單細(xì)胞測序聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示HNSCC新型腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群

       盡管免疫療法可以延長一些頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者的生存期，但應(yīng)答效率仍然很低。闡明腫瘤微環(huán)境（TME）中調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞浸潤和功能障礙的關(guān)鍵機(jī)制有助于最大限度地提高免疫療法治療HNSCC的益處。在這里，作者對具有不同免疫浸潤的HNSCC標(biāo)本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，并對五對腫瘤和鄰近組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq），揭示了與CD8+T細(xì)胞浸潤限制和功能障礙相關(guān)的特定腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAF亞群。這些CAFs表現(xiàn)出CXCL（CXCL9、CXCL10、CXCL12）和主要組織相容性復(fù)合體I類（MHC-I）的高表達(dá)，以及半乳糖凝集素-9（Gal-9）的富集。MHC-I^hiGal-9+CAF細(xì)胞比例與CD8+T細(xì)胞TCF1+GZMK+亞群豐度呈負(fù)相關(guān)。CAFs中的 Gal-9誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能障礙，并降低腫瘤浸潤TCF1+CD8+T細(xì)胞比例。該研究于2023年11月發(fā)表在《cancer research》，IF 11.2。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1.腫瘤間質(zhì)中存在CD8+T細(xì)胞

       作者首先通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HNSCC和正常樣本中CD3E和CD8A的表達(dá)來研究CD8+T細(xì)胞浸潤（圖1A）。腫瘤組織中CD3E和CD8A的TPM值較高，表明HNSCC腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞浸潤增加。此外，在HPV陽性的HNSCC中，CD3E和CD8A轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于HPV陰性的HNSCC（圖1A），這表明CD8+T細(xì)胞浸潤更高。為準(zhǔn)確表征HNSCC中CD8+T細(xì)胞的空間分布，通過免疫組織化學(xué)（IHC）評估具有不同免疫亞型的HNSCC患者組織的CD8α染色（圖1B）。免疫浸潤類型也通過CD4/CD20分析確定。為比較腫瘤和鄰近正常組織，特別選擇了包含這兩種組織類型的切片。在所有三種免疫浸潤類型中（浸潤型，沙漠型，排斥型），淋巴細(xì)胞浸潤在浸潤邊緣的纖維化區(qū)域受到限制（圖1B）。在免疫浸潤腫瘤的腫瘤底部中，一些CD8α+細(xì)胞在腫瘤巢中浸潤，盡管CD8α＋細(xì)胞更喜歡纖維化區(qū)域（圖1B左）。對于免疫沙漠型腫瘤，在腫瘤侵襲邊緣的纖維化區(qū)域也檢測到大量的CD8α+細(xì)胞，正如預(yù)期的那樣，在腫瘤底部發(fā)現(xiàn)的CD8α+細(xì)胞很少（圖1B中間）。有趣的是，在免疫排斥型腫瘤的纖維化區(qū)域中有大量的CD8α+細(xì)胞，很少有CD8α＋細(xì)胞浸潤到腫瘤巢中（圖1B右）。這些結(jié)果表明，大多數(shù)CD8+T細(xì)胞局限于間質(zhì)，而不是浸潤于腫瘤巢中。

