GPNMB+ Gal-3+ 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)免疫抑制和肝細(xì)胞癌發(fā)生

摘要：

        肝細(xì)胞癌（HCC）的形成是一個(gè)多步驟的病理過程，涉及異質(zhì)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的演變。然而，所涉及的特定細(xì)胞群及其起源和對 HCC 發(fā)展的貢獻(xiàn)仍然很大程度上未知。在這里，應(yīng)用全面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序來分析毒素誘導(dǎo)的肝臟腫瘤發(fā)生和 HCC 患者的大鼠模型。具體來說，我們鑒定了 HCC 進(jìn)展過程中出現(xiàn)的三個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群，稱為代謝肝細(xì)胞 (HCMeta)、具有分化潛力的 Epcam+ 群 (EP+Diff) 和免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化子集 (MTImmu)。這些不同的亞群形成了描繪肝癌發(fā)生動(dòng)態(tài)景觀的致癌軌跡，其特征基因反映了從 EP+Diff 到 MTImmu 的轉(zhuǎn)變。重要的是，GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞表現(xiàn)出惡性和免疫抑制特性。此外，SOX18是GPNMB+ Gal-3+ MTImmu細(xì)胞的生成和惡性轉(zhuǎn)化所必需的。研究發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 子集的富集與患者預(yù)后不良和較高的復(fù)發(fā)率相關(guān)?？偟膩碚f，我們揭示了單細(xì)胞 HCC 進(jìn)展圖譜，并發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ 實(shí)質(zhì)細(xì)胞是導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境的主要亞群，從而導(dǎo)致 HCC 惡性。該研究于2023年11月發(fā)表在《The EMBO journa》，IF：11.4。

技術(shù)路線：

結(jié)果:

1、scRNA-seq 鑒定出肝癌發(fā)生過程中具有免疫抑制能力的 MTImmu 細(xì)胞群

        為了研究惡性轉(zhuǎn)化過程中的分子和細(xì)胞特征，并探索 HCC 發(fā)展過程中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群的進(jìn)化路徑，我們對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、8、12、16 周）進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析 （圖 1A）。經(jīng)過質(zhì)量檢查，收集了 45,390 個(gè)來自大鼠肝組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。然后，我們使用統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）分析將所有細(xì)胞分類為T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞（GMP）、單核細(xì)胞（Mono）、樹突狀細(xì)胞（DC） 、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞 (pDC)、巨噬細(xì)胞 (Mφ)、中性粒細(xì)胞 (Neu)、成纖維細(xì)胞 (Fib)、基質(zhì)細(xì)胞 (SC)、膽管上皮細(xì)胞 (BEC) 和非惡性實(shí)質(zhì)細(xì)胞 (NMPC) --基于已知細(xì)胞譜系的特定標(biāo)記基因（圖 1B）。同時(shí)，通過推斷染色體拷貝數(shù)變異（CNV）來區(qū)分惡性細(xì)胞（圖1B）。

        接下來，我們收集了 NMPC 和惡性腫瘤，并通過聚類分析將它們分為 10 個(gè)亞群，以探索這兩種細(xì)胞類型之間潛在的中間狀態(tài)（圖 1C 和 D ）。簇 1-3 傾向于表達(dá)與肝細(xì)胞 (HC) 代謝相關(guān)的特征基因，例如 Pon1、Cps1 和 Hnf4a，而簇 4-6 高度表達(dá)分化相關(guān)標(biāo)記，包括 Epcam、Cd44、Cd24 和 Aldh1a1，顯示出強(qiáng)大的分化潛力（圖1E和F）?；谶@些觀察，我們在下文中分別將簇 1-3 和 4-6 表示為 HCMeta 和 EP+Diff（圖 1G）。簇 7-9 保留了一些 EP+Diff 特征（Cd44、Cd24 和 Aldh1a1），但它們特異性表達(dá)多種免疫抑制標(biāo)記物，例如 Cd274、Mgp、Grn 和 Lgals3，以及淋巴細(xì)胞和骨髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 招募趨化因子 Ccl5 和 Cxcl2（圖 1F）。鑒于其 EP+Diff 和惡性細(xì)胞的混合特性，我們將 C7-9 簇稱為免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化子集 MTImmu（圖 1E-G）。重要的是，隨著肝癌發(fā)生的發(fā)展，HCMeta群體逐漸縮小，而EP+Diff和MTImmu的比例在HCC進(jìn)展過程中以時(shí)間依賴性方式增加（圖1H），這表明建立腫瘤免疫抑制的動(dòng)態(tài)進(jìn)化模式微環(huán)境?？偠灾?，這些結(jié)果表明在肝癌發(fā)生過程中存在一種具有潛在干性和免疫抑制能力的新型 MTImmu 群體。

