腫瘤來源的細胞因子CHI3L1誘導中性粒細胞胞外誘捕網促進三陰性乳腺癌的T細胞排斥

        免疫療法徹底改變了癌癥治療，并正在迅速成為癌癥治療的基石。盡管免疫檢查點阻斷（ICB）在多種癌癥類型中取得了成功，但其在三陰性乳腺癌（TNBC）患者中的有限成功凸顯出研究者需要更好地了解腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）及其調節(jié)因子。通過分析T細胞數量及其空間分布，TNBC根據CD8+細胞毒性T細胞浸潤的模式被細分為不同的亞型。闡明T細胞的基質限制機制是刺激T細胞介導的免疫和改善患者結局的關鍵。信號轉導和轉錄激活因子（Stat）家族是調控TIME的一個關鍵信號通路。事實上，在表達與Cre重組酶（MIC）相關的多瘤病毒中T（PyMT）癌基因的多西環(huán)素誘導的基因工程小鼠模型（GEMM）中，乳腺上皮STAT3的消融并不影響腫瘤的啟動，而是促進免疫介導的腫瘤消除。MIC模型通過不同的組織學階段發(fā)展乳腺腫瘤，模擬人類乳腺癌從增生到轉移癌的進展。然而，STAT3缺陷的病變會消退，并被CD8+ T細胞和M1巨噬細胞驅動的穩(wěn)健免疫應答消除。免疫抑制的確切STAT3依賴機制仍不清楚。在腫瘤細胞中，與免疫抑制相關的一個直接STAT3轉錄靶點是細胞因子幾丁質酶-3樣1（CHI3L1）。CHI3L1是乳腺癌疾病侵襲性和腫瘤分級的生物標志物。CHI3L1可使巨噬細胞極化為M2狀態(tài)，并促進多種實體癌的轉移。然而，其對其他免疫細胞的作用以及在TNBC中的作用仍有待探索。該研究發(fā)表在《Immunity》，IF：32.4。

技術路線：

主要研究結果：

1. 在STAT3缺陷的病變中CHI3L1表達降低

        為了闡明STAT3依賴的免疫抑制機制，使用RNA測序比較了野生型和STAT3缺陷的MIC病灶在多西環(huán)素誘導后2周的轉錄譜。在STAT3缺陷性病變中表達差異最大的基因是CHI3L1，它編碼分泌的細胞因子CHI3L1（圖1A），而CHI3L1是STAT3的直接靶點，具有明確的免疫抑制特性。分別使用qPCR和免疫印跡證實了CHI3L1在mRNA和蛋白水平的差異表達（圖1B-D）。由于CHI3L1可由多種細胞類型產生，研究者利用RNA原位雜交確定了野生型MIC病變中CHI3L1的細胞來源。大多數CHI3L1 mRNA在增生的上皮細胞中檢測到，而這一信號在STAT3缺陷的病變中丟失（圖1E，F）。相比之下，基質細胞很少表達CHI3L1，其表達不受上皮中STAT3缺失的影響（圖1G）。因此，在MIC GEMM中，CHI3L1主要由增生的上皮細胞以STAT3依賴的方式產生。

        癌癥基因組圖譜分析表明，CHI3L1表達在許多人類癌癥中升高，包括肺癌、結直腸癌、食管癌、膠質母細胞瘤和基底乳腺癌等。由于基底腫瘤是典型的三陰性腫瘤，研究者使用免疫熒光染色檢測了CHI3L1在不同的TNBC免疫亞型中的表達。CHI3L1表達在SR亞組中最高（圖1H，I）。在SR亞型中，CHI3L1表達遵循雙峰分布，即一些腫瘤高表達CHI3L1，而其他腫瘤低表達CHI3L1（圖1I）。對三陰性乳腺癌樣本進行活化p-STAT3染色，觀察到CHI3L1表達和p-STAT3之間呈正相關（圖1J-L）。CHI3L1水平升高的SR腫瘤有較高的p-STAT3（圖1J）。