       為進(jìn)一步探索限制CD8+T細(xì)胞浸潤的因素，作者對三種免疫類型的HNSCC組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序。這些組織來自相同的患者，但不同的樣本用于確定圖1B中的“免疫亞型”。用H&E染色處理標(biāo)本（圖1C），將10x Visium捕獲的所有三個(gè)標(biāo)本的spots分為10個(gè)簇，并與H&E圖像對齊（圖1D-G）。正如預(yù)期的那樣，通過淋巴細(xì)胞相關(guān)基因的空間表達(dá)證實(shí)HNSCC的三種免疫類型由多個(gè)spots簇組成，并且在這些標(biāo)本中表現(xiàn)出異質(zhì)性。當(dāng)浸潤型樣本和沙漠型樣本比較時(shí)，沙漠型樣本僅具有簇5和簇8的spots，排斥型樣本僅具有聚類4和簇9的spots（圖1H）。簇4是由肌肉細(xì)胞組成的簇（圖1D）。根據(jù)H&E圖像上簇的排列，高表達(dá)COL11A1、GRP、HOXCB2、BMP8A 和 NKD1的簇9（圖1I），主要由腫瘤巢周圍的成纖維細(xì)胞組成（圖1D）。最近，John Grout等人發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)先選擇XI膠原蛋白和XII膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重編程，α-SMA+CAF在人類肺部腫瘤的T細(xì)胞邊緣化中發(fā)揮重要作用。在此，作者探討了COL11A1、COL11A2和COL12A1在三種免疫類型中的表達(dá)和空間分布。一致地，排斥型標(biāo)本基質(zhì)富含COL11A1和COL12A1，浸潤型標(biāo)本缺乏COL11A1、COL11A2和COL12A2，而沙漠型標(biāo)本具有COL12A1的高表達(dá)，但COL11A1與COL11A2低表達(dá)。然而，作者也注意到，在排斥型標(biāo)本中，COL11A1和COL12A1也在簇9之外的簇1的spots中表達(dá)。作者進(jìn)一步評估了免疫排斥人類HNSCC中α-SMA+CAF、CD8α+細(xì)胞和腫瘤巢之間的空間關(guān)系。大多數(shù)CD8α+細(xì)胞僅限于富含α-SMA+的區(qū)域，但作者也注意到，即使在α-SMA＋纖維化區(qū)域和腫瘤巢之間的實(shí)際邊界中，CD8α＋細(xì)胞也從未浸潤到腫瘤巢中。這些結(jié)果表明，CD8+T細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)中受到限制，除了細(xì)胞外基質(zhì)重編程外，還有其他分子機(jī)制將CD8+T淋巴細(xì)胞限制在間質(zhì)中。

圖1：CD8a+細(xì)胞在所有三種免疫類型的HNSCC的基質(zhì)中存在

2. 單細(xì)胞分析揭示HNSCC中CAFs的異質(zhì)性

       為進(jìn)一步研究HNSCCs的周圍基質(zhì)，作者通過scRNA-seq定義了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性。將來自五名HNSCC患者不同位置的腫瘤和鄰近正常組織樣本消化成單細(xì)胞懸浮液，并捕獲活細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq。在質(zhì)量控制和批量校正后，選擇23485個(gè)具有成纖維細(xì)胞特征的細(xì)胞進(jìn)行下游分析。作者首先比較了經(jīng)t-SNE降維的來自腫瘤和鄰近組織的成纖維細(xì)胞簇，并鑒定了10組成纖維細(xì)胞（圖2A）。與先前的假設(shè)一致，來自腫瘤和鄰近正常組織的成纖維細(xì)胞是多樣的。來自相鄰正常組織不同樣本的成纖維細(xì)胞簇有很大差異，這可能是采集這些組織不同解剖部位的結(jié)果（圖2A和2B）。除了簇1和簇4外，其他五個(gè)正常成纖維細(xì)胞簇在這五個(gè)正常相鄰組織中幾乎不共享。相反，來自腫瘤組織的成纖維細(xì)胞幾乎不存在于相鄰的正常組織中，即所謂的CAFs，僅表現(xiàn)為三個(gè)簇，簇5、簇6和簇10（圖2A）。簇5和6在所有五個(gè)腫瘤組織中被識別，簇5是only一個(gè)幾乎不存在于正常鄰近組織中的簇，并且?guī)缀踔淮嬖谟谒形鍌€(gè)癌癥樣本中。為進(jìn)一步識別這些簇，作者確定了這些成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，并試圖揭示每個(gè)簇的可能性作用。然而，與成纖維細(xì)胞的多樣性相反，所有這些成纖維細(xì)胞簇的標(biāo)記物都不是only的，并且?guī)讉€(gè)簇共享這些標(biāo)記物的相似表達(dá)（圖2C和D）。對于CAFs的三個(gè)細(xì)胞簇，top標(biāo)記物（如簇5的COL7A1、簇6的LRCC15和簇10的CACNA2D3）也由其他簇共享（圖2C）。事實(shí)上，很少有標(biāo)記物可以專門標(biāo)記每一簇的CAF。這些結(jié)果表明，CAFs表型在很大程度上取決于微環(huán)境，而不是其細(xì)胞系。

