在惡性橫紋肌樣腫瘤中， SMARCB1缺失激活了患者特異性遠(yuǎn)端致癌增強(qiáng)子

       惡性橫紋肌樣瘤（MRT）是一種高度惡性且通常致命的兒童癌癥。 MRT 在基因上由 SMARCB1 的雙等位基因失活突變定義，SMARCB1 是 BRG1/BRM 相關(guān)因子 (BAF) 染色質(zhì)重塑復(fù)合體的成員。 BAF 復(fù)合體成員的突變?cè)谌祟?lèi)癌癥中很常見(jiàn)，但在許多情況下，人們對(duì)它們對(duì)腫瘤發(fā)生的貢獻(xiàn)仍知之甚少。在這里，我們研究了 MRT 背景下 SMARCB1 丟失導(dǎo)致的監(jiān)管環(huán)境脫軌。我們對(duì)源自患者的 MRT 類(lèi)器官的多組學(xué)方法揭示了 SMARCB1 重組后監(jiān)管格局的巨大重塑。染色體構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)隨后揭示了遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)域與 MYC 癌基因啟動(dòng)子的患者特異性環(huán)。聯(lián)合單細(xì)胞 RNA-seq 和 ATAC-seq 顯示，這種 MYC 增強(qiáng)子利用的腫瘤間異質(zhì)性也存在于患者 MRT 組織中。我們發(fā)現(xiàn) SMARCB1 的缺失會(huì)激活 MRT 腫瘤發(fā)生背后的患者特異性表觀遺傳重編程。

       該研究于2023年12月發(fā)表在《Nature communications》，IF：16.6。

結(jié)果:

1、MRT PDOs 中的染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析揭示了 SMARCB1 依賴(lài)性增強(qiáng)子調(diào)節(jié)

       我們先前證明了SMARCB1的喪失是惡性轉(zhuǎn)化所必需但不足夠的。因此，我們假設(shè)腫瘤形成需要額外的表觀遺傳學(xué)驅(qū)動(dòng)因子。將MRT的主要遺傳驅(qū)動(dòng)事件SMARCB1喪失重新引入，將MRT細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)，表明促使惡性的表觀遺傳變化是可以克服的（圖1A）。為了找到這些促使腫瘤發(fā)展的調(diào)控性變化，我們對(duì)一種MRT PDO模型（命名為P103）進(jìn)行了慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別使用熒光素酶表達(dá)（對(duì)照）或SMARCB1表達(dá)（SMARCB1+）質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（ATAC-seq）以及染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）或使用核酸酶測(cè)序進(jìn)行靶點(diǎn)切割和釋放測(cè)序（CUT&RUN）來(lái)測(cè)量染色質(zhì)可及性（圖1A、B）。在SMARCB1重建后，我們發(fā)現(xiàn)了7,941個(gè)新形成的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域（OCRs），這些區(qū)域富集了來(lái)自不同家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如SMARCC1/2和AP-1（圖1C）。SMARCB1 ChIP-seq顯示這些OCR被SMARCB1（cBAF和PBAF）和SS18（ncBAF和cBAF）結(jié)合，表明在重建后這些區(qū)域存在cBAF的結(jié)合。當(dāng)我們使用GREAT對(duì)這些OCR進(jìn)行功能注釋時(shí)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)類(lèi)別富集，主要與分化和發(fā)育過(guò)程相關(guān)。在失去的1,211個(gè)OCR中，觀察到了ncBAF復(fù)合物成員BRD9和SS18的結(jié)合明顯減少。我們發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域中唯一富集的基序是隔離蛋白CTCF的基序，與之前在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的報(bào)告一致

