肝癌鐵死亡新機制：靶向USP8通過穩(wěn)定OGT抑制SLC7A11 O-GlcNAc糖基化

        肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的亞型，是一種致命的侵襲性惡性腫瘤。泛素化是一種翻譯后修飾，在細胞存活、細胞凋亡、細胞周期、抗原提呈等過程中發(fā)揮重要作用。去泛素化酶（Deubiquitylating Enzymes，DUBs）可以調控蛋白質的泛素化修飾，與多種癌基因和腫瘤相關蛋白的表達有關，因此DUB抑制劑的開發(fā)成為癌癥治療中有吸引力的靶點。本研究考察DUBs抑制劑在HCC中的抗腫瘤作用，發(fā)現泛素特異性肽酶8（Ubiquitin Specific Peptidase 8，USP8）小分子抑制劑DUB-IN-3有顯著的抗癌反應。體內外實驗證明靶向USP8參與鐵死亡并抑制HCC增殖和肺轉移。進一步機制研究表明，USP8去泛素化修飾O-GlcNAc糖基轉移酶（O-GlcNAc Transferase，OGT）蛋白，提高其蛋白的穩(wěn)定性，后者通過O-GlcNAc糖基化調控鐵死亡關鍵蛋白SLC7A11的Ser26位點的糖基化，從而抑制肝癌鐵死亡，促進肝癌進展。以上研究表明了USP8可能是一個潛在的HCC治療靶點。

        該研究于2023年10月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1

技術路線

主要研究結果

1. DUB-IN-3有效抑制HCC

        為了發(fā)現有效的HCC生長抑制劑，作者在6種HCC細胞系中篩選了23種已知靶向人DUBs的化合物。所有細胞系都對USP8抑制劑DUB-IN-3表現出高敏感性（圖1A，B）。作者還發(fā)現DUB-IN-3以劑量和時間依賴性的方式降低了LM3和Hep3B細胞的細胞活力（圖1C，D）。接下來通過PI染色測試了DUB-IN-3對細胞死亡的影響。如圖1E所示，DUB-IN-3顯著誘導HCC細胞死亡；Calcein AM/PI染色結果證明了這一結論（圖1F，G）。作者進一步從原發(fā)性肝癌中建立6種患者來源的類器官，并測試DUB-IN-3的抗癌活性，發(fā)現DUB-IN-3在類器官模型中表現出顯著的癌癥抑制作用（圖1H，I）。

        為了進一步研究DUB-IN-3的抗癌效果，作者選擇對DUB-IN-3處理有較高敏感性的LM3和Hep3B細胞系進行進一步分析。CCK8分析表明DUB-IN-3抑制HCC細胞的增殖（圖2A）?？寺⌒纬稍囼灡砻?span>DUB-IN-3顯著抑制HCC細胞的克隆形成能力（圖2B）。EdU實驗結果表明DUB-IN-3抑制LM3和Hep3B細胞的DNA合成（圖2C）。Calcein AM/PI染色表明DUB-IN-3導致細胞死亡增加（圖2D）。Transwell試驗表明DUB-IN-3顯著降低LM3和Hep3B細胞的侵襲能力（圖2E）。接下來研究了DUB-IN-3在HCC干性特征中的作用，發(fā)現DUB-IN-3 顯著抑制了LM3和Hep3B細胞的成球能力（圖2F）。隨后利用異種移植和尾靜脈注射肺轉移模型來探究DUB-IN-3在體內肝癌中的作用，結果表明DUB-IN-3顯著抑制了體內腫瘤的生長和轉移（圖2G-L）。這些數據表明DUB-IN-3可能通過靶向USP8作為一種新型有效的抗HCC藥物。

圖1：DUB-IN-3是HCC的有效抑制劑

圖2：DUB-IN-3在體內外均可抑制HCC進展

2. 靶向USP8抑制谷胱甘肽代謝并誘導HCC鐵死亡

        為了探索上述結果的潛在機制，作者進行了氣相色譜法和基于TOF-質譜（GC/TOF-MS）的代謝組學分析。熱圖分析表明，DUB-IN-3處理引起了代謝產物的顯著差異（圖3A）。對代謝產物的途徑進行富集發(fā)現，DUB-IN-3處理的細胞中谷胱甘肽（GSH）代謝途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑以及鐵死亡途徑受到顯著影響（圖3B）。GSH是生物體內最重要的抗氧化劑之一，GSH代謝在腫瘤進展中起著重要作用，GSH水平升高與轉移增加有關。有研究報告胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白Xc-/GSH/ GPX4軸是參與調節(jié)鐵死亡的關鍵途徑，這是一種新定義的程序性細胞死亡形式（圖3C）。

