MAF擴(kuò)增通過表觀遺傳重塑許可ERα驅(qū)動乳腺癌轉(zhuǎn)移

        MAF擴(kuò)增增加乳腺癌（BCa）轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，其機(jī)制尚不清楚，但具有重要的臨床意義。雌激素受體陽性（ER+） BCa的生長和轉(zhuǎn)移都需要雌激素，盡管其機(jī)制尚不清楚。在這里，作者整合了蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)、染色質(zhì)可及性和人類和同基因小鼠BCa模型的功能分析，表明MAF直接與雌激素受體α （ERα）相互作用，從而促進(jìn)了一種獨(dú)特的染色質(zhì)景觀，有利于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。作者確定了在雌激素暴露后以MAF依賴方式重新許可的促進(jìn)轉(zhuǎn)移的基因。組蛋白去甲基化酶KDM1A是表觀基因組重塑的關(guān)鍵，它促進(jìn)了促轉(zhuǎn)移性MAF/雌激素驅(qū)動基因表達(dá)程序的表達(dá)，而KDM1A活性的喪失阻止了這種轉(zhuǎn)移。因此，作者已經(jīng)確定MAF/雌激素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)需要來自全身環(huán)境的遺傳、表觀遺傳和激素信號，這些信號影響BCa細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。本文于2023年11月發(fā)表于《Nature Cell Biology》, IF: 21.3，Q1。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、MAF過表達(dá)促進(jìn)ER+BCa細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移

        為了分析MAF在ER+BCa中的作用，作者首先分析了ER+BoM2 BCa細(xì)胞，這些細(xì)胞是從親本ER+MCF7 BCa細(xì)胞群中選擇的小鼠骨趨向性細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冊隗w內(nèi)驅(qū)動轉(zhuǎn)移的能力。值得注意的是，MCF7細(xì)胞可能有局限性，但與其他腔內(nèi)BCa細(xì)胞（如T47D和ZR-75）相比，不存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和雄激素受體活性之間的混淆相互作用。在體內(nèi)，MAF過表達(dá)足以顯著增加MCF7細(xì)胞接種于胸腺裸鼠左心室時的骨轉(zhuǎn)移率，而在其他部位無轉(zhuǎn)移差異（圖1b、c）。體內(nèi)腫瘤生長需要補(bǔ)充雌激素。接下來，作者測試了MAF過表達(dá)是否以E2依賴的方式增強(qiáng)體外細(xì)胞增殖。與模擬E2處理的細(xì)胞或激素剝奪（HD）對照相比，MAF陽性細(xì)胞中E2刺激的細(xì)胞增殖增強(qiáng)，表明MAF表達(dá)與E2之間存在生物學(xué)相互作用。

        接下來，作者建立了一個條件Maf過表達(dá)敲入小鼠模型（Rosa26LSLMAF），以:（1）提供一種獨(dú)立的方法，（2）排除人BCa細(xì)胞系中獲得性遺傳改變的存在，（3）直接測試MAF表達(dá)增加對E2依賴性BCa轉(zhuǎn)移的影響。為了誘導(dǎo)小鼠BCa腫瘤，作者用醋酸甲孕酮和7,12-二甲基苯并蒽（MPA-DMBA）處理Rosa26LSLMAF小鼠，使用已建立的BCa化學(xué)致癌方案（圖1d,e）。作者在體外擴(kuò)增小鼠腫瘤源性細(xì)胞系（mTB細(xì)胞）;值得注意的是，這些保留了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和角蛋白的表達(dá)（圖1f,g）。然后用Ad-Cre顆粒感染誘導(dǎo)Maf（或不誘導(dǎo)，作為對照），作者得到了具有相同基因組背景的等基因細(xì)胞系對，無論是否有Maf過表達(dá)（圖1d,h,i）。無論注射部位如何，Maf陽性的mTB細(xì)胞比Maf陰性的對照mTB細(xì)胞產(chǎn)生更多的骨轉(zhuǎn)移（圖1j,k）。最后，作者證實(shí)Maf誘導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)移對雙磷酸鹽治療是不耐受的，并且骨外轉(zhuǎn)移（肺、肝、腎、卵巢和腦）顯著促進(jìn)，如患者所述（圖1l,m）。