       CTCF的ChIP-seq結(jié)果顯示，在SMARCB1重建后，CTCF在SMARCB1+細(xì)胞中失去的OCR上的結(jié)合減少（圖1C）。在基因組中，CTCF的結(jié)合經(jīng)常與環(huán)形粘連復(fù)合物的結(jié)合重疊。粘連復(fù)合物亞單位RAD21的ChIP-seq證實(shí)，除了CTCF結(jié)合減少外，SMARCB1+細(xì)胞中失去的OCR顯示了粘連復(fù)合物的結(jié)合減少（圖1C）。另一方面，在SMARCB1+ PDO中增益的OCR顯示了RAD21的占有（圖1C），但沒(méi)有CTCF的結(jié)合。為了確定SMARCB1重建后增強(qiáng)子景觀的變化，我們進(jìn)行了H3K27ac活性增強(qiáng)子標(biāo)記的ChIP-seq。如預(yù)期，失去的OCR顯示H3K27ac水平下降，而增加的可及性位點(diǎn)則顯示H3K27ac水平顯著增加（圖1C）?；钚栽鰪?qiáng)子標(biāo)記的增加與粘連復(fù)合物的結(jié)合增加相一致（圖1C），這與一部分粘連復(fù)合物分子結(jié)合到（超級(jí)）增強(qiáng)子區(qū)域以及CTCF結(jié)合位點(diǎn)一致。這些結(jié)果表明，經(jīng)典BAF復(fù)合物在抑制CTCF結(jié)合到染色質(zhì)方面起著重要作用，并且SMARCB1的喪失導(dǎo)致CTCF結(jié)合到染色質(zhì)的可及性增加，以及ncBAF復(fù)合物結(jié)合到腫瘤特異OCR。

圖1| SMARCB1 重建重塑了 MRT PDO 模型中開(kāi)放的染色質(zhì)景觀。

2、SMARCB1 重建重組了 MYC 癌基因周?chē)娜旧|(zhì)景觀

       觀察到在SMARCB1重建后CTCF和RAD21結(jié)合景觀的變化使我們假設(shè)，這些細(xì)胞中可能影響了長(zhǎng)距離基因調(diào)控。為了確定基因組的組織（3D基因組）是否發(fā)生了任何依賴(lài)于SMARCB1的變化，我們?cè)趯?duì)照和SMARCB1+ P103 MRT PDOs中進(jìn)行了高分辨率原位HiC實(shí)驗(yàn)。盡管CTCF對(duì)染色質(zhì)的結(jié)合存在差異，但我們發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)基本上沒(méi)有受到影響。3D基因組特征，如拓?fù)湎嚓P(guān)域（TADs）和A/B區(qū)，SMARCB1重建后顯示出有限的變化。然而，我們分別鑒定了控制和SMARCB1+ PDO的131個(gè)和1,164個(gè)特異loop，其最小接觸頻率變化為1.5倍（圖2C）。在SMARCB1重建后，對(duì)最顯著失去的基因座進(jìn)行排名，我們發(fā)現(xiàn)MYC癌基因的啟動(dòng)子與一個(gè)大約1.1 Mb的遠(yuǎn)程區(qū)域之間存在相互作用（圖2A，C）。這個(gè)loop是SMARCB1重建后第六個(gè)最減少的相互作用，也是涉及原癌基因的排名最高的相互作用。這個(gè)MYC啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程區(qū)域具有高H3K27ac水平，表明這是一個(gè)超級(jí)增強(qiáng)子（圖2A，B）。

       在MRT的背景下，MYC癌基因尤為引人關(guān)注，因?yàn)槲覀兒推渌芯肯惹白C明，MRT是通過(guò)SMARCB1依賴(lài)的MYC基因表達(dá)特征來(lái)定義的。類(lèi)似地，我們觀察到在SMARCB1重建后MYC mRNA和蛋白水平明顯減少，以及細(xì)胞周期相關(guān)基因的失調(diào)，表明存在細(xì)胞周期停滯（圖2D）。此外，通過(guò)shRNA誘導(dǎo)的MYC敲除在MRT PDOs中導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著減少（圖2E），表明MYC對(duì)MRT的生長(zhǎng)是必需的。除了MYC表達(dá)的減少外，我們觀察到在SMARCB1重建后，超級(jí)增強(qiáng)子以及MYC啟動(dòng)子的染色質(zhì)可及性顯著減弱（圖2A，B）。為了探討SMARCB1重建是否影響ncBAF復(fù)合物的結(jié)合，我們對(duì)BRD9（ncBAF）和SS18（cBAF和ncBAF）進(jìn)行了CUT&RUN。我們發(fā)現(xiàn)在SMARCB1重建后，BRD9和SS18在MYC啟動(dòng)子以及1.1 Mb遠(yuǎn)程區(qū)域的結(jié)合顯著減少（圖2B）。這些結(jié)果表明，MYC表達(dá)至少在很大程度上取決于ncBAF復(fù)合物的結(jié)合。SMARCB1的重建減少了ncBAF復(fù)合物在MYC位點(diǎn)的結(jié)合，從而可能減少了MYC啟動(dòng)子與遠(yuǎn)程超級(jí)增強(qiáng)子的相互作用。

圖2| SMARCB1 重建影響 MRT PDO 中 MYC 癌基因的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子