圖1 CHI3L1是STAT3依賴的腫瘤衍生因子

2. CHI3L1表達與多種癌癥類型中T細胞的間質限制相關

        由于SR腫瘤的特征是腫瘤巢內排除CD8+ T細胞，因此研究者研究了CHI3L1是否可能是促進這一現象的腫瘤衍生因子。通過將針對CHI3L1的RNA熒光原位雜交（FISH）與CD4和CD8的免疫熒光染色相結合，研究者觀察到輔助性和細胞毒性T細胞在空間上局限于間質，無法浸潤WT MIC乳腺中的CHI3L1+病灶（圖2A-D）。CD4+和CD8+ T細胞與CHI3L1+細胞的距離均隨著CHI3L1轉錄本的增加而增加，表明存在潛在的劑量依賴性排斥（圖2B，D）。與此一致，對TNBC腫瘤進行的免疫組織化學(IHC)分析表明，細胞毒性T細胞和輔助性T細胞位于CHI3L1+腫瘤的遠端（圖2E-G）。研究者還觀察到CHI3L1在TNBC中的異質性表達;同一腫瘤有CHI3L1高表達區(qū)域，而CHI3L1陰性區(qū)域和CHI3L1表達區(qū)域顯示T細胞基質限制（圖2E）。在TNBC腫瘤中，CHI3L1表達與輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的腫瘤浸潤呈負相關（圖2H，I）。

        接下來，研究者評估了其他癌癥類型中CHI3L1表達和T細胞排斥之間的關系。多器官癌組織芯片的多重免疫熒光分析表明CHI3L1在肺癌中表達。與研究者在TNBC中的觀察結果一致，CHI3L1+肺腫瘤區(qū)域排除了細胞毒性T細胞和輔助性T細胞（圖2J-L）。研究者觀察到CHI3L1水平與浸潤的T細胞呈負相關（圖2K，L）。盡管樣本量較小，但在結腸癌中也觀察到類似趨勢（圖2J）。綜上所述，這些數據表明，依賴CHI3L1的T細胞間質限制是這些上皮癌的共同特征。

圖2 T細胞被排除在CHI3L1+腫瘤中

3. CHI3L1的缺失破壞了乳腺腫瘤的發(fā)生，延緩了腫瘤的進展

        為了闡明CHI3L1在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用，研究者利用基于crispr的基因編輯技術產生了Friend virus B CHI3L1缺陷（CHI3L1-/-）動物（圖3A）。在雌性MIC CHI3L1完整和缺陷小鼠隊列中，通過多西環(huán)素治療2周誘導腫瘤，研究者觀察到STAT3缺陷系統(tǒng)的整體免疫變化。使用免疫印跡分析證實CHI3L1蛋白缺失，并且STAT3表達或活化沒有隨之增加（圖3B），表明STAT3活性在chi311缺陷背景中是完整的。

        對2周誘導的乳腺的組織學分析顯示，CHI3L1缺失后，乳腺上皮增生減少（圖3C-F）。與CHI3L1完整的乳腺中觀察到的充滿的導管上皮內瘤樣結構相比，CHI3L1缺陷的乳腺導管有明顯的管腔，上皮總量減少（圖3C-F）。雖然CHI3L1+/+小鼠在誘導后6周出現可觸及的腫瘤，但CHI3L1-/-小鼠有殘留增生，上皮內容物總量減少（圖3G-J）。研究者一致觀察到，在CHI3L1-/-小鼠中，可觸及的乳腺腫瘤發(fā)生延遲（圖3I，J）。綜上所述，這些觀察結果表明CHI3L1在乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用。

        考慮到模型的生殖細胞系性質，有必要研究上皮而非間質室中的CHI3L1缺失是否導致了腫瘤進展的延遲。研究者將未經多西環(huán)素處理的CHI3L1缺陷乳腺移植到同系CHI3L1完整受者（CHI3L1-/- TX WT）清除后的乳腺脂肪墊中誘導2周。在該模型中，只有供體上皮缺乏CHI3L1，而CHI3L1的基質來源完整（圖3K）。受體乳腺組織學表型為MIC CHI3L1缺陷的腺體，其中導管有明顯的空腔（圖3L，M）。相比之下，移植到CHI3L1缺陷宿主（WT TX CHI3L1?/?）中的CHI3L1+/+ MIC乳腺表現出充滿的導管上皮內腫瘤結構（圖3K-M）。因此，上皮細胞是CHI3L1的主要來源，而基質細胞中CHI3L1的缺失不能解釋對腫瘤進展的影響。

