腫瘤微環(huán)境新焦點——腫瘤內(nèi)微生物鐮刀菌通過 GLUT1 驅(qū)動的乳酸產(chǎn)生促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展

        口腔鱗狀細(xì)胞癌 （OSCC） 是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 （HNSCC） 的一種普遍亞型。盡管 OSCC 的診斷和治療取得了進(jìn)展，但由于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，5年生存率仍然很低。除了遺傳、表觀遺傳和基質(zhì)微環(huán)境因素外，組織內(nèi)微生物群的特征與癌癥的標(biāo)志有關(guān)，包括風(fēng)險、病理類型和預(yù)后。同樣，鑒于 OSCC 起源于富含微生物群的口腔，微生物群作為調(diào)節(jié) OSCC 進(jìn)展的不可忽略的潛在介質(zhì)出現(xiàn)。F. nucleatum （鐮刀菌）是一種革蘭氏陰性厭氧菌，與其他口腔細(xì)菌相比，被認(rèn)為是一種主要的促腫瘤細(xì)菌。然而，作為OSCC微生物群的組成物種，鐮刀菌如何影響OSCC的進(jìn)展仍未被探索。

        先前的研究表明，鐮刀菌凝集素 Fap2 識別宿主 N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc），這是一種在細(xì)胞表面表達(dá)的糖蛋白，通過碳水化合物部分介導(dǎo)細(xì)菌與腫瘤細(xì)胞之間的結(jié)合，并幫助該細(xì)菌大量定位于腫瘤組織中。先前的研究表明，鐮刀菌凝集素 Fap2 識別宿主 N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc），這是一種在細(xì)胞表面表達(dá)的糖蛋白，通過碳水化合物部分介導(dǎo)細(xì)菌與腫瘤細(xì)胞之間的結(jié)合，并幫助該細(xì)菌大量定位于腫瘤組織中。然而，這些已確定的機(jī)制僅限于細(xì)胞內(nèi)的生理病理過程，無法解釋與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的微環(huán)境的影響。鐮刀菌定植被認(rèn)為會引發(fā)急性先天免疫反應(yīng)，尤其是微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞浸潤。鑒于 M2 樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 （TAM） 在促進(jìn)腫瘤侵襲中至關(guān)重要，這些報告表明，鐮刀菌驅(qū)動的微環(huán)境巨噬細(xì)胞活化可能與促進(jìn)腫瘤侵襲有關(guān)。

        近期，題名為：F. nucleatum facilitates oral squamous cell carcinoma progression via GLUT1-driven lactate production的研究文章發(fā)表在EBioMedicine，文章主要表明 F.nucleanum對OSCC微環(huán)境的影響及其與OSCC進(jìn)展的相關(guān)性。我們在OSCC樣品中鑒定出F.nucleanum是一種高度富集的物種。F.有核細(xì)胞傾向于定植在OSCC的侵襲邊緣。機(jī)制分析表明，F.nucleanum通過激活GalNAc自噬-TBC1D5信號軸，促進(jìn)質(zhì)膜和糖酵解中葡萄糖轉(zhuǎn)運1（GLUT1）的聚集，GLUT1是細(xì)胞葡萄糖攝取和代謝的關(guān)鍵限速因子，導(dǎo)致細(xì)胞外乳酸沉積和M2樣TAMs的形成。GalNAc和GLUT1的同時抑制導(dǎo)致微環(huán)境中M1樣抗腫瘤巨噬細(xì)胞的形成和OSCC進(jìn)展的消退。這些發(fā)現(xiàn)為晚期OSCC患者的靶向治療策略提供了新的前景。

鐮刀菌聚集在 OSCC 的侵襲性邊緣，并與腫瘤侵襲相關(guān)

        為了確定 鐮刀菌 定植與 OSCC 進(jìn)展之間的相互關(guān)系，分析了來自兩個代表性隊列的 16S rRNA 測序數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，鐮刀菌是OSCC組織中定植最普遍的病原體之一，在75.7%的OSCC樣本中觀察到有鐮刀菌亞種，在鄰近正常組織中，鐮刀菌的患病率顯著降低2.25倍。這些結(jié)果表明，鐮刀菌 定植與 OSCC 進(jìn)展之間存在明顯的相關(guān)性。FISH檢測OSCC 組織中鐮刀菌表達(dá)發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌通常聚集在所有類型的OSCC的侵襲邊緣，動物實驗表明鐮刀菌促進(jìn)腫瘤生長和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）生物標(biāo)志物SOX2、ZEB1和N-cad表達(dá)。