       此外，為了將HNSCCs的CAF簇與其他類型腫瘤的CAF進(jìn)行比較，作者評估了先前胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌和膀胱尿路上皮癌研究中鑒定的標(biāo)志物表達(dá)（圖2D）。在其他腫瘤中描述的大多數(shù)標(biāo)記物具有與簇5、簇6和簇10中CAFs相似的表達(dá)模式。然而，作者發(fā)現(xiàn)簇6比簇5具有更高的iCAF的幾種標(biāo)記物表達(dá)，如IL6和CXCL12，而簇5表達(dá)myCAFs的標(biāo)記物，如POSTN和ACTA2（圖2D）。盡管iCAF的標(biāo)記物（例如，PLA2G2A、IL6、CXCL12、CFD、DPT）可以區(qū)分簇6和簇5，但正常成纖維細(xì)胞表達(dá)的這些iCAF相關(guān)基因水平與簇6相似或更高。對于簇10，在三個(gè)簇中數(shù)量最低，這些細(xì)胞表達(dá)iCAF和myCAF的標(biāo)記物（圖2D和E），并且它們的表達(dá)模式位于簇5和簇6中間，這表明簇10處于過渡和瞬時(shí)狀態(tài)。此外，成纖維細(xì)胞的擬時(shí)序分析也證實(shí)了簇10的過渡狀態(tài)（圖2F和G）。作者還注意到，簇5和簇6在擬時(shí)序分析中都顯示出兩個(gè)軌跡（圖2G），這可能是簇中不同細(xì)胞系的結(jié)果。CD105，最近被鑒定為CAFs不同譜系的關(guān)鍵標(biāo)志物之一，并沒有區(qū)分CAFs的兩個(gè)軌跡，這表明需要鑒定其他譜系決定分子。

圖2：HNSCC腫瘤及鄰近組織成纖維細(xì)胞的整體分析

3. MHC-I和CXCL分子的高水平表達(dá)與CAFs和CD8+T細(xì)胞有關(guān)

       為進(jìn)一步研究和鑒定CAFs和正常成纖維細(xì)胞之間的差異，作者比較了相鄰正常組織中CAFs的表達(dá)譜和正常成纖維細(xì)胞（NFs）的表達(dá)譜。關(guān)于上述成纖維細(xì)胞的多個(gè)簇，作者首先將CAFs和NFs作為整體進(jìn)行比較。通過比較簇5和簇6的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CAFs和NFs的比較中幾乎所有的top差異表達(dá)基因都在簇5中富集（圖3A），這表明簇5在CAFs與NFs之間的差異中起著決定因素的作用。與先前的研究一致，CAFs具有獨(dú)特的表達(dá)模式，并表達(dá)一組促腫瘤基因，如POSTN。差異表達(dá)基因的GO分析揭示了與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)術(shù)語的富集，強(qiáng)調(diào)CAFs通過TME重塑和與TME中細(xì)胞發(fā)生相互作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生（圖3B）。此外，富集分析表明，CAFs在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)（如IL17）和ECM受體相互作用中發(fā)揮作用（圖3C）。有趣的是，作者注意到CAFs還表現(xiàn)出與T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)和抗原處理和呈遞相關(guān)基因的富集，富集分?jǐn)?shù)僅棑在ECM受體相互作用后（圖3C）。