        靶向GSH的合成和運用被認為是腫瘤治療的一種潛在手段。因此作者對GSH代謝途徑進行研究。GSH代謝的關鍵中間產物如胱氨酸和谷胱甘肽在DIB-IN-3處理的細胞中顯著降低（圖3D，E）。DIB-IN-3處理后，細胞中亞鐵水平上調（圖3F）。GSH耗竭導致細胞積累更多的脂質ROS（圖3G）。通過檢測RSL3誘導的鐵死亡進一步評估DIB-IN-3在鐵死亡中的作用。DUB-IN-3降低了RSL3治療下的細胞活力，可以通過Ferrostin-1挽救，表明該機制在細胞鐵死亡中具有特異性（圖3H，I）。敲除USP8降低了胱氨酸攝取和GSH水平，增加了亞鐵鐵水平和脂質ROS（圖3J-M）。USP8耗盡的細胞對RSL3處理更敏感（圖3N，O）。綜上所述，藥理抑制或敲除USP8可能通過抑制HCC細胞從細胞外環(huán)境吸收胱氨酸并賦予鐵死亡來抑制GSH生物合成。

圖3： 靶向USP8抑制GSH代謝并導致HCC發(fā)生鐵死亡

3. USP8通過去泛素化調節(jié)OGT穩(wěn)定性

        為了找到可能由USP8調節(jié)的蛋白質，作者在Flag-USP8表達和免疫沉淀后進行了基于免疫沉淀的質譜分析(IP-MS)，發(fā)現了USP8免疫沉淀的OGT蛋白（圖4A）。進一步的Co-IP實驗表明內源性USP8可以與內源性OGT互作（圖4B）。GST-pulldown實驗表明USP8在體外與OGT互作（圖4C）。接下來作者通過免疫熒光證明了USP8和OGT在細胞內共定位。此外，蛋白的結構域和缺失突變體的Co-IP結果顯示OGT的GT結構域與USP8的USP結構域存在物理相互作用(圖4E-H)。

        由于USP8是泛素特異性加工蛋白酶家族的成員，作者假設USP8可能通過泛素-蛋白酶體通路調節(jié)OGT周轉。USP8的消耗顯著降低OGT表達，卻不影響其mRNA豐度（圖5A），并且通過添加蛋白酶體抑制劑MG132或過表達USP8-WT可以逆轉OGT下降趨勢，而USP8催化失活突變體（USP8-C786A）不能逆轉OGT下降趨勢（圖5B，C）。因此作者認為USP8影響了OGT的穩(wěn)定性，為了證明這一結論，蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理LM3細胞，USP8敲低后OGT半衰期縮短（圖5D）。OGT穩(wěn)定性在過表達USP8-WT時增加，在USP8-C786A時沒有增加（圖5E）。這些結果表明USP8通過泛素-蛋白酶體途徑穩(wěn)定細胞中的OGT。進一步研究OGT是否是USP8的底物。如圖5F所示，USP8的耗竭顯著提高泛素化OGT的水平；USP8-WT的表達顯著降低泛素化OGT（圖5G）。作者還對突變泛素（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）進行泛素化測定，結果表明USP8可以有效地從OGT蛋白中去除K48連接的泛素鏈（圖5H）。為了確定被USP8去泛素化的OGT蛋白的特定位點，作者突變了OGT的賴氨酸殘基（圖5I），泛素化測定表明K117是關鍵位點（圖5J）。綜上所述，這些結果表明USP8是OGT的調節(jié)因子，是預后標志物。

圖4： USP8與OGT相關

圖5： USP8穩(wěn)定去泛素化酶OGT

4. USP8的磷酸化是與OGT相互作用所必需的

        作者發(fā)現USP8在Ser716殘基處出現磷酸化，而且STE20樣激酶（SLK）與Flag-USP8共純化。在LM3細胞中進行Co-IP驗證SLK和USP8之間發(fā)生互作（圖6A）。敲低SLK顯著降低了USP8的S716磷酸化（圖6B，C）。接下來，作者探究了SLK介導的USP8磷酸化是否影響其與OGT的關聯。敲低SLK后USP8和OGT之間的關聯顯著降低（圖6D）。USP8 S716無義磷酸化突變體）（USP8 S716A）與OGT之間的關聯下降，USP8 S716類似磷酸化（USP8 S716D）與OGT之間的關聯升高(圖6E)。隨后，作者表達USP8- WT或USP8 S716D的LM3細胞中敲低SLK發(fā)現只有USP8-WT與OGT結合的能力降低（圖6F）。作者還觀察到USP8- WT和USP8 S716D增加了OGT蛋白表達水平（圖6G）。