2、人與大鼠 HCC 相關(guān) MTImmu 的跨物種比較分析

        HCC 患者肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的本體發(fā)生和進(jìn)化仍然是一個(gè)尚未充分探索的領(lǐng)域。為此，我們采用 scRNA-seq 來研究從四名 HCC 患者的腫瘤 (T) 和鄰近腫瘤組織 (AT) 中分離的細(xì)胞（圖 2A）。我們通過推斷 CNV 將惡性細(xì)胞與總細(xì)胞區(qū)分開來。同時(shí)，通過常用的特征標(biāo)記來識別T細(xì)胞、B細(xì)胞、Mono、DC、漿細(xì)胞（PC）、Mφ、Fib、SC和NMPC（圖2B和C）。樣本中不同細(xì)胞類型的比例顯示，與 PCA 相比，腫瘤含有更多的 NMPC、Fib 和 Mφ，但 SC 和 T 細(xì)胞更少。

        接下來，我們匯集了所有 NMPC 和惡性細(xì)胞，隨后將它們分為 11 個(gè)簇（圖 2D 和 E）。與大鼠的基因表達(dá)譜類似，人類（hC1）簇1是典型的肝細(xì)胞（HC）代謝組（稱為HCMeta），其特征為HNF4A、PON1和AGXT（圖2F）。此外，hC2-4簇以分化相關(guān)基因（GSTA2、HES1、ALDH1A1和CD24）為特征，因此被稱為EP+Diff（圖2F和G）。在保留 EP+Diff 特征的同時(shí)，hC5-7 簇還表達(dá)參與 MDSC 和 Treg 趨化性、T 細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)和干細(xì)胞維持相關(guān)基因的基因，如 S100A9、CXCL17、GPNMB、CCL20、LGALS3 和 SOX4。 hC5-7簇似乎是EP+Diff和惡性細(xì)胞的混合狀態(tài)，因此我們將其稱為免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化（MT Immu）（圖2F和G）。hC9-11簇顯示出參與糖酵解和糖異生、細(xì)胞增殖、EMT、血管生成和脂質(zhì)積累的惡性腫瘤相關(guān)基因（PEG10、ENO3、CCNB1和UBE2C）的較高表達(dá)水平（圖2F和G）。

        根據(jù)大鼠和患者實(shí)質(zhì)細(xì)胞各亞群的特定基因表達(dá)模式，例如 HCMeta、EP+Diff 和 MTImmu（圖 1D-G 和 2E-G），我們使用 Garnett 評估了這些細(xì)胞的跨物種保守性(https://coletrapnell-lab.github.io/garnett/)，一種基于回歸的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器，用于識別細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)模式。作為原理證明，機(jī)器能夠預(yù)測具有非常高相關(guān)性分?jǐn)?shù)的相似子集。令人驚訝的是，機(jī)器檢測到大鼠和患者 MTImmu 子集具有非常高的相似性，特別是 C8、C9（大鼠）和 hC7（患者）（圖 2H）。此外，UMAP 顯示了特定基因的相似表達(dá)模式，例如 LGALS3、GPNMB、CD47 和 CD24，再次表明大鼠和患者之間 MTImmu 子集的保守性。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證更多HCC患者中是否存在相似的細(xì)胞簇，我們下載了HCC患者的原始數(shù)據(jù)（GSE112271、GSE151530、GSE210679和GSE149614）。合并10例患者的樣本（實(shí)質(zhì)細(xì)胞超過1000個(gè)細(xì)胞）。然后，我們使用已知的細(xì)胞譜系特異性標(biāo)記基因進(jìn)行 UMAP 分析。實(shí)質(zhì)細(xì)胞分為 11 個(gè)簇。我們觀察到，來自鄰近肝組織（N）的實(shí)質(zhì)細(xì)胞與腫瘤組織緊密纏繞，顯示出與我們當(dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)的相似的簇。肝臟代謝特征基因（HNF4A、CPS1和PON1）高表達(dá)的簇5,8；簇 2、4 呈現(xiàn)干細(xì)胞分化潛力基因（CD24、EPCAM、CD47、LGALS3 和 SOX4）；簇1、9和11過表達(dá)免疫抑制相關(guān)基因LGALS3和GPNMB，與LGALS3+ GPNMB+ MTIMMU子集極其相似（圖2F和G）。