       然后，作者探索了CAFs的兩個(gè)主要聚類，簇5和簇6，以驗(yàn)證先前比較中基因集的富集。MHC-I分子，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M，在簇5中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平（圖3D）。GSEA進(jìn)一步證實(shí)，與抗原處理和呈遞相關(guān)的基因在簇5中具有更高的表達(dá)（圖3E）。由于先前的工作揭示了胰腺導(dǎo)管腺癌中的抗原呈遞CAFs群體，作者還在scRNA-seq數(shù)據(jù)中探索了CD74和HLA-DRA（MHC-II）的表達(dá)，但在簇5中沒有發(fā)現(xiàn)任何富集。相反，作者證實(shí)了MHC-I分子（包括B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C）在簇5中的表達(dá)增加（圖3F）。此外，在三種免疫類型的HNSCC標(biāo)本中，腫瘤底部具有較高的MHC I類分子表達(dá)水平，并且MHC I類分子高表達(dá)的spots大多位于排斥型標(biāo)本的腫瘤巢周圍。

       由于簇5與免疫細(xì)胞具有更活躍的相互作用，并表現(xiàn)出調(diào)節(jié)造血細(xì)胞分化基因集的富集（圖3E），作者在scRNA-seq數(shù)據(jù)中進(jìn)一步評估簇5中 CAFs與不同類型免疫細(xì)胞之間的相互作用。就配體-受體與簇5的相互作用數(shù)量而言，髓系細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是排名最高的細(xì)胞，盡管CAF（簇5和簇6）之間的內(nèi)部相互作用最頻繁。為了定量分析相互作用，作者考慮了配體和受體的表達(dá)水平，并評估了傳入和傳出信號（圖3G和H）。簇5中髓系細(xì)胞和CAFs表現(xiàn)出強(qiáng)大的傳入和傳出信號網(wǎng)絡(luò)。對于CD8+T細(xì)胞，MHC-I、半乳糖凝集素、CD22、LCK和CXCL是最強(qiáng)的傳入信號（圖3G）。就傳出信號而言，簇5高水平表達(dá)的MHC-I和CXCL用于信號傳導(dǎo)（圖3H）。就CXCL相互作用而言，據(jù)報(bào)道參與T細(xì)胞維持的CXCL12-CXCR4/CKR3軸是主要貢獻(xiàn)者。此外，作者注意到CXCL9和CXCL10在最近的一項(xiàng)皮膚成纖維細(xì)胞研究中被確定為CD8+T細(xì)胞募集的關(guān)鍵趨化因子，它們在第5簇而不是第6簇中高度表達(dá)（圖3D）。正如預(yù)期的那樣，GEPIA相關(guān)性分析揭示了CD8A表達(dá)與CXCL9/CXCL10/CXCL12之間的顯著正相關(guān)性，證實(shí)了CXCL9/CXCL10/CXCL12對CD8+T細(xì)胞的趨化作用。有趣的是，作者注意到CXCL9、CXCL10和CXCL12在不同免疫類型的HNSCC中具有特殊的表達(dá)模式。CXCL9和CXCL10在沙漠型和浸潤型標(biāo)本中豐富，在排斥型標(biāo)本的基質(zhì)中表達(dá)有限且。相反，沙漠型標(biāo)本幾乎沒有CXCL12的表達(dá)，而排斥型標(biāo)本具有高水平的CXCL12。浸潤型標(biāo)本在惡性區(qū)域顯示CXCL12的表達(dá)，但在鄰近正常區(qū)域具有較高水平的CXCL12。

       這些結(jié)果表明，簇5負(fù)責(zé)CAFs的不同表達(dá)譜，并與MHC-I分子和CXCL趨化因子介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞具有強(qiáng)烈而頻繁的相互作用。

圖3：CXCL和MHC I類分子的高表達(dá)水平與簇5 CAFs和CD8+T細(xì)胞有關(guān)

4. CAFs中MHC-I高表達(dá)限制了CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能

       為進(jìn)一步闡明MHC-I分子在CAFs中表達(dá)增加的意義，作者首先通過腫瘤免疫組織估計(jì)資源（TIMER）分析了MHC分子對HNSCC患者生存的貢獻(xiàn)。與預(yù)期相反，在累積生存率與免疫浸潤呈正相關(guān)的HPV陽性HNSCC患者中，較高水平的MHC I類分子（HLA-a、HLA-B、HLA-C和B2M）與較差的結(jié)果相關(guān)。然后，作者從HNSCC腫瘤組織中分離CAFs，并敲低B2M的表達(dá)，其與HN6共同注射入裸鼠中（缺乏適應(yīng)性免疫）。腫瘤生長或組織學(xué)形態(tài)沒有顯著變化，表明CAFs中的B2M沒有直接改變腫瘤生長。