3、患者特異性超級(jí)增強(qiáng)子與 MRT 中的 MYC 相互作用

       我們隨后假設(shè)MYC遠(yuǎn)程增強(qiáng)子環(huán)路可能是推動(dòng)MRT致癌的一種普遍機(jī)制。為此，我們?cè)诹硗鈨蓚€(gè)MRT PDOs（P78和P60）中進(jìn)行了SMARCB1的重建。RNA-seq分析顯示這兩個(gè)MRT模型中MYC表達(dá)減少，以及細(xì)胞周期基因的失調(diào)，證實(shí)了細(xì)胞增殖停滯的誘導(dǎo)（圖2D、E）。接下來(lái)，我們使用MYC啟動(dòng)子作為視點(diǎn)，對(duì)這兩個(gè)額外的PDO進(jìn)行了4C-seq，這是一種定向到特定基因組位點(diǎn)的染色體構(gòu)象捕獲方法。與P103類(lèi)似，P78在SMARCB1重建后顯示了MYC啟動(dòng)子與相同的約1.1 Mb遠(yuǎn)程基因組區(qū)域的減少接觸頻率（圖3A）。值得注意的是，第三個(gè)PDO模型（P60）的4C-seq分析顯示MYC啟動(dòng)子與我們先前確定的基因組區(qū)域沒(méi)有相互作用。相反，在SMARCB1重建后，4C-seq揭示了另外兩個(gè)染色質(zhì)環(huán)路的減弱（圖3A）。

       為了繪制PDO模型在存在和不存在SMARCB1時(shí)的調(diào)控景觀，我們?cè)?span>P78和P60上進(jìn)行了ATAC-seq。當(dāng)我們將ATAC-seq數(shù)據(jù)與4C-seq數(shù)據(jù)疊加時(shí)，發(fā)現(xiàn)與MYC啟動(dòng)子相互作用的區(qū)域是高度可訪(fǎng)問(wèn)的。這種可訪(fǎng)問(wèn)性與患者特異的MYC啟動(dòng)子相互作用景觀相關(guān)（圖3B）。在SMARCB1重建后，相互作用的喪失與這些位點(diǎn)的可訪(fǎng)問(wèn)性喪失相一致（圖3B）。在P78中的可訪(fǎng)問(wèn)染色質(zhì)區(qū)域類(lèi)似于我們?cè)?span>P103中確定的超級(jí)增強(qiáng)子?？傮w而言，我們將這些可能的超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域稱(chēng)為Rhabdoid Oncogenic MYC Enhancer（RhOME），并根據(jù)它們?cè)诨蚪M中的位置進(jìn)行編號(hào)。值得注意的是，與RhOME2相反，RhOME1（PCAT1）和RhOME3（CCDC26）先前在其他腫瘤實(shí)體中已被確定為MYC的調(diào)控區(qū)域。因此，我們的Hi-C和4C實(shí)驗(yàn)揭示，在不同的MRT PDOs中，與MYC啟動(dòng)子相互作用的不同遠(yuǎn)程增強(qiáng)子是活躍的（RhOME1-3）。RhOMEs的腫瘤間特異性進(jìn)一步突顯了增強(qiáng)子RNA（eRNAs）的表達(dá)，這是活躍的超級(jí)增強(qiáng)子所特有的，特異地在這些增強(qiáng)子在MRT PDOs中是活躍的并與MYC啟動(dòng)子相互作用的情況下（圖3C）。這些結(jié)果表明，SMARCB1的喪失導(dǎo)致了一種表觀狀態(tài)，其特征是形成長(zhǎng)程啟動(dòng)子-增強(qiáng)子環(huán)路，這些環(huán)路對(duì)于PDO模型是特異的，但在來(lái)自不同供體的MRT PDOs之間是異質(zhì)的。