定植的鐮刀菌驅(qū)動 M2 樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的形成

        為了確定 鐮刀菌 是否通過 M2 樣 TAM 促進(jìn) OSCC 侵襲，在OSCC臨床樣本檢測鐮刀菌與與CD68和CD206的共表達(dá)。CD206（+） M2樣巨噬細(xì)胞在單位視圖中顯示出與鐮刀菌的主要重疊，表明 鐮刀菌 接種能夠促進(jìn) CD206+ M2 樣 TAM 的形成。通過使用氯膦酸脂質(zhì)體消除巨噬細(xì)胞，有效逆轉(zhuǎn)鐮刀菌介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中的 鐮刀菌 可以促進(jìn) CD206+ M2 樣TAM的形成，這對 鐮刀菌 誘導(dǎo)的 OSCC 侵襲具有潛在重要性。

鐮刀菌誘導(dǎo)的OSCC細(xì)胞乳酸產(chǎn)生是M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞形成所必需的

        為了剖析 鐮刀菌 促進(jìn) M2 樣 TAMs 形成的潛在機(jī)制，細(xì)胞外酸化在 鐮刀菌 聚集的 OSCC 侵襲邊緣和體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。代謝組學(xué)分析，以獲得鐮刀菌暴露的OSCC細(xì)胞差異代謝物途徑富集分析顯示碳代謝顯著。葡萄糖消耗量、乳酸、丙酮酸和ATP合成成比例上升。

        為了探討乳酸沉積是否可以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中M2樣TAMs的形成，我們添加了乳酸代謝抑制劑2-DG來抑制OSCC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中的乳酸沉積。數(shù)據(jù)顯示，2-DG逆轉(zhuǎn)了鐮刀菌介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2樣極化?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)支持了 鐮刀菌 促進(jìn) OSCC 細(xì)胞糖酵解和乳酸產(chǎn)生，這反過來又增加了細(xì)胞外酸化和 M2 樣 TAM 的形成。

鐮刀菌誘導(dǎo)的 GLUT1 積累增加 OSCC 細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生

        為了闡明鐮刀菌感染如何增加OSCC細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生，研究了鐮刀菌暴露的OSCC細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解限速酶的表達(dá)。值得注意的是，在OSCC組織中高表達(dá)的GLUT1在鐮刀菌刺激下上調(diào)約3倍。基于上述暴露于鐮刀菌的OSCC細(xì)胞的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的功能富集分析一致地表明，與GLUT1相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運是最重要的。臨床OSCC樣本結(jié)果表明GLUT1 主要富集于 OSCC 侵襲邊緣，并與 鐮刀菌 共定植。鐮刀菌誘導(dǎo)的乳酸產(chǎn)生可能與OSCC細(xì)胞中GLUT1的上調(diào)相關(guān)。

鐮刀菌誘導(dǎo)的 TBC1D5 下調(diào)促進(jìn) GLUT1 在細(xì)胞表面的定位

        為了描述鐮刀菌介導(dǎo)的 GLUT1 上調(diào)的原因，首先GLUT1 在鐮刀菌孵育的 OSCC 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，PCR結(jié)果無差異；然而，免疫熒光染色顯示，與對照細(xì)胞相比，鐮刀菌孵育細(xì)胞表面的GLUT1蛋白更多。WB檢測膜相關(guān)GLUT1顯著升高。表明 GLUT1 的蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞表面定位均增加。

        為了確定蛋白質(zhì)翻譯的上調(diào)是否是上述表型的原因，CHX的應(yīng)用不能在一定時期內(nèi)逆轉(zhuǎn)鐮刀菌介導(dǎo)的GLUT1上調(diào)，表明 鐮刀菌 介導(dǎo)的 GLUT1 積累可能是由蛋白質(zhì)降解抑制引起的。GLUT1 與溶酶體相關(guān)膜糖蛋白 1 （LAMP1） 在 鐮刀菌 暴露的 OSCC 細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)分布。免疫熒光染色顯示 GLUT1 在 鐮刀菌暴露細(xì)胞，支持鐮刀菌可能抑制GLUT1溶酶體降解。TBC1D5 在 鐮刀菌 孵育的 OSCC 細(xì)胞中下調(diào) TBC1D5過表達(dá)抵消了OSCC細(xì)胞中鐮刀菌誘導(dǎo)的GLUT1上調(diào)。這些觀察結(jié)果表明，鐮刀菌通過下調(diào) TBC1D1 促進(jìn)細(xì)胞表面存在 GLUT5。