       為進(jìn)一步確定具有不同MHC-I表達(dá)水平的成纖維細(xì)胞是否影響體內(nèi)腫瘤生長和抗腫瘤免疫，應(yīng)用具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。由于HNSCC自發(fā)致瘤小鼠模型的局限性，本研究使用了由SCC VII（一種不斷應(yīng)用于HNSCC研究的鱗狀細(xì)胞系）和成纖維細(xì)胞形成的皮下荷瘤模型。作者使用從小鼠舌頭分離的正常成纖維細(xì)胞（小鼠舌頭成纖維細(xì)胞，MTFs）作為替代品，其有助于CAFs（圖4A）。作者首先敲低了MTFs中B2m的表達(dá)（圖4B），并證實(shí)敲低B2m不會影響SCC VII細(xì)胞的生存能力。然后，作者將SCC VII和成纖維細(xì)胞共同皮下注射到C3H/He小鼠中。有趣的是，與對照組相比，SCC VII和B2m KD MTFs形成的腫瘤在終點(diǎn)生長較慢且小得多，CD8+T細(xì)胞的耗竭挽救了觀察到的表型（圖4C）。為了研究B2m-KD成纖維細(xì)胞如何限制腫瘤生長，作者分離了皮下腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步分析。耗竭標(biāo)記物和免疫檢查點(diǎn)分子，包括T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域包含-3（TIM3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（LAG3）、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA4）和具有Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（TIGIT），在來自皮下腫瘤的CD8+T細(xì)胞中進(jìn)行了檢測，并在B2m-KD腫瘤中顯示出TIGIT的輕微降低，但在其他腫瘤中沒有顯示出顯著變化（圖4D）。相反，具有B2m KD MTFs的腫瘤含有大量分泌抗腫瘤分子（穿孔素和IFN-γ）的CD8+T細(xì)胞，并且表達(dá)顆粒酶B的CD8+T細(xì)胞略有增加（圖4D）。作者還注意到記憶CD8+T細(xì)胞（TCF1+CD8+T細(xì)胞）在B2m KD腫瘤中也略有增加（圖4D）。作者還將SCC VII和B2m-KD小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）共同注射到C3H/He小鼠中，并獲得類似的結(jié)果。然后，作者從轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中分離并擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞，并將其與來自相同患者的CAFs共同培養(yǎng)（圖4E）。作者發(fā)現(xiàn)在與B2M-KD CAFs的共培養(yǎng)中，當(dāng)TIGIT的表達(dá)在B2M-KD組中減少時(shí)（圖4H），結(jié)合CD8+T細(xì)胞的CAFs數(shù)量減少（圖4F），穿孔素和TCF1的表達(dá)增加（圖4G）。然后，用抗CD3/CD28抗體激活從HNSCC腫瘤患者中分離的CD8+T細(xì)胞（圖4I）。證實(shí)了來自HNSCC腫瘤的CD8+T細(xì)胞中TCF1在激活后降低（圖4J）。并注意到CXCR3（CXCL9和CXCL10的受體）顯著增加，CXCR4（CXCL12的受體）保持不變（圖4K），表明CD8+T細(xì)胞對CXCL9或CXCL10信號變得更敏感，這些信號通過簇5 CAFs高度表達(dá)（圖3D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，高表達(dá)MHC-I的CAFs可能限制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤能力。