        總的來說，這些結(jié)果證實(shí)了MAF -陽性細(xì)胞在骨定植過程中具有競爭優(yōu)勢，可以被MAF -陰性細(xì)胞所吸收，產(chǎn)生以MAF -陽性克隆為主的異質(zhì)性轉(zhuǎn)移。因此，作者接下來重點(diǎn)闡明（1）E2信號與ER+BCa細(xì)胞中MAF -過表達(dá)之間相互作用的分子機(jī)制，以及（2）這些相互作用如何促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移。

MAF擴(kuò)增驅(qū)動E2/ER信號依賴性BCa轉(zhuǎn)移

2、MAF、ER和染色質(zhì)因子在ER+BCa細(xì)胞中相互作用

        MAF編碼AP1家族轉(zhuǎn)錄因子（TF），其DNA結(jié)合（因此其促轉(zhuǎn)移活性）可能取決于與細(xì)胞環(huán)境特異性表達(dá)的相互作用伙伴。為了以無偏倚的方式鑒定活BCa細(xì)胞中與MAF相互作用的蛋白質(zhì)，作者進(jìn)行了鄰近依賴的生物素鑒定（BioID2），可以檢測到微弱和短暫的相互作用。雖然在功能上沒有區(qū)別，但作者同時使用了短（MAF-S）和長（MAF-L）亞型，以避免任何潛在的亞型依賴偏差。每個MAF異構(gòu)體在框架內(nèi)融合到BioID2的N或C端，分別產(chǎn)生MAF-BioID2- HA和myc-BioID2-MAF（圖2a）。從含有BioID2- MAF或（作為對照）BioID2的生物素處理細(xì)胞中提取鏈霉親和素后，通過串聯(lián)質(zhì)譜（nanoLC-MS/MS）鑒定共沉淀蛋白。作者獲得了許多高置信度的交互作用因子（方法）:139 N -末端標(biāo)記的MAF-S，119 C -末端標(biāo)記的MAF-S，174 N -末端標(biāo)記的MAF-L,154 C -末端標(biāo)記的MAF-L（圖2a）。然后，作者選擇了92個MAF-S條件共有的相互作用因子，以及105個MAF- L條件共有的相互作用因子，來定義一個126個MAF高置信度相互作用因子的網(wǎng)絡(luò)（其中71個在所有四種條件下都是常見的）。這組126個基因中包括表征良好的MAF相互作用因子CREBBP，并且在已知蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的高度互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中被強(qiáng)烈富集（P < 1 × 10?16），表明MAF相互作用因子之間存在生物相關(guān)復(fù)合物（圖2b）。事實(shí)上，存在一些主要的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，如SWI/SNF、INO80、NurD和CoREST。GO富集分析還確定了影響基因表達(dá)的分子功能，包括激素受體信號家族的成員。值得注意的是，ER本身作為生物學(xué)相關(guān)的MAF相互作用物出現(xiàn)（圖2a-c）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其他相互作用因子隨后通過共免疫沉淀（co-IP;圖2d）進(jìn)行驗(yàn)證。為了確定ER的存在是否會影響MAF的相互作用，使用ER- MDA-MB-231 BCa細(xì)胞進(jìn)行BioID（圖2c）。在這些ER-細(xì)胞中，MAF保留了與SWI/SNF、INO80、NurD和CoREST染色質(zhì)重塑復(fù)合物的某些組分的相互作用，但不與ER和/或關(guān)鍵ER共激活子相互作用（圖2c）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明MAF和特定伙伴之間的相互作用依賴于細(xì)胞類型。

