外泌體支架成功加速傷口愈合

       源自人體皮膚的工程皮膚替代品可顯著減少由外來/人造材料介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，因此更易于臨床應(yīng)用。I型膠原蛋白是傷口愈合過程中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有優(yōu)異的生物相容性，富含血小板的血漿可作為愈合級聯(lián)的引發(fā)劑。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體對于組織修復(fù)至關(guān)重要，在增強(qiáng)細(xì)胞再生、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和重塑細(xì)胞外基質(zhì)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在此，I型膠原蛋白和富含血小板的血漿混合形成穩(wěn)定的3D支架，為角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞粘附、遷移和增殖提供天然支持。將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體添加到支架中，以改善工程皮膚的性能。分析了該細(xì)胞支架的理化性質(zhì)，并在全層皮膚缺損小鼠模型中評估其修復(fù)效果。細(xì)胞支架可降低炎癥水平并促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，從而加速傷口愈合。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，外泌體在富含膠原/血小板的血漿支架中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎和促血管生成作用。該方法為組織再生和傷口修復(fù)提供了新的治療策略和理論基礎(chǔ)。本文于2023年10月發(fā)表在《Advanced Materials》期刊上，IF=29.4

主要技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、膠原（COL）/富含血小板的血漿（PRP）支架的設(shè)計和表征

       傷口發(fā)生后，傷口周圍血漿滲出，血小板立即被激活釋放血小板衍生生長因子（PDGF）促進(jìn)血栓形成，形成凝膠狀團(tuán)塊覆蓋傷口，這是傷口愈合反應(yīng)的初始階段。PRP的提取和應(yīng)用可用于模擬愈合級聯(lián)的啟動。此外，趨化因子招募的成纖維細(xì)胞通過膠原蛋白沉積修復(fù)傷口。愈合后期，血管和肉芽組織形成，角化細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面。為了模擬傷口愈合微環(huán)境，使用COL-I和PRP生成生物支架，并添加成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞層。合成示意圖如圖1A所示。PRP和COL-I以不同質(zhì)量比混合，加入10 μL mL?1凝血酶形成支架的主網(wǎng)絡(luò)。對支架的材料性能進(jìn)行了測試。根據(jù)3D孔徑、彈性模量和拉伸強(qiáng)度選擇PRP的最佳質(zhì)量比后，添加成纖維細(xì)胞和外泌體，然后接種角化細(xì)胞以覆蓋支架表面。然后使用四組評估COL/PRP支架對傷口愈合的影響：純PRP組和質(zhì)量比為16:1、8:1和4:1的PRP/COL-I組。具有高度多孔結(jié)構(gòu)的支架對于實現(xiàn)細(xì)胞遷移和“爬行”、不同細(xì)胞層之間的相互作用以及營養(yǎng)物質(zhì)流動至關(guān)重要。首先，對不同質(zhì)量比的COL/PRP支架的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。不同質(zhì)量比的COL/PRP支架表現(xiàn)出均勻的3D互連多孔結(jié)構(gòu)（圖1B），孔徑范圍為20至120 μm，并且隨著PRP質(zhì)量比的減小，孔徑逐漸減小。對于直徑為17-20 μm的成纖維細(xì)胞來說，這個孔徑可以為細(xì)胞生長提供足夠的面積和空間。本研究證實COL/PRP可以形成3D立體生物支架結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞粘附、遷移和增殖提供環(huán)境支持。COL/PRP支架的彈性模量，即抗變形能力，在質(zhì)量比為8:1時最大，達(dá)到463±0.252 kPa（圖1C）。支架的組織粘合性質(zhì)使其能夠保持與傷口的結(jié)合，降低使用過程中脫落的風(fēng)險。搭接剪切試驗用于評估不同質(zhì)量比下COL/PRP支架的組織粘附性能。每組的粘附強(qiáng)度約為5 kPa（圖1D），組間無顯著差異，證實COL/PRP支架滿足傷口表面粘附要求。8:1組的拉伸強(qiáng)度最高，達(dá)到220.6±3.725 kPa（圖1E）。蘇木精-伊紅（H&E）染色也顯示出均勻的孔隙結(jié)構(gòu)，并且隨著PRP質(zhì)量比的降低，結(jié)構(gòu)變得更致密，孔徑逐漸減小（圖1F）。

       此外，為了評價COL/PRP支架是否具有良好的生物相容性，進(jìn)行了活體/死亡實驗。每組支架分別與成纖維細(xì)胞（圖1G）和角化細(xì)胞（圖2A）共培養(yǎng)3d。成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的活/死細(xì)胞染色僅見少量死亡細(xì)胞，與正常對照組結(jié)果相似，活細(xì)胞定量分析無明顯差異（圖1H和2D），證實該支架具有良好的細(xì)胞相容性。Ki67是用于評估細(xì)胞增殖的主要標(biāo)志物。將不同質(zhì)量比的COL/PRP支架與成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞共培養(yǎng)，并用Ki67染色（圖2B、C）。免疫熒光結(jié)果表明，8:1質(zhì)量比組表達(dá)Ki67的成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞豐度最高（圖2E、F）。這些數(shù)據(jù)證實質(zhì)量比為8:1的COL/PRP支架比其他組的COL/PRP支架具有更好的性能和更大的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。因此，后續(xù)實驗均采用8:1的質(zhì)量比。按照設(shè)計過程（圖1A），PRP和COL-I以8:1的質(zhì)量比混合，并將105 cm?2成纖維細(xì)胞添加到1毫米厚的支架上。混合后，加入10 μL mL?1凝血酶以固化支架。細(xì)胞生長2天后，將105 cm?2的角化細(xì)胞接種到表面。如圖2G所示，角化細(xì)胞均勻分布在支架表面，形狀令人滿意，外觀呈鵝卵石狀。此外，支架中角化細(xì)胞特異性標(biāo)記物K14和成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記物