3、MTImmu展示EP+Diff的潛在轉(zhuǎn)變

        為了縱向觀察惡性細(xì)胞的起源，我們進(jìn)行了 RNA 速度分析，并揭示了可能分別源自 EP+Diff 子集到 HCMeta 和 MTImmu 子集的多個(gè)分支的流形（圖 3A）。通過沿偽時(shí)間對細(xì)胞進(jìn)行著色，EP+Diff的分支主要位于軌跡樹的起始區(qū)域（①），最終在一個(gè)分支中演化為HCMeta（②），或者在另一個(gè)分支中直接轉(zhuǎn)化為MTImmu（③）（圖3B和D）。 MTImmu 在正常組（NOR）或 DEN 治療后早期時(shí)間點(diǎn)（4 或 8 周）的樣本中幾乎觀察不到，但在暴露于 DEN 12 和 16 周的大鼠中顯著增加（圖 3C 和 D）。

        此外，我們提取了從分支①到分支②的轉(zhuǎn)換中上調(diào)的基因。 GO分析顯示，與肝細(xì)胞功能相關(guān)的生物過程，如膽固醇代謝和穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)生物合成和運(yùn)輸，在分支②中富集。同時(shí)，分支①轉(zhuǎn)變?yōu)榉种Б鄣纳险{(diào)基因在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂和干細(xì)胞維持方面顯著富集。一致地，作為肝細(xì)胞功能指標(biāo)的幾個(gè)基因，包括 Pon、Cps1 和 Agxt，也在 HCMeta 中高表達(dá)（②，圖 3E）。干性相關(guān)基因 Mgp 和 Cd44 以及 Epcam 在 EP+Diff（①）和 MTImmu（③）中均富集；而 Lgals3、Gpnmb 和 Kdr 在 MTImmu 中特別升高（③，圖 3E）。

        接下來，我們檢查了 HCC 患者是否可以觀察到這些現(xiàn)象。事實(shí)上，RNA速度分析表明EP+Diff作為潛在的根轉(zhuǎn)化為HCMeta、MTImmu和惡性細(xì)胞，而MTImmu表現(xiàn)出更傾向于轉(zhuǎn)化為不同簇的惡性細(xì)胞，這可能解釋了肝癌的高度異質(zhì)性（圖3F） 。偽時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)，在從 EP+Diff 到 MTImmu 的潛在轉(zhuǎn)變過程中，與免疫抑制（LGALS3 和 GPNMB）和干性（SOX4、EPCAM 和 CD47）相關(guān)的基因逐漸升高（圖 3G），表明干性和MTImmu 的免疫抑制特性?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MTImmu具有免疫抑制和干細(xì)胞特性，并可能在HCC腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出EP+Diff的惡性轉(zhuǎn)化。

4、GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤能力

        為了驗(yàn)證 MTImmu 群體的存在并對其進(jìn)行功能表征，我們采用了通過外源注射原代 EPCAM+ 細(xì)胞并結(jié)合 DEN 治療誘導(dǎo)的大鼠 HCC 模型。我們從 GFP 標(biāo)記的胎肝（13.5 天）中分選了原代 EPCAM+ 細(xì)胞，并將其注射到用 DEN 預(yù)處理 2-5 周的雄性大鼠中。受體大鼠接受 DEN 治療 16 周，同時(shí)使用 0.9% NaCl 作為模擬對照。我們發(fā)現(xiàn)接受 EPCAM+ 細(xì)胞的大鼠早在植入后 12 周就出現(xiàn)了腫瘤，而對照組則沒有觀察到腫瘤。此外，DEN 治療后 16 周時(shí)，受體大鼠表現(xiàn)出更高的腫瘤發(fā)生率和更大的腫瘤尺寸。此外，通過蘇木精-伊紅染色，EPCAM+細(xì)胞注射組在12周或16周DEN誘導(dǎo)的大鼠中比對照組有更多更大的微觀損傷。