MAF與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用

3、MAF的N端轉(zhuǎn)激活結(jié)構(gòu)域與ER相互作用

        接下來，作者使用HA標(biāo)記的MAF- S和MAF- L在MCF7細(xì)胞中通過co-IP驗(yàn)證MAF的相互作用（圖2d）。通過近距離連接試驗(yàn)（PLAs），作者證實(shí)了MAF-ER相互作用和共定位，與單一抗體對照相比，HA和ER抗體聯(lián)合在細(xì)胞核中檢測到和量化的熒光信號明顯更高（圖2e,f）?；谠?span>MCF7 ER+BCa細(xì)胞中使用ER特異性PROTAC誘導(dǎo)ER降解，作者證實(shí)了MAF-ER相互作用的特異性（圖2e-g）。然后，作者使用PLA通過比較全長MAF- L與缺少部分或全部轉(zhuǎn)錄激活域的截?cái)喟姹荆ǚ謩e為ΔN-t 1, aa 85-403和ΔN-t 2, aa 120-403）來研究與ER相互作用的MAF的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。然而，作者不能排除與ER AF1或AF2結(jié)構(gòu)域的相互作用具有不同的作用，如前所述。

4、MAF-ER相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重編程

        接下來，作者對激素剝奪（HD）或E2處理6小時的MCF7細(xì)胞進(jìn)行RNA測序（RNA-seq）（圖3a,b）。作者確定了轉(zhuǎn)錄變化需要（1）MAF過表達(dá)（簇1和2），（2）E2（簇3和4）和（3）MAF和E2（這里，MAF/E2依賴;簇5和6）（圖3a）。與E2刺激的增殖一致，E2處理與E2早期和晚期基因應(yīng)答（簇3）正相關(guān)（圖3a,b），包括已建立的ER介導(dǎo)的應(yīng)答基因GREB1, CCND1和PGR（圖3c）。值得注意的是，MAF/E2依賴性基因標(biāo)記（簇5）與E2早期和晚期反應(yīng)、炎癥和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）基因反應(yīng)呈正相關(guān)，包括PTHLH、JAG1、FGF18、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH;這些基因產(chǎn)物支持轉(zhuǎn)移適應(yīng)能力，尤其是骨（圖3d,e）。重要的是，作者觀察到在ER+BCa患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中，包括乳腺癌國際分子分類協(xié)會（METABRIC）和癌癥基因組圖譜（TCGA） BCa隊(duì)列中，MAF的表達(dá)水平與FGF18、PTHLH、JAG1、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖3f）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明MAF過表達(dá)在E2刺激下以ER依賴的方式擴(kuò)大了ER+BCa細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄庫。作者提出MAF過表達(dá)支持BCa在增殖和原發(fā)腫瘤生長之外的進(jìn)展，可能是通過直接激活骨微環(huán)境使其更容易接受轉(zhuǎn)移狀態(tài)。

MAF調(diào)節(jié)E2/ ER誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄基因程序

5、MAF在染色質(zhì)上重新分配內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

        為了深入了解MAF的全基因組定位，并評估其在E2處理后與ERα的潛在直接相互作用，作者在對照和MAF過表達(dá)的MCF7 BCa細(xì)胞中進(jìn)行了ERα和MAF染色質(zhì)免疫沉淀和高通量測序（染色質(zhì)免疫沉淀和測序，ChIP-seq）。事實(shí)上，只有在E2處理后，才觀察到ER與染色質(zhì)的廣泛結(jié)合，這表明E2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向染色質(zhì)募集中的作用（圖4a）。相反，MAF的結(jié)合在很大程度上獨(dú)立于E2（圖4a）。然而，有趣的是，在E2的作用下，ER和MAF都結(jié)合了一組共享的基因組位點(diǎn)（576），其中一些位點(diǎn)（196）僅在MAF過表達(dá)的細(xì)胞中被ER結(jié)合（圖4a,b）。在基因組瀏覽器中對這些位點(diǎn)進(jìn)行目視檢查，發(fā)現(xiàn)E2誘導(dǎo)的MAF-E2依賴性ER與MAF-E2靶轉(zhuǎn)移支持基因相關(guān)增強(qiáng)子中的未知靶點(diǎn)結(jié)合，如FGF18、PTHLH、JAG1、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH（圖4c；注意GREB1、CCND1和PGR被用作真正的ER/E2靶點(diǎn)）。這些假定的順式調(diào)控元件在MAF共識結(jié)合基序（MARE和MAF）中富集，并且與增強(qiáng)子標(biāo)記p300的ChIP-seq峰相吻合（圖4d）。