圖4：MHC I類高表達(dá)限制了CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能

5. 檢查點(diǎn)分子配體半乳糖凝集素-9在MHC I^hi CAFs中富集

       Jacqueline D.Shields先前的工作揭示了具有FASL和PD-L2的CAFs的CD8+T細(xì)胞以MHC-I依賴的方式發(fā)生抗原特異性缺失。因此，作者進(jìn)一步檢測了HNSCC成纖維細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)配體的表達(dá)。有趣的是，在所有檢查點(diǎn)配體中，半乳糖凝集素-9是only在MHC-I^hi CAFs中富集的分子（簇5）（圖5A）。為了驗(yàn)證半乳糖凝集素-9在MHC-I^hi CAFs中的表達(dá)，采集了幾個(gè)HNSCCs的腫瘤樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)半乳凝集素-9在α-SMA+CAF中表達(dá)（圖5B），且表達(dá)半乳凝集素-9的CAFs具有更高水平的MHC-I分子（圖5C）。LGALS9（編碼galectin-9的基因）存在于HNSCC特異性的所有三種免疫型中。為進(jìn)一步確定腫瘤中g(shù)alectin-9的分布，在70名HNSCC患者的較大隊(duì)列中對galectin-9表達(dá)進(jìn)行測試。在這些患者中，作者將galectin-9的表達(dá)模式分為四類（圖5D）：（i）基質(zhì)細(xì)胞和惡性胰島均未表達(dá)galectin-9（6/70，8.57%）；（ii）galectin-9僅存在于腫瘤巢中，但不存在于基質(zhì)中（4/70，5.71%）；（iii）galectin-9僅存在于基質(zhì)中（33/70，47.14%）。此外，作者注意到，CAF在體外培養(yǎng)兩周后失去了Galectin-9的表達(dá)，當(dāng)與HN6（HNSCC細(xì)胞系）培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞表面的HLA-A/B/C水平較高，HN6上的HLA-A/B/C水平下降（圖5E），這暗示HMC-I高表達(dá)和galectin-9（MHC-I^hiGal-9+CAF）正向表達(dá)的CAF表型取決于TME中的信號網(wǎng)絡(luò)。

       為了隨后研究TME信號網(wǎng)絡(luò)對MHC-I^hiGal-9+CAF形成的貢獻(xiàn)作用，使用SCENIC分析來鑒定scRNA-seq數(shù)據(jù)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正如預(yù)期的那樣，CAFs簇具有高活性分?jǐn)?shù)的不同調(diào)節(jié)子，MHC-I^hiGal-9+CAF對STAT1、PRDM1和STAT2的調(diào)節(jié)子表現(xiàn)出高活性分?jǐn)?shù)，也對調(diào)節(jié)因子特異性表現(xiàn)出高分?jǐn)?shù)。此外，在CAFs簇的比較中，GSEA結(jié)果表明干擾素（IFN）和腫瘤壞死因子（TNF）信號通路在MHC-I^hiGal-9+CAF中是活躍的（圖5F）。然后，作者通過體外培養(yǎng)CAFs，以進(jìn)一步探索信號網(wǎng)絡(luò)的貢獻(xiàn)（圖5G和H）。在IFN和TNF-α處理下，CAFs具有更高的半乳糖凝集素-9和MHC I類分子（HLA/B/C和B2M）表達(dá)（圖5G和H）。具體而言，IFN-β誘導(dǎo)半乳糖凝集素-9表達(dá)的最高倍數(shù)變化，而IFN-γ誘導(dǎo)MHC I類分子表達(dá)的高倍數(shù)變化（圖5G和H）。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)POSTN信號誘導(dǎo)高水平的CXCL12時(shí)，IFN和TNF信號與CXCL9和CXCL10的高表達(dá)相關(guān)（圖5G）。作者還檢測了用不同細(xì)胞因子處理的CAFs中PD-L1表達(dá)的變化。然而，在IFN刺激的CAFs中，PD-L1表達(dá)的變化與半乳糖凝集素-9表達(dá)的變化并不完全一致。與先前的報(bào)道一致，TGF-β信號傳導(dǎo)與膠原表達(dá)相關(guān)（COL11A1、COL11A2、COL12A1）（圖5G）。