        為了研究將 EPCAM+ 細(xì)胞注射到肝臟中的效率及其隨后的命運(yùn)，我們檢查了注射后 2 周時(shí)肝臟中重新填充的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量。我們通過尾靜脈注射 1 × 108 GFP 標(biāo)記的 EPCAM+ 細(xì)胞 3 次。流式細(xì)胞術(shù)顯示，獲得的1.6×1010個(gè)細(xì)胞中，有5.26%（即8.4 × 108 個(gè)細(xì)胞）源自注射的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞，表明注射的 EPCAM+ 細(xì)胞在肝臟中駐留和擴(kuò)增。為了研究注射的 EPCAM+ 細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)，我們檢測了注射的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性和 MTImmu 群體的可能性。隨后，我們在 DEN 治療后 8 周和 16 周的時(shí)間點(diǎn)追蹤了受體大鼠中 GFP 標(biāo)記的 EPCAM+ 細(xì)胞。支持我們的假設(shè)的是，在 DEN 治療后 16 周時(shí)，發(fā)現(xiàn) Gal-3+ GPNMB+ (MTImmu) 和 AFP+（惡性腫瘤）細(xì)胞分別占 GFP 陽性細(xì)胞的 28.7% 和 14.2%。與這些結(jié)果一致，免疫熒光染色證實(shí)了受體大鼠腫瘤中 GFP 與 Gal-3、GPNMB 和 AFP 的共染色（圖 4A）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了 EPCAM+ 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為 GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞的可能性。

        為了用 MTImmu 表明 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞的身份，我們對 GPNMB+ Gal-3+ 和 GPNMB Gal-3 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。在 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞和 MTImmu 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組之間發(fā)現(xiàn)了很強(qiáng)的相關(guān)性，表明它們具有重疊的身份（圖 4B）。為了表征 MTImmu 細(xì)胞的分子特征和功能，我們篩選了 1,851 個(gè)在 GPNMB+ Gal-3+ 與 GPNMB Gal-3 細(xì)胞中上調(diào)的基因（圖 4C）。這 1,851 個(gè)基因在免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因集中顯著富集。一致地，免疫抑制配體和細(xì)胞干性相關(guān)基因在 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞中高表達(dá)，而 HCMeta 特征基因在 GPNMB Gal-3 細(xì)胞中高表達(dá)（圖 4D）。總之，這些結(jié)果表明 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞最有可能是 MTImmu 細(xì)胞。

        為了測試 MTImmu 亞群的干性，我們進(jìn)行了球體形成測定，發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞在 24 小時(shí)和 72 小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出比 GPNMB Gal-3 組更高的自我更新能力（圖 4E 和 F）。為了驗(yàn)證 GPNMB 和 Gal-3 對干性的作用，我們敲低 GPNMB 或 Gal-3 并進(jìn)行球體形成實(shí)驗(yàn)，以評估 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞 1 周后的自我更新能力。 EPCAM+細(xì)胞中Gal-3和GPNMB的敲低顯著降低了它們的球體形成效率（圖4G和H）。免疫熒光 (IF) 染色證實(shí)了 DEN 治療后 16 周時(shí) GFP 與 Gal-3 和 GPNMB 在大鼠腫瘤中的共定位（圖 4I）。此外，我們在EPCAM+細(xì)胞注射組中觀察到肺和結(jié)腸轉(zhuǎn)移的形成，并通過HE染色進(jìn)一步證實(shí)。與 16 周 DEN 誘導(dǎo)大鼠的腫瘤一致，IF 染色在肺和結(jié)腸轉(zhuǎn)移中顯示出 GFP 與 Gal3 和 GPNMB 共定位的強(qiáng)烈信號?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明 GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞在 HCC 原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性微環(huán)境中均具有干性特征。