        接下來，作者使用CRISPR干擾（CRISPRi）來抑制PTHLH和JAGGED1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）附近的這些假定的MAF應(yīng)答元件，以確認(rèn)它們的功能作用。在使用特定的單導(dǎo)RNA （sgRNA）對共享的MAF/ER峰位點(diǎn)和dCas9失活后，MAF/ER依賴的轉(zhuǎn)錄對PTHLH和JAGGED1的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)顯著減弱，與E2無關(guān)（圖4e）?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明MAF的存在直接或間接地增加了ER與染色質(zhì)的結(jié)合。此外，MAF直接與ERα相互作用，因此其在BCa中的過表達(dá)與ER順反組相關(guān)聯(lián)并擴(kuò)大（圖4f）。作者假設(shè)MAF過表達(dá)，通過其與染色質(zhì)重塑物的直接相互作用（圖2c），啟動染色質(zhì)引物，響應(yīng)E2，促進(jìn)ER基因調(diào)控，最終促進(jìn)ER+BCa的轉(zhuǎn)移過程。

MAF染色質(zhì)結(jié)合與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重疊并擴(kuò)展其結(jié)合

6、ER/MAF協(xié)同提供了一個特定的染色質(zhì)景觀

        接下來，作者在E2刺激下生成了高度轉(zhuǎn)移的MAF陽性MCF7 BCa細(xì)胞的染色質(zhì)可及性圖。與對照細(xì)胞相比，MAF過表達(dá)和E2刺激都在細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)上留下了明顯的印記，這是通過染色質(zhì)可及性的變化來測量的;作者可以定義MAF依賴簇A和B（分別為97和80個峰），E2依賴簇C和D（分別為40和76個峰）以及MAF/E2依賴簇E和F（分別為621和797個峰）（圖5a-c）。MAF/E2依賴性簇特有的廣泛染色質(zhì)重塑在ER耗盡時丟失，主要是在帶注釋的啟動子/ TSSs（圖5d）。重要的是，與其他簇相比，MAF依賴簇A和E的啟動子/TSS區(qū)域的ATAC（轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測定）峰的寬度顯著增加（圖5e）。值得注意的是，MAF依賴的ATAC峰與BCa細(xì)胞中的組蛋白標(biāo)記重疊，并與啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活（H3K27Ac, H3K4me3）相關(guān)（圖5f）。

        為了確定這些鑒定出的染色質(zhì)可及性峰的變化是否反映了觀察到的轉(zhuǎn)錄變化（圖3a），作者整合了ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)集。MAF過表達(dá)E2處理細(xì)胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示，MAF和E2同時調(diào)控表達(dá)的基因顯著富集（圖5g;集群A至F如圖5a所示）。