       作者還評估了用IFN和TNF-α處理的惡性細(xì)胞系（CAL27、HN6、HN30）中MHC I類分子和半乳糖凝集素-9的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，HLA-A/B/C和半乳糖凝集素-9的表達(dá)在所有三種細(xì)胞系中增加，但水平不同。在這些細(xì)胞中，HN6細(xì)胞是對IFN最敏感的細(xì)胞，它們對IFN和TNF-α的反應(yīng)與CAFs的反應(yīng)相似。

       這些結(jié)果表明，半乳糖凝集素-9是only一種在MHC-I^hi CAFs中富集并由TME中的IFN信號誘導(dǎo)的免疫檢查點(diǎn)配體，在HNSCC患者中普遍由CAFs表達(dá)。

圖5：免疫檢查點(diǎn)配體分子半乳糖凝集素-9在CAFs的簇5中富集

6. Gal-9+CAFs誘導(dǎo)TCF1+GZMK+CD8+T細(xì)胞分化異常

       為進(jìn)一步鑒定Gal-9+CAF的作用并確定與Gal-9+CAFs相互作用的CD8+T細(xì)胞亞群，作者進(jìn)一步分析了來自前五對腫瘤鄰近正常組織的CD8+T細(xì)胞的scRNA-seq結(jié)果。這些CD8+T細(xì)胞聚類成八組，簇1和簇2在腫瘤組織和正常組織中共享（圖6A-C）。腫瘤組織在簇3、簇5和簇6中具有更多的細(xì)胞（圖6B）。簇4、簇7和簇8幾乎是正常組織獨(dú)有的（圖6C）。根據(jù)擬時(shí)序分析，來自腫瘤和鄰近組織的CD8+T細(xì)胞具有不同的分化軌跡，并且簇1在來自腫瘤組織的CD8+T細(xì)胞中位于初級過渡階段（圖6D）。為確定每個(gè)CD8+T細(xì)胞簇的狀態(tài)，作者檢測了八個(gè)簇中編碼細(xì)胞毒素（GMZA、GMZB、GMZK、IFNG和PRF1）、檢查點(diǎn)分子（CTLA4、HAVCR2、PDCD1、LAG3、TIGIT）和TCF1基因的表達(dá)（圖6E），表明簇1和簇2是前效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，如先前報(bào)道的。表達(dá)高水平GZMA、GZMB、IFNG和PRF1的簇3-6是效應(yīng)CD8+T細(xì)胞（圖6E）。

       為了定義與Gal-9+CAF相互作用的簇，選擇五種腫瘤組織來分析Gal-9+CAFs與八種CD8+T細(xì)胞簇之間的相關(guān)性（圖6F）。作者發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞簇1是only一個(gè)與Gal-9+CAFs具有顯著相關(guān)性的簇（圖6F）。這些細(xì)胞表現(xiàn)出較高水平的CXCR3/CXCR4和半乳糖凝集素-9、CD44和P4HB受體（圖6E）。此外，半乳糖凝集素-9的表達(dá)也與檢查點(diǎn)分子（TIM3、CTLA4、TIGIT、LAG3、PDCD1）呈正相關(guān)，這進(jìn)一步表明Gal-9+CAF和CD8+T細(xì)胞之間的相互作用與CD8+T的功能障礙有關(guān)。此外，TCF1+CD8+T細(xì)胞和半乳糖凝集素-9的相似空間分布也證實(shí)了Gal-9+CAF與TCF1+CCD8+T細(xì)胞的相互作用潛力（圖6G）。