圖3 CHI3L1消融扭曲了乳腺腫瘤的發(fā)生，延緩了腫瘤的進展

4. CHI3L1產生免疫抑制的TIME，從而驅動腫瘤進展

        鑒于STAT3缺陷的MIC小鼠表現出由主動免疫應答驅動的腫瘤進展嚴重延遲，研究者評估了在CHI3L1-/-小鼠中觀察到的乳腺腫瘤發(fā)展缺陷是否與主動抗腫瘤免疫應答相關。通過免疫熒光染色，研究者觀察到與CHI3L1+/+乳腺相比，CHI3L1-/-乳腺中的總免疫細胞（CD45+）增加（圖4A，B）。與CHI3L1促進巨噬細胞向M2狀態(tài)極化的作用一致，研究者觀察到在CHI3L1消融后，M2巨噬細胞（F4/80+ CD206+）丟失，M1巨噬細胞（F4/80+ p-Stat1+）相應增加，但巨噬細胞總計數無變化（圖4C-G）。此外，與CHI3L1+/+乳腺相比，CHI3L1?/?乳腺富含總T細胞(CD3+細胞)、細胞毒性T細胞（CD3+ CD8+）和輔助性T細胞（CD3+ CD4+）（圖4H-N）。研究者還觀察到通過PD1和顆粒酶B表達評估的T細胞活化增加（圖4H-P）。需要注意的是，PD1是T細胞活化的標志物，但在其配體PD-l1存在的情況下也可表明T細胞耗竭。在該模型中，PD1的表達遵循與顆粒酶B（經典的T細胞活化標志物）相似的模式?？傮w而言，研究者的數據表明，CHI3L1缺失后觀察到的腫瘤進展延遲與活化的CD8+、CD4+ T細胞和M1巨噬細胞參與的主動抗腫瘤免疫應答的募集相關。

        綜上所述，這些藥理學和遺傳學數據表明，CHI3L1是一種主要的免疫抑制細胞因子，通過驅動M2巨噬細胞極化、抑制T細胞募集和活化來支持腫瘤進展。

圖4 CHI3L1消融改變了腫瘤免疫微環(huán)境

5. CHI3L1介導T細胞間質限制促進腫瘤生長

        鑒于研究者觀察到表達CHI3L1的病變周圍的T細胞排斥，研究者對CHI3L1消融后的T細胞進行了多重免疫熒光空間分析。對CHI3L1缺陷性病變所做的分析表明，與CHI3L1完整性病變相比，腫瘤巢浸潤的細胞毒性T細胞及其活化的對應細胞增多（圖5A-C）。對于在CHI3L1缺陷型增生性病變中顯著富集的輔助性T細胞，研究者也觀察到類似結果（圖5D-F）。與基因消融一致，抗CHI3L1治療富集了腫瘤浸潤的細胞毒性T細胞和輔助性T細胞（圖5G-L）。

        鑒于T細胞排斥會導致對免疫療法的耐藥，研究者接下來評估了CHI3L1缺失可否改善對pd1阻斷的應答。為了實現這一目標，研究者將CHI3L1完整和缺陷的PyMT腫瘤移植到同系小鼠的乳腺脂肪墊中，并使用抗PD1或IgG2a對照進行治療。與之前的報告一致，CHI3L1-精通的PyMT腫瘤對抗PD1耐藥（圖5M，N）。相比之下，CHI3L1缺陷的腫瘤對抗PD1的應答改善，這一點可以通過其較慢的生長速度來證明（圖5M）。

        為了評估針對CHI3L1的治療靶點是否對免疫治療應答產生類似影響，研究者使用抗CHI3L1中和抗體、抗PD1或兩者聯(lián)合治療了CHI3L1陽性的PyMT腫瘤。雖然抗CHI3L1單藥治療未影響腫瘤生長，但研究者觀察到與抗PD1聯(lián)合治療有顯著的協(xié)同反應，導致腫瘤生長較慢（圖5N）。綜上所述，這些數據表明CHI3L1促進T細胞的基質限制，靶向CHI3L1是一種可行的治療策略，以增強T細胞浸潤和改善ICB反應。

圖5 基因和藥物消融CHI3L1可緩解T細胞的基質限制，并改善對免疫治療的應答

6. CHI3L1促進中性粒細胞募集和NET形成

        除了改變適應性免疫細胞外，中性粒細胞還通過NETosis促進免疫抑制。NETs通過在腫瘤周圍形成物理屏障，在癌癥進展、免疫抑制、轉移和T細胞排斥中發(fā)揮重要作用。為了評估CHI3L1對中性粒細胞的影響，研究者將Ly6G作為中性粒細胞的一般標志物，同時將髓過氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化H3（CitH3）作為NETosis的標志物。CHI3L1缺失減少了總中性粒細胞和接受NETosis的中性粒細胞（Ly6G+ MPO+ CitH3+）（圖6A-E）。這一點在免疫印跡分析中得到了進一步證實。此外，人類TNBC的IHC分析表明CHI3L1表達和中性粒細胞之間呈正相關（圖6F，G）。