       因?yàn)?span>MRT PDOs在很大程度上保留了它們衍生自的組織的（表觀）遺傳特征，我們利用這些模型進(jìn)一步探索患者特異的表觀遺傳程序，使用ATAC-seq（圖4A）。為了對(duì)在P103中喪失的OCR進(jìn)行分層，我們執(zhí)行了K均值聚類(lèi)，包括來(lái)自三個(gè)PDOs的ATAC-seq數(shù)據(jù)和P103的ChIP-seq數(shù)據(jù)（圖4A）。因此，我們可以將失去的OCR分類(lèi)為（K1）非增強(qiáng)子CTCF結(jié)合位點(diǎn)、（K2）弱增強(qiáng)子和（K3）獨(dú)立于CTCF的超級(jí)增強(qiáng)子（圖4A）。與超級(jí)增強(qiáng)子在細(xì)胞身份控制中的功能一致，我們鑒定了SOX蛋白結(jié)合位點(diǎn)，包括SOX2、SOX9和SOX17，以及與K3簇特異性開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn)、RhOME2和3.1 OCR相關(guān)的許多發(fā)育過(guò)程的功能注釋。此外，K3簇顯示了ncBAF復(fù)合物的最高染色質(zhì)占有率，由BRD9 CUT&RUN測(cè)量，其在恢復(fù)SMARCB1表達(dá)后顯著減少。而K1和K2簇在三個(gè)PDO模型中顯示了相似的可訪(fǎng)問(wèn)性模式，K3簇的可訪(fǎng)問(wèn)性喪失是特定于P103細(xì)胞系的（圖4A）。我們?cè)?span>P103中的Hi-C分析顯示，這些K3簇特異性超級(jí)增強(qiáng)子形成了絕緣邊界，這在重建SMARCB1表達(dá)后被有效地廢除（圖4B、C）。因此，在MRT PDOs中的SMARCB1重建與基因組拓?fù)洹?span>BAF復(fù)合物占有率和增強(qiáng)子活性方面發(fā)生了戲劇性但局部、患者特異性的變化。

圖3|不同 MRT PDO 中患者特異性 MYC 增強(qiáng)子組的鑒定。

圖4|患者特異性超級(jí)增強(qiáng)子在 SMARCB1null 腫瘤 PDO 中形成獨(dú)立于 CTCF 的 TAD 邊界。

4、MYC 增強(qiáng)子可塑性反映在患者 MRT 中

       到目前為止，我們的數(shù)據(jù)引發(fā)了一個(gè)有趣的可能性，即在增強(qiáng)子利用的水平上存在推動(dòng)MYC癌基因表達(dá)的腫瘤間異質(zhì)性。為了將我們的體外發(fā)現(xiàn)推廣到患者組織，我們首先檢查了來(lái)自患者MRT組織的公開(kāi)可獲得的H3K27ac ChIP-seq數(shù)據(jù)。如預(yù)期，MYC啟動(dòng)子在大多數(shù)患者樣本中都標(biāo)有高水平的H3K27ac，表明活躍的轉(zhuǎn)錄（圖5A）。此外，RhOME1-3處廣泛富集H3K27ac，顯示了在MRT PDOs中鑒定的腫瘤超級(jí)增強(qiáng)子景觀在MRT組織中的保留。在STJ0090和STJ0537中未能檢測(cè)到RhOME1-3的清晰峰值，而在MYC啟動(dòng)子處檢測(cè)到弱的H3K27ac信號(hào)。值得注意的是，與我們的PDO數(shù)據(jù)一致，不同患者樣本中在不同的RhOME位點(diǎn)檢測(cè)到H3K27ac峰的存在呈異質(zhì)性分布（圖5A）。

       為了評(píng)估是否在腫瘤內(nèi)存在差異的增強(qiáng)子利用，即腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，我們利用單細(xì)胞Multiome（10x Genomics）對(duì)七個(gè)MRT患者組織樣本進(jìn)行了聯(lián)合單細(xì)胞RNA-seq和ATAC-seq（圖5B）。經(jīng)過(guò)過(guò)濾，留下14,799個(gè)細(xì)胞用于進(jìn)一步的分析，每個(gè)腫瘤中的中位數(shù)為2040個(gè)細(xì)胞（圖5C）。通過(guò)細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記基因41和SMARCB1表達(dá)將正常和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了分配。均勻流形逼近和投影（UMAP）空間顯示，腫瘤細(xì)胞按患者進(jìn)行了聚類(lèi)，而非惡性細(xì)胞按細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行了聚類(lèi)（圖5C）。MYC表達(dá)以及MYC啟動(dòng)子的OCR在所有MRT和一些正常細(xì)胞聚類(lèi)中都有發(fā)現(xiàn)（圖5D）。然而，盡管在正常細(xì)胞中檢測(cè)到可察覺(jué)的MYC啟動(dòng)子信號(hào)，但幾乎在RhOME1-3中沒(méi)有檢測(cè)到可訪(fǎng)問(wèn)的染色質(zhì)，這表明在至少這些樣本中，這些超級(jí)增強(qiáng)子是腫瘤特異性的。至關(guān)重要的是，我們觀察到在不同的患者MRTs中，RhOME1-3的OCR組合是不同的（圖5D、E）。更具體地說(shuō)，盡管P156和P168僅由RhOME2處的OCR定義，但P041和P052主要顯示RhOME1和RhOME3處的OCR，并且在P166中僅在RhOME3處檢測(cè)到OCR。在P116和P138中在任何RhOME中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)OCR，這表明在這些腫瘤中通過(guò)RhOME1-3以外的調(diào)控元件發(fā)生了超生理激活MYC?？傮w而言，這些結(jié)果表明，在MRT中，存在在超級(jí)增強(qiáng)子活性水平上推動(dòng)MYC癌基因表達(dá)的腫瘤間異質(zhì)性。

