KD結(jié)構(gòu)域，而不是PKR中的dsRBM與p65特異性相互作用（圖5k）。
考慮到RHD結(jié)構(gòu)域是p65與抑制蛋白IκBα結(jié)合所必需的，作者探討了PKR對p65與IκBα相互作用的影響。強(qiáng)制表達(dá)PKR顯著減少了IκBα與p65的結(jié)合（圖51），表明PKR占據(jù)了p65上的IκBα結(jié)合位點。此外，作者還發(fā)現(xiàn)PKR與IκBα在物理上相互作用，這一作用因異位CircWDR37表達(dá)而增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)與先前的一項研究相一致，該研究表明PKR與IκBα相互作用并被磷酸化。接下來，作者研究了WDR37是否影響PKR和IκBα結(jié)合p65的競爭。外源CircWDR37的增加促進(jìn)了PKR/IκBα復(fù)合體的形成（圖5m），并以劑量依賴的方式減少P65/IκBα復(fù)合體的形成（圖5n），這提示CircWDR37促進(jìn)PKR與IκBα的結(jié)合，并從抑制性的IκBα蛋白中釋放p65。
由于CircWDR37啟動了PKR的磷酸化并觸發(fā)了NF-κB信號，作者進(jìn)一步評估了CircWDR37誘導(dǎo)的PKR磷酸化在PKR/IκBα相互作用中的作用。作者用天冬氨酸（T446DT451D）取代Thr446和Thr451殘基，構(gòu)建了突變的PKR。體外純化的PKRT446DT451D蛋白與迫使其去磷酸化的小牛腸道堿性磷脂預(yù)先孵育，然后進(jìn)行GST pull-down實驗。結(jié)果表明，PKR去磷酸化減少了PKR與IκBα的相互作用，提示PKR與IκBα的結(jié)合能力依賴于PKR的磷酸化（圖5o）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明circWDR37磷酸化的PKR結(jié)合并從p65中分離IκBα，從而釋放p65轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中（圖5p）。
圖5 CircWDR37促進(jìn)PKR與IKKβ的結(jié)合，并促進(jìn)PKR與IκB 的相互作用，從而從抑制性IκBκ中釋放p65
8、PKR是circWDR37的功能性中介
PKR在鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和衰老中的作用尚不清楚。接下來，作者研究了PKR在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。與circWDR37缺失的影響類似，PKR敲低顯著抑制鼻鼻癌細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成（p < 0.05，圖6a）。此外，順鉑或吉西他濱治療后，PKR缺失顯著增加SA-β-gal染色的鼻咽癌細(xì)胞（p < 0.05，圖6b）。在順鉑或吉西他濱處理的鼻咽癌細(xì)胞中，衰老標(biāo)記物p16INK4a的表達(dá)持續(xù)增加，而細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)因PKR缺失而降低（圖6c）。這些結(jié)果證實了PKR缺失對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，以及對細(xì)胞衰老的促進(jìn)作用。此外，PKR耗竭后化療誘導(dǎo)的衰老鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著受損（p<0.05，圖6d）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，PKR沉默的作用類似于circWDR37基因敲除，促進(jìn)了化療誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的衰老，并限制了它們在體外的遷移和侵襲。
為了證實circWDR37通過激活PKR來對抗化療誘導(dǎo)的衰老和促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，作者用circWDR37-siRNA和PKRT446DT451D過表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞。在T446和T451殘基持續(xù)的PKR磷酸化顯著逆轉(zhuǎn)了circWDR37缺失的鼻咽癌細(xì)胞減弱的遷移和侵襲（p<0.05，圖6e）。此外，異位PKRT446DT451D表達(dá)顯著抑制了circWDR37敲除誘導(dǎo)的增強(qiáng)的化療誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（p < 0.05，圖6f）。雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊蚍治龊偷鞍踪|(zhì)印跡顯示，外源PKRT446DT451D操作顯著恢復(fù)了circWDR37缺失抑制的NFκB激活（圖6g，h）。此外，PKRT446DT451D的過表達(dá)取消了circWDR37基因敲除細(xì)胞中衰老標(biāo)記物p16INK4a表達(dá)的增加和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的降低（圖6h）。這些結(jié)果表明，PKR的激活在circWDR37介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的抗衰老、遷移和侵襲過程中起關(guān)鍵作用。
圖6 PKR是CircWDR37的功能調(diào)節(jié)因子
9、CircWDR37缺失損害NPC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移