        為了研究USP8磷酸化在HCC細胞中的作用，作者在HCC細胞中穩(wěn)定表達USP8 WT和S716A，與對照相比，USP8 WT促進了HCC細胞的增殖、侵襲和干性，增強了HCC細胞的胱氨酸攝取和GSH水平，降低了脂質ROS水平和細胞對RSL3治療的敏感性，而USP8 S716A突變體失去了這些能力（圖6H-P）。USP8 WT，但不是C786A和S716A突變體，（圖6M-P）。這些結果表明USP8與OGT相互作用時需要磷酸化激活。

圖6： SLK磷酸化USP8

5. HCC細胞中OGT O-GlcNAa糖基化SLC7A11 Ser26

        作者已經證明USP8去泛素化OGT并影響HCC細胞的胱氨酸攝取。由于胱氨酸是由胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白（System Xc-）從卵泡外環(huán)境輸入的，故作者研究該反向轉運蛋白的功能亞基——SLC7A11是否受USP8-OGT軸的調節(jié)。Co-IP表明OGT和SLC7A11在生理條件下存在關聯（圖7A）；SLC7A11發(fā)生了O-GlcNAa糖基化，OGT的消耗可降低SLC7A11的O-GlcNAa糖基化（圖7B）。TMG（OGA抑制劑）處理細胞發(fā)現整體O-GlcNAa糖基化的升高增加了SLC7A11的O-GlcNAa糖基化，OSMI-1（OGT抑制劑）處理的細胞顯示出相反的現象（圖7C）。SLC7A11的O-GlcNAa糖基化水平在DAB-IN-3處理或敲除USP8后下降（圖7D，E）。此外，OGT的過表達可以挽救USP8-KO細胞中SLC7A11的O-GlcNAa糖基化（圖7F）。這些結果表明USP8通過OGT調節(jié)SLC7A11的O-GlcNAa糖基化水平。

        為了確定SLC7A11上發(fā)生O-GlcNAa糖基化的位點，作者使用在線生物信息學工具（https://services.healthtech.dtu.dk/）進行預測，確定了4個殘基（S8，T9，S26和T218）。為了確定SLC7A11中糖基化的發(fā)生位點，將四個殘基均突變?yōu)楸彼?，發(fā)現S26的突變降低了O-GlcNAa糖基化水平，表明S26是主要的糖基化位點（圖7G，H）。為了進一步了解O-GlcNAa糖基化對SLC7A11活性的影響，在HCC細胞中敲除了SLC7A11（SLC7A11-KO），轉染SLC7A11-WT和SLC7A11-S26A。結果發(fā)現敲除SLC7A11抑制HCC細胞的增殖、侵襲和干性，SLC7A11-WT的過表達恢復了SLC7A11敲除誘導的效果，SLC7A11-S26A不能恢復（圖7I-N）。類似的，SLC7A11-WT增強了HCC細胞的胱氨酸攝取和GSH水平，同時降低了脂質ROS水平和細胞對RSL3治療的敏感性（圖7O-R）。綜上所述，SLC7A11在HCC細胞中被OGT進行O-GlcNAa糖基化，SLC7A11的O-GlcNAa糖基化對其胱氨酸攝取活性至關重要。

圖7：HCC細胞中OGT通過O-GlcNAc糖基化修飾SLC7A11 Ser26位點

結論

     總之，本研究證明了靶向USP8降低了OGT的穩(wěn)定性，抑制了肝癌的進展，并誘導了肝癌的鐵死亡。從機制上講，USP8通過去除K48連接的泛素鏈使OGT去泛素化和穩(wěn)定增加，然后SLC7A11在S26位點發(fā)生O-GlcNAc糖基化。SLC7A11的O-GlcNAc糖基化是其從細胞外環(huán)境中吸收胱氨酸的活性所必需的。此外，USP8在S716的磷酸化是與OGT相互作用所必需的。我們的發(fā)現為USP8在肝癌中調節(jié)谷胱甘肽代謝和鐵死亡的作用提供了新的見解（圖8），并表明靶向USP8是一種有希望的肝癌治療策略。

實驗方法

        代謝組學分析，蛋白質穩(wěn)定性分析，去泛素化實驗，蛋白質印跡分析，脂質ROS分析，GSH檢測，細胞培養(yǎng)，質粒和USP8敲除細胞系的生成，細胞染色，細胞活力測定，球體形成分析，小鼠實驗，體內腫瘤發(fā)生試驗

參考文獻

        Tang Jianing, Long Guo, Hu Kuan et al. Targeting USP8 Inhibits O-GlcNAcylation of SLC7A11 to Promote Ferroptosis of Hepatocellular Carcinoma via Stabilization of OGT. [J]. Adv Sci (Weinh), 2023, 10: e2302953.