       為闡明galectin-9在成纖維細(xì)胞中對CD8+T細(xì)胞的功能，作者構(gòu)建了動物模型，作者將LGALS9敲低的MTF與SCC VII共注射，并分析了浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞變化（圖7A）。具體而言，作者分析了免疫檢查點(diǎn)分子（TIM3、TIGIT、CTLA4）和GZMB的表達(dá)（圖7B）。正如預(yù)期的那樣，TIM3、TIGIT和CTLA4在CD8+細(xì)胞中下調(diào)，細(xì)胞毒性細(xì)胞因子在LGALS9-KD組中上調(diào)（圖7B）。此外，下調(diào)的galectin-9還誘導(dǎo)腫瘤中CD8+T細(xì)胞和TCF1+CD8+T細(xì)胞比例上調(diào)（圖7C和D）。此外，對來自同一患者的LGALS9-kD CAF和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與動物實(shí)驗(yàn)相似（圖7E和F）。將CD8+T細(xì)胞結(jié)合到CAF的數(shù)量在LGALS9-KD組中沒有變化。這些結(jié)果表明galectin-9（由lgals9編碼）導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能障礙。

       然后，作者在三種免疫類型的HNSCC標(biāo)本的多重免疫熒光染色中定量評估Gal-9+CAF和TCF1+CD8+T細(xì)胞之間的空間關(guān)系（圖7G-J），并對來自新患者隊(duì)列的排斥型和浸潤型腫瘤的FFPE中CD8+T細(xì)胞和Gal-9+CAF之間的位置相關(guān)性進(jìn)行了另一種多重免疫組織化學(xué)分析（圖7G）。浸潤型和排斥型的腫瘤具有較高比例的Gal-9+CAF，并且這些細(xì)胞特異性地位于腫瘤巢周圍（PanCK+區(qū)域）。在浸潤型和排斥型腫瘤中，TCF1+CD8+T細(xì)胞（CD3ε+CD8α+TCF1+細(xì)胞）在CD8+T細(xì)胞中的百分比以及CD8+T淋巴細(xì)胞與Gal-9+CAF的比率較高。在腫瘤巢中，如先前在作者數(shù)據(jù)中所證明的，具有較高M(jìn)HC-I水平的半乳糖凝集素-9+CAF與較高密度的CD8+細(xì)胞呈正相關(guān)（圖7I）。TCF1+CD8+T細(xì)胞和Gal-9+CAFs之間的距離較短，TCF1+CCD8+T細(xì)胞在浸潤型中優(yōu)選Gal-9+CAF（圖7H和J）。隨著CXCR3/CXCR4在TCF1+CD8+T細(xì)胞中的較高表達(dá)和CXCL9/CXCL10在Gal-9+CAF中的較高表達(dá)（圖3D），這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TCF1+CCD8+T細(xì)胞在空間分布上對Gal-9+CAFs的偏好。

       所有結(jié)果表明，具有高水平MHC I類分子的Gal-9+CAF捕獲并與效應(yīng)前CD8+T細(xì)胞相互作用，并與這些CD8+T功能失調(diào)分化相關(guān)（圖7K）。

圖6：TCF1+GZMK+CD8+T細(xì)胞與半乳糖凝集素-9+CAF呈負(fù)相關(guān)

圖7：半乳糖凝集素-9+CAF與TCF1+CD8+T細(xì)胞分化異常有關(guān)

結(jié)論

       作者的研究確定了一簇CAFs，其以CXCL和MHC-I依賴的方式捕獲TCF1+GZMK+CD8+T細(xì)胞，并通過半乳糖凝集素-9進(jìn)一步誘導(dǎo)功能失調(diào)的轉(zhuǎn)化。作者的工作為影響CD8+T細(xì)胞分布和功能障礙的因素提供了新的見解，并有可能應(yīng)用于提高免疫療法的療效。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化，空間轉(zhuǎn)錄組測序，scRNA-seq，流式細(xì)胞術(shù)，慢病毒轉(zhuǎn)染，小鼠腫瘤模型構(gòu)建，免疫熒光，real-time PCR，免疫印跡

參考文獻(xiàn)：

Li C, Guo H, Zhai P, Yan M, Liu C, Wang X, Shi C, Li J, Tong T, Zhang Z, Ma H, Zhang J. Spatial and single-cell transcriptomics reveal a cancer-associated fibroblast subset in HNSCC that restricts infiltration and anti-tumor activity of CD8+ T cells. Cancer Res. 2023 Nov 6. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1448. Epub ahead of print. PMID: 37930937.