5、GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞抑制 CD8+ T 細(xì)胞抗腫瘤免疫

        耗竭的 T (Tex) 和調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞參與免疫抑制和腫瘤進(jìn)展的事實(shí)已得到充分證實(shí)。我們根據(jù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)中標(biāo)記基因的差異表達(dá)，將來自不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的 T 細(xì)胞分為六個(gè)不同的亞群：自然殺傷 T (NKT)、Tex、終末分化效應(yīng)記憶 T細(xì)胞 (TEMRA)、naive T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (CTL) 和 Treg。為了驗(yàn)證 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞的免疫抑制活性，我們通過細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析破譯了 HCMeta、EP+Diff、MTImmu 和 T 細(xì)胞亞群之間的配體-受體 (L-R) 相互作用。正如預(yù)期的那樣，T 細(xì)胞（尤其是 Tex 和 Treg）與 MTImmu 細(xì)胞的相互作用次數(shù)比與 HCMeta 和 EP+Diff 細(xì)胞的相互作用更頻繁（圖 5B）。在MTImmu和Tex之間的強(qiáng)相互作用中，存在多個(gè)免疫抑制配體-受體對，例如Cd274-Pdcd1、Grn-Tnfrsf1b、Bag6-Ncr3和Cd112-Tigit（圖5C）。同時(shí)，在MTImmu和Treg之間發(fā)現(xiàn)了多對相互作用，包括Ccl5-Ccr5、CD274-Pdcd1、Icam1-Itgal和Crlf2-Tslpr。

        同樣，我們還從 HCC 患者的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中提取了 T 細(xì)胞，并將其分為七個(gè)亞群：NKT、Tex、記憶 T 細(xì)胞 (Mem T)、naive T、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (CTL)、黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（MAIT）和Treg（圖5D）。有趣的是，絕大多數(shù)T細(xì)胞被捕獲在鄰近的腫瘤組織（AT）中，而浸潤到腫瘤組織（T）的總T細(xì)胞明顯減少。此外，NKT、Cyto T、MAIT 和 Mem T 細(xì)胞幾乎只存在于鄰近腫瘤組織（AT）中，而腫瘤組織（T）中的大多數(shù) T 細(xì)胞是 Tex、Na?ve T 和 Treg（圖 5D）。 L-R相互作用分析表明T細(xì)胞與MTImmu細(xì)胞形成緊密的聯(lián)系（圖5E）。一組與免疫抑制相關(guān)的 L-R 對在 MTImmu 和 Tex 之間表現(xiàn)出較高水平，例如 TNFSF9-TNFRSF9、LGALS9-CD44、LGALS9-HAVCR2 和 PRR3-TIGHT（圖 5F）。同樣，免疫抑制相關(guān)的 L-R 對，包括 SPP1-CD44、SIRPG-CD47 和 LGALS9-CD44，在 MTImmu 和 Treg 之間顯著富集。這些結(jié)果表明MTImmu細(xì)胞可能通過直接與T細(xì)胞相互作用發(fā)揮免疫抑制功能。

        為了驗(yàn)證 MTImmu 細(xì)胞對 T 細(xì)胞的潛在免疫抑制作用，我們使用分選的 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞和大鼠血源性 CD45+ CD3+ T 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并評估 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子的情況（圖5G，左）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞共培養(yǎng)后，血液中 CD8+ IFNc+ (21.2%) 和 CD8+ GZMB+ (45.3%) T 細(xì)胞的比例分別急劇下降至 10.9 和 21.1%（圖5G 和 H）。相反，當(dāng)與 GPNMB Gal-3 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，T 細(xì)胞的比例沒有顯著改變（18.8% 和 33.3%）（圖 5G 和 H）。一致地，IF染色證實(shí)了腫瘤組織中GPNMB+ Gal-3+ MTImmu和PD1+ T細(xì)胞之間的共定位（圖5I）?？傊?，這些結(jié)果表明 MTImmu 在肝癌發(fā)生過程中具有免疫抑制能力。