MAF擴(kuò)增引起染色質(zhì)景觀的變化

7、MAF和ER調(diào)控轉(zhuǎn)移基因表達(dá)程序

        為了將這些染色質(zhì)結(jié)合事件與轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)系起來，作者使用先前描述的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步表征了MAF/E2依賴性基因（圖3a）。GO分析顯示，E2上調(diào)的一些基因是已知的雌激素反應(yīng)基因（如ple、MYC和細(xì)胞周期介質(zhì)）。其他MAF/E2依賴基因?qū)儆谝郧拔磁cE2信號相關(guān)的途徑（圖3b,d），包括與侵襲性和高度轉(zhuǎn)移性BCa表型相關(guān)的基因（例如，EMT，炎癥）。重要的是，MAF和ER之間共享的染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)是最近發(fā)現(xiàn)的E2靶向基因附近最富集的位點(diǎn)，以及經(jīng)典的E2應(yīng)答（圖6a）。同樣，在MAF/E2條件下，差異開放和關(guān)閉的染色質(zhì)區(qū)域在ER ChIP峰中富集（開放峰363個，關(guān)閉峰193個）（圖6b）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，在本文發(fā)現(xiàn)的E2靶基因附近以前未被發(fā)現(xiàn)的順式調(diào)控元件可能被MAF用于支持ERα結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。

        根據(jù)多個TCGA患者腫瘤中500 kb范圍內(nèi)RNA-seq和ATAC-seq信號的相關(guān)性，作者可以推斷患者樣本中MAF-ER結(jié)合直接控制的靶基因（而不僅僅依賴于基因接近性）。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)，在MCF7細(xì)胞中同時被ER和MAF占據(jù)的患者乳腺腫瘤中，ATAC-seq峰通過啟動子-增強(qiáng)子連接在功能上與E2靶基因表達(dá)的控制相關(guān)聯(lián)，其程度高于偶然預(yù)期（例如，SOX9與近似隨機(jī)排列相比，P < 0.0001;圖6 c, d）。相比之下，單獨(dú)由MAF結(jié)合的位點(diǎn)沒有顯示出這種實(shí)質(zhì)性的富集（圖6c）。總的來說，這些結(jié)果表明E2主要通過ER位點(diǎn)發(fā)出信號，然而，在MAF表達(dá)時，ER能夠與MAF一起結(jié)合到以前未被發(fā)現(xiàn)的基因組位點(diǎn)，從而從經(jīng)典的E2應(yīng)答基因程序中擴(kuò)展E2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄庫。事實(shí)上，通過整合RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)和MAF-和MAF/E2依賴性ER ChIP-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)生的MAF-依賴性基因標(biāo)記確定了ER+患者的一個子集，其最初經(jīng)歷骨骼復(fù)發(fā)的可能性更高（圖6e）。

共享ER-MAF結(jié)合位點(diǎn)控制E2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移基因程序

8、定義ER BCa轉(zhuǎn)移的表觀遺傳開關(guān)

        接下來，作者將重點(diǎn)放在高可信度的MAF相互作用物上，這些相互作用物可能通過組蛋白甲基化與MAF介導(dǎo)的全局染色質(zhì)打開有關(guān)，并且以前與癌癥有關(guān)。KDM1A在貝葉斯錯誤發(fā)現(xiàn)率（BFDR） < 0.001的相互作用組中進(jìn)行了顯著性分析（圖2c），它編碼一種黃素依賴的單胺氧化酶，可以去甲基化單和二甲基化賴氨酸（K），特別是組蛋白3和賴氨酸4和賴氨酸9 （H3K4和H3K9）。值得注意的是，高KDM1A活性存在于許多癌癥類型中，包括BCa。為了確定在MAF過表達(dá)的情況下，抑制KDM1A活性對E2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重布線的影響，作者在MCF7 BCa細(xì)胞中進(jìn)行了PLA測定和KDM1A和MAF的co-IP（圖7a）。與對照細(xì)胞相比，KDM1A敲除的細(xì)胞PLA信號明顯減少（具有短針亂置（shSc））（圖7a-c）。這些結(jié)果證實(shí)了MAF直接與KDM1A結(jié)合，并表明這種相互作用有助于促進(jìn)MAF - ER相互作用。

        為了分析KDM1A敲低是否會影響MAF/ E2介導(dǎo)的基因應(yīng)答，作者比較了HD與E2處理細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)（圖3a中簇5和6）（圖7d）。在MAF過表達(dá)的細(xì)胞中，作者觀察到缺乏KDM1A活性降低了E2/ ER誘導(dǎo)和MAF依賴性基因的表達(dá)（例如，FGF18, PTHLH, SOX9, TMEM2, JAK1和SHH）（圖7d,e），但其他基因沒有（圖7d,e）。綜上所述，這些結(jié)果表明KDM1A有助于MAF依賴性基因反應(yīng)，包括MAF/ E2依賴性基因反應(yīng)的一個子集。