        雖然這些結果表明CHI3L1在中性粒細胞募集和NETosis中具有潛在的功能作用，但研究者使用小鼠中性粒細胞和人類早幼粒細胞白血病細胞系（HL-60）在體外獨立地驗證了這一點。為了實現這一目標，研究者對小鼠中性粒細胞進行了transwell遷移實驗，以評估其向含有重組小鼠CHI3L1（rmCHI3L1）或PBS對照的培養(yǎng)基的遷移。結果顯示對rmCHI3L1的強烈遷移反應（圖6H，I）。這些數據表明CHI3L1是一個強的趨化刺激，促進中性粒細胞募集。

        為了進一步研究CHI3L1在NET形成中的作用，在rmCHI3L1存在的情況下培養(yǎng)原代小鼠中性粒細胞。通過免疫熒光染色檢測到rmCHI3L1刺激導致了CitH3-DNA復合物的擠出(圖6J-L)。綜上所述，這些發(fā)現表明CHI3L1在中性粒細胞募集和NETosis中起著關鍵作用。

        對人TNBC和MIC樣本進行的免疫熒光分析表明，CD8+ T細胞與CHI3L1+上皮被一層MPO+細胞分離（圖6M，N），這表明正如之前證明的那樣，中性粒細胞密切促進T細胞排斥。

圖6 CHI3L1促進中性粒細胞募集和NET形成

7. CHI3L1誘導的間質限制是通過NETosis介導的

        誘導2周時的組織學分析表明，與CHI3L1缺陷的乳腺相似，與igg2a治療的對照小鼠相比，清除中性粒細胞的MIC腺體的導管上皮內瘤變減少（圖7A，B）。中性粒細胞清除組的大多數導管有空腔，而對照組的導管充滿（圖7A-C）。鑒于CHI3L1促進巨噬細胞極化，以及它們在T細胞排斥中的作用，因此評估巨噬細胞是否參與了CHI3L1的促腫瘤功能至關重要。與之前的報道一致，抗csf1r（集落刺激因子1受體）或抗f4 /80抗體治療減少了巨噬細胞頻率，但未影響乳腺導管增生（圖7A-C）。此外，抗Ly6G治療減少了總體增生面積（圖7A-C）。這些數據表明，巨噬細胞在誘導乳腺病變中是不需要的，而中性粒細胞是CHI3L1在MIC GEMM中促腫瘤功能的主要中介。

        為了進一步研究中性粒細胞在T細胞基質限制中的作用，研究者對中性粒細胞缺失的乳腺和對照乳腺進行CHI3L1的RNA FISH分析，并結合CD4和CD8染色。此外，之前觀察到的CHI3L1+病變周圍的T細胞排斥在清除中性粒細胞后消失（圖7D-G）。綜上所述，研究者的結果表明，腫瘤來源的CHI3L1協(xié)同中性粒細胞介導T細胞排斥。

        為了評估NETosis的相對作用，研究者用DNA酶、蛋白質精氨酸脫亞胺酶4抑制劑（PAD4i）、GSK484或溶劑對照處理MIC小鼠。與抗Ly6G治療的乳腺類似，研究者觀察到PAD4i和dnase治療的乳腺增生減少，導管未閉上皮內瘤變增加（圖7H-J）。與抗Ly6G治療相似，抑制NETosis使T細胞不再被排斥出CHI3L1+病變（圖7K-N）。與之前的研究一致，不受PAD4i或DNase處理影響的中性粒細胞功能不會促進CHI3L1介導的T細胞排斥。這些發(fā)現支持CHI3L1直接誘導NETs促進T細胞排斥的觀點（圖7O）。

圖7 靶向中性粒細胞消除了CHI3L1誘導的T細胞間質限制，扭曲了腫瘤發(fā)生

結論：

        該研究表明，分泌的細胞因子CHI3L1產生的免疫抑制TIME在M2巨噬細胞和中性粒細胞中豐富，但缺乏活化的T細胞。此外，CHI3L1可直接誘導NETosis，將T細胞排除到間質中，阻止其向腫瘤浸潤。未來的臨床引入CHI3L1靶向治療有可能重新激活抗腫瘤免疫反應和增強T細胞浸潤，從而改善ICB反應。

實驗方法：

        小鼠模型，細胞培養(yǎng)，小鼠乳腺移植試驗，小鼠藥物治療，RNA測序，定量逆轉錄酶PCR（qRT-PCR），免疫印跡，多重熒光免疫組化，流式細胞分析，跨孔遷移測定，酶聯(lián)免疫吸附

參考文獻：

        Taifour T, Attalla SS, Zuo D, Gu Y, Sanguin-Gendreau V, Proud H, et al. The tumor-derived cytokine CHI3L1 induces neutrophil extracellular traps that promote T cell exclusion in triple-negative breast cancer. Immunity. 2023 Nov 18:S1074-7613(23)00483-1. doi: 10.1016/j.immuni.2023.11.002.