圖5 | MRT 組織分析揭示了 MYC 增強(qiáng)子景觀的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

5、ncBAF 抑制誘導(dǎo)類(lèi)似于 SMARCB1 重建的基因表達(dá)特征

       最近的研究表明，MRT可能由ncBAF復(fù)合物在MRT細(xì)胞中異常定位所驅(qū)動(dòng)。因此，抑制ncBAF亞單位BRD9被證明是MRT中的一個(gè)潛在治療易感性。因此，我們著手研究ncBAF抑制對(duì)MRT PDOs的影響（圖6A）。為此，我們使用BRD9的藥物抑制劑（I-BRD9）處理MRT PDOs。我們觀察到，在形態(tài)上，MRT細(xì)胞呈現(xiàn)出與SMARCB1重建相似的分化表型（圖6A），并且細(xì)胞生長(zhǎng)顯著受到抑制。定量RT-PCR（RT-qPCR）證實(shí)，BRD9抑制導(dǎo)致MYC mRNA水平顯著下降（圖6B）。我們進(jìn)行了RNA-seq以進(jìn)一步測(cè)量ncBAF抑制后的轉(zhuǎn)錄組變化，并發(fā)現(xiàn)I-BRD9處理后引起的基因表達(dá)變化與SMARCB1重建后的變化之間存在顯著的關(guān)聯(lián)（圖6C）。為了在兩個(gè)基因集之間統(tǒng)計(jì)確認(rèn)差異，我們對(duì)這兩個(gè)集合進(jìn)行了Fisher確切性檢驗(yàn)（圖6D），確認(rèn)了強(qiáng)烈的相似性。與增殖下降一致，我們觀察到細(xì)胞周期相關(guān)基因集以及MYC靶基因的下調(diào)（圖6E）。在上調(diào)的基因集中，我們發(fā)現(xiàn)了與分化相關(guān)的基因的富集（圖6E），與用BRD9抑制劑處理的細(xì)胞的形態(tài)表型一致（圖6A）。BRD9和SS18的CUT&RUN證實(shí)了在MYC啟動(dòng)子以及RhOME2和3位點(diǎn)的ncBAF復(fù)合物結(jié)合的減少（圖6F）。更一般地，在I-BRD9處理后觀察到BRD9和SS18的基因組范圍內(nèi)結(jié)合的喪失，這并不是由于處理引起的BRD9和SS18蛋白表達(dá)的降低引起的。因此，證實(shí)了治療誘導(dǎo)的ncBAF復(fù)合物結(jié)合的喪失。因此，在MRT中抑制ncBAF復(fù)合物，消除了所有三個(gè)BAF復(fù)合物，呈現(xiàn)出重建SMARCB1表達(dá)的效應(yīng)的表型。

       總的來(lái)說(shuō)，我們的全面研究表明，由于SMARCB1喪失導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子活性的偏離支撐了MRT的腫瘤發(fā)生，并為揭示BAF復(fù)合物突變?cè)诟鞣N癌癥中對(duì)腫瘤發(fā)生的貢獻(xiàn)提供了藍(lán)圖。

圖 6 |通過(guò)使用藥物抑制劑靶向名為 BRD9 的 ncBAF 亞基來(lái)治療 MRT 患者

實(shí)驗(yàn)方法：

       慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、定量RT-PCR、細(xì)胞活力測(cè)定、Western Blot、RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、CUT&RUN、Hi-C and 4C-seq、Motif分析、單細(xì)胞多組 ATAC + GEX。

參考文獻(xiàn)：

       Liu, N.Q., Paassen, I., Custers, L. et al. SMARCB1 loss activates patient-specific distal oncogenic enhancers in malignant rhabdoid tumors. Nat Commun 14, 7762 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43498-3