KDM1A抑制破壞E2/ER和MAF依賴的信號傳導(dǎo)并阻止轉(zhuǎn)移

9、KDM1A阻斷可拮抗MAF依賴性轉(zhuǎn)移

        接下來，作者測試了KDM1A的高選擇性共價抑制劑iaddemstat （ORY -1001）是否可以阻斷MAF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。經(jīng)ORY-1001處理后，MCF7和mTB細(xì)胞顯示H3K9me2積累，顯示KDM1A去甲基化酶活性的功能性抑制（圖7f,g）。為了測試KDM1A抑制是否會阻止表達(dá)MAF的BCa細(xì)胞形成骨轉(zhuǎn)移，作者使用了體外骨培養(yǎng)陣列（BICA）。然后，作者將對照或表達(dá)Maf -的mTB細(xì)胞接種到免疫無能力的同基因小鼠（FVB背景）的脛骨中。值得注意的是，ORY -1001治療顯示骨病變的數(shù)量和大小均顯著減少，但僅在表達(dá)Maf的組（圖7i），這表明KDM1A介導(dǎo)的Maf表達(dá)細(xì)胞的表觀遺傳變化驅(qū)動了骨適應(yīng)和轉(zhuǎn)移。

結(jié)論：

        作者報(bào)告了一種以前未知的MAF-ER相互作用，這種相互作用是由表觀基因組機(jī)制驅(qū)動的，并有助于BCa臨床相關(guān)的轉(zhuǎn)移結(jié)果。這涉及MAF驅(qū)動的染色質(zhì)擾動，大大擴(kuò)展了ER轉(zhuǎn)錄范圍，超出了目前描述的目標(biāo)?？偟膩碚f，作者的研究結(jié)果支持E2存在下MAF擴(kuò)增后ER+BCa骨轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。重要的是，作者證明了在ER+腫瘤中，MAF的擴(kuò)增和過表達(dá)將典型細(xì)胞重新編程，使其包含以前未知的增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移。該程序重定向DNA可及性，并通過KDM1A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通道促進(jìn)轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明，染色質(zhì)失調(diào)是BCa轉(zhuǎn)移的早期事件，而基因組擴(kuò)增在這一過程中起著核心作用。作者的結(jié)果為探索KDM1A在這種臨床背景下的抑制作用打開了大門。

實(shí)驗(yàn)方法：

        Maf轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生；Southern blot；長PCR分析；細(xì)胞培養(yǎng)；小鼠Bca誘導(dǎo)腫瘤及衍生細(xì)胞外植體；MAF過表達(dá)細(xì)胞的產(chǎn)生；慢病毒加工；鄰近依賴生物素鑒定（BioID）；網(wǎng)絡(luò)分析；Dot-plot分析；BioID相互作用富集分析；免疫印跡法；免疫熒光；免疫共沉淀；聚乳酸實(shí)驗(yàn)；PROTAC用于目標(biāo)降解；RNA-seq；預(yù)處理和差異表達(dá)分析；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解的RNA-seq；RNA-seq（與敲除KDM1A后的樣品比較）；逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）；患者隊(duì)列的相關(guān)性和生存數(shù)據(jù)分析；體外BrdU摻入測定；組織病理學(xué)和免疫治化學(xué)；細(xì)胞增殖試驗(yàn)及半最大抑制濃度（IC50）測定；ATAC-seq；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解的ATAC-seq；ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)的整合；ER和MAF ChIP-seq；H3K27Ac和H3K4me3 ChIP-seq；ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)的整合；超增強(qiáng)子的識別和分配；CRISPRi；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞競爭試驗(yàn)；BICA。

參考文獻(xiàn)：

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