為了在體內(nèi)驗證circWDR37的功能，作者首先建立了一個腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。將穩(wěn)定的WDR37基因敲除的S18細(xì)胞或雜亂對照的S18細(xì)胞移植到裸鼠的足墊中。4周后，切除足墊和腹股溝淋巴結(jié)上的原發(fā)腫瘤（圖7a）。H&E染色顯示，在WDR37基因敲除組，足底腫瘤侵襲性較弱，對皮膚和肌肉的侵襲相對較少（圖7b）。根據(jù)泛角蛋白染色的結(jié)果，circWDR37缺失顯著減少了腫瘤體積（p<0.05，圖7c，d）和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（p<0.05，圖7e，f）。接下來，將穩(wěn)定的WDR37缺失的S18細(xì)胞或雜亂對照的S18細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，建立肺轉(zhuǎn)移定植模型。如圖7g，h所示，WDR37缺失可顯著減少體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)（p<0.05）。此外，H&E染色顯示，抑制circWDR37可顯著減少和縮小肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（p<0.05，圖7i，j）?？傊?，這些結(jié)果證實circWDR37敲低抑制了體內(nèi)NPC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
作者進(jìn)一步使用腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型研究circWDR37在順鉑和吉西他濱治療后對NPC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。在腫瘤形成后，每隔3天給小鼠腹腔注射順鉑（5mg·kg-1）和吉西他濱（50mg·kg-1）。與sh-載體對照組相比，circWDR37基因敲除抑制了順鉑和吉西他濱治療后足墊腫瘤對皮膚和肌肉的侵襲（圖7K）。此外，經(jīng)順鉑和吉西他濱治療后，WDR37缺失組的腹股溝淋巴結(jié)體積和轉(zhuǎn)移率顯著降低（p<0.05，圖7l-o）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，具有CircWDR37基因敲除的鼻咽癌細(xì)胞可以從順鉑和吉西他濱的治療中受益于轉(zhuǎn)移控制。
圖7 CircWDR37缺陷對鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響
10、CircWDR37低表達(dá)與鼻咽癌患者良好的預(yù)后和較好的誘導(dǎo)化療療效相關(guān)
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，作者的下一個目標(biāo)是利用RT-qPCR來驗證circWDR37在140例鼻咽癌組織中表達(dá)的臨床潛力。根據(jù)X-tile分析將患者分為WDR37高表達(dá)組（n=101）和低表達(dá)組（n=39）。生存分析顯示，circWDR37高表達(dá)患者的總生存率、無瘤生存期（DFS）和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期（DMFS）顯著低于circWDR37低表達(dá)患者（p<0.05，圖8a-c）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WDR37表達(dá)水平、N分期和治療前血漿EBV DNA是影響鼻咽癌預(yù)后的獨立因素（p<0.05，圖8d-f）。這些結(jié)果表明，在鼻咽癌患者中，circWDR37的高表達(dá)提示預(yù)后不良，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。
利用上述隊列中63名患者在放療前接受吉西他濱或順鉑誘導(dǎo)化療的優(yōu)勢，作者評估了circWDR37表達(dá)與患者對順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)化療的反應(yīng)之間的關(guān)系?；颊咴谡T導(dǎo)化療前后進(jìn)行了磁共振成像（圖8G）。在大多數(shù)患者應(yīng)答者中（40/56），circWDR37的表達(dá)水平較低（圖8h），與circWDR37高表達(dá)的患者相比，他們的DFS和DMF更好（p<0.05，圖8i，j），這表明circWDR37低表達(dá)的患者在順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)化療中獲得了更好的療效和生存。綜上所述，這些結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)一致，該實驗數(shù)據(jù)表明，在鼻咽癌患者中，circWDR37的低表達(dá)與順鉑或吉西他濱化療的反應(yīng)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險的降低之間存在關(guān)聯(lián)。
圖8 CircWDR37的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后和對誘導(dǎo)化療缺乏反應(yīng)性有關(guān)
總之，此研究揭示了circWDR37激活的PKR通過NF-κB觸發(fā)的SASP成分基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)鼻咽癌中化療誘導(dǎo)的衰老腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。由于circWDR37的缺失使腫瘤細(xì)胞對化療引起的衰老敏感、減少轉(zhuǎn)移、增加化療的益處，circWDR37可能成為預(yù)測化療療效的潛在生物標(biāo)志物和鼻咽癌有吸引力的治療靶點。
實驗方法
基因芯片測序分析、RNA提取和RT-qPCR、RNA FISH -免疫熒光顯微鏡、RNA免疫沉淀反應(yīng)、RNA pull down試驗
參考文獻(xiàn)
Q. Li, Y.H. Zhao, C. Xu,et al. Chemotherapy-Induced Senescence Reprogramming Promotes Nasopharyngeal Carcinoma Metastasis by circRNA-Mediated PKR Activation, Advanced Science, 2023, 10(8). doi: 10.1002/advs.202205668.