6、SOX18在GPNMB+Gal-3+MTimu細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和免疫抑制能力中的作用

        為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子在GPNMB+Gal-3+MTImu細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的動(dòng)態(tài)變化，我們在大鼠和患者中進(jìn)行了單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理和聚類(SCENIC)分析。根據(jù)對HCMeta、EP+diff和MTImu的TF活性的比較，我們在大鼠和肝細(xì)胞癌患者中確定了MTImu特異性的TF網(wǎng)絡(luò)，包括Jun、Egr1和MYC，它們已被證明與免疫抑制活性有關(guān)(圖6A和圖B)。重要的是，這項(xiàng)分析還發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的調(diào)節(jié)基因HDAC2、SOX18和TEAD2，在大鼠和肝細(xì)胞癌患者的MTImu中顯示出更高的調(diào)節(jié)活性(圖6A和B)。接下來，我們對MTImu亞群中SOX18和TEAD2的活性進(jìn)行了評分，并觀察到大鼠肝細(xì)胞癌模型中的MTImu與肝細(xì)胞癌患者的MTImu之間具有高度一致性(圖6C)。

        為了驗(yàn)證這些因子在MTImu相關(guān)干性中的調(diào)節(jié)作用，我們使用siRNA敲擊法耗盡每個(gè)TF，并進(jìn)行球體形成實(shí)驗(yàn)來評估GPNMB+Gal-3+MTImu細(xì)胞的球體大小和形成效率。Sox18、YAP和HDAC2的耗盡顯著降低了球體的形成效率(圖6D和E)。此外，Lgals3在Sox18和Tead2被擊倒后下調(diào)，而GPNMB在HDAC2和Sox18被擊倒后下調(diào)。為了驗(yàn)證SOX18在免疫抑制中的作用，我們在GPNMB+Gal-3+細(xì)胞中進(jìn)行了SOX18基因敲除和挽救實(shí)驗(yàn)，并將其與血源性CD45+CD3+T細(xì)胞共同培養(yǎng)。事實(shí)上，與SOX18基因敲除的GPNMB+Gal-3+共培養(yǎng)顯著增加了CD8+GZMB+T細(xì)胞的百分比(6.22vs.。13.7%)，而耗竭CD8+PD-1+T細(xì)胞比例(9.24%比6.41%)降低。值得注意的是，在GPNMB+Gal-3+細(xì)胞中重新引入SOX18顯著降低了CD8+GZMB+T細(xì)胞的比例至9.13%，并有效地將耗盡的CD8+PD-1+T細(xì)胞恢復(fù)到15.6%(圖6F和G)。綜上所述，這些結(jié)果再次證實(shí)了SOX18在GPNMB+Gal-3+細(xì)胞的干性和免疫抑制中的重要作用。

        為了進(jìn)一步評估 Sox18 在 EPCAM+ 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用，我們將大約 1 × 10 8 EPCAM+ 細(xì)胞（WT 或通過慢病毒敲低 SOX18）注射到 DEN 治療的雄性大鼠中（圖 6H 和 I）。 DEN 治療后 16 周時(shí)，SOX18 敲低組的腫瘤形成發(fā)生率和腫瘤大小均較 WT 組顯著減?。▓D 6H 和 I）。在腫瘤中 GFP+ 標(biāo)記的細(xì)胞中觀察到 SOX18 與 Gal-3 和 GPNMB 的共染色（圖 6J）。此外，Gal-3和帶有GFP+標(biāo)記的細(xì)胞的GPNMB在SOX18敲低樣品中處于較低水平（圖6J）。此外，我們在 DEN 治療后 8 周或 12 周至 16 周期間通過 Sm4（一種已知的 SOX18 小分子抑制劑）抑制 SOX18。值得注意的是，為了評估 SOX18 對腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的作用，我們獲得了 DEN 暴露后 12 周和 16 周的肝組織。我們發(fā)現(xiàn)從第 8 周開始接受 Sm4 治療的大鼠的癌前病變明顯少于模擬組，在 DEN 治療后第 12 周，模擬組顯示出幾個(gè)小的、白色的囊腫樣病變，這表明 SOX18 的抑制顯著抑制了癌前病變的發(fā)生。 HCC。從 12 周開始接受 Sm4 治療的大鼠并未出現(xiàn)與模擬組一樣嚴(yán)重的腫瘤，這表明 SOX18 的抑制顯著抑制了 HCC 進(jìn)展。此外，在暴露于 DEN 16 周后的大鼠中，從 8 周開始抑制 SOX18 顯著減弱了內(nèi)源性 EPCAM+ 細(xì)胞的擴(kuò)增及其與 Gal-3、GPNMB 和 AFP 的共染色。從第 12 周開始抑制 SOX18 并沒有顯著抑制內(nèi)源性 EPCAM+ 細(xì)胞的擴(kuò)增，但在 16 周后暴露于 DEN 的大鼠中顯著降低了 EPCAM+ 細(xì)胞與 Gal-3、GPNMB 和 AFP 的共表達(dá)。結(jié)果驗(yàn)證了SOX18在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展以及EPCAM+細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的重要作用。

        隨后的綜合分析結(jié)合了 MTImmu 中上調(diào)的 1,400 個(gè)基因和 SOX18 的 1,746 個(gè)靶基因，確定了 353 個(gè)重疊基因。免疫抑制相關(guān)基因，包括 Ccl5、S100a9、Gpnmb、Cd274、Lgals3 和 Mgp在 MTImmu 中明顯增加。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (ChIP-qPCR) 測定表明 SOX18 有效結(jié)合 Cd274、S100a9 和 Cxcl2 的啟動(dòng)子區(qū)域。此外，缺乏 SOX18 時(shí)這些基因的表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明，SOX18是GPNMB+ Gal-3+ MTImmu亞群在惡性轉(zhuǎn)化過程中獲得免疫抑制能力所必需的。

7、SOX18、GPNMB和Gal-3的高表達(dá)與肝癌惡性程度的關(guān)系

        為了評估 SOX18、GPNMB 和 Gal-3 在 HCC 中的臨床相關(guān)性，我們首先使用癌癥基因組圖譜 (TCGA) 的 HCC 數(shù)據(jù)集分析了 SOX18、GPNMB 和 LGALS3 (Gal3) 的表達(dá)。與鄰近腫瘤組織（n = 160，圖 7A）相比，HCC 患者（n = 369）腫瘤中 SOX18、GPNMB 和 LGALS3 的 mRNA 水平均顯著增加。此外，GPNMB和LGALS3之間觀察到強(qiáng)烈的正相關(guān)性（R2 = 0.11，P = 0.043），以及GPNMB和SOX18表達(dá)之間（R2 = 0.2，P < 0.0001）（圖7B）。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證 SOX18、GPNMB 和 Gal-3 (LGALS3) 的預(yù)后價(jià)值，我們對 157 例具有長期臨床隨訪記錄的 HCC 病例的組織微陣列進(jìn)行了這些蛋白的 IF 染色。值得注意的是，在鄰近腫瘤組織 (AT) 中觀察到 GPNMB、Gal-3 的表達(dá)升高以及與 SOX18 的共染色模式（圖 7C）。同時(shí)，在腫瘤（T）中也觀察到高蛋白水平的 GPNMB、Gal-3 以及與 SOX18 的共染色模式（圖 7D）。 GPNMB和Gal-3的表達(dá)與HCC患者的高復(fù)發(fā)率相關(guān)（P = 0.02）（圖7E）。此外，GPNMB和Gal-3水平高的HCC患者生存時(shí)間較短，而GPNMB和Gal-3水平低的HCC患者生存時(shí)間較長（圖7F）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明 GPNMB 和 Gal-3 上調(diào)與 HCC 復(fù)發(fā)和不良預(yù)后存在病理關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)方法：

        scRNA-seq、SCENIC分析、RNA速率分析、RT-PCR、ChIP-qPCR、慢病毒敲除。

參考文獻(xiàn)：

        Meng Y, Zhao Q, Sang Y, et al. GPNMB+ Gal-3+ hepatic parenchymal cells promote immunosuppression and hepatocellular carcinogenesis. EMBO J. Published online November 27, 2023.