藤黃酰胺抗膠質(zhì)瘤機(jī)制：靶向WDR1依賴性的 細(xì)胞骨架重塑

       膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤之一，主要起源于膠質(zhì)組織。根據(jù)膠質(zhì)瘤的病理分級，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma ，GBM）被歸類為最惡性的級別（4級），高發(fā)病率和死亡率，預(yù)后不良。血腦屏障（Blood?brain Barrier ，BBB）和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（Glioma Stem Cells，GSCs）的存在是導(dǎo)致化療治療膠質(zhì)瘤療效有限的關(guān)鍵影響因素。因此，迫切需要探索能夠跨越BBB并消除膠質(zhì)瘤細(xì)胞（Glioma Cells，GCs）和GSCs的新化合物。本研究中作者篩選到了一種靶向GSC的小分子化合物，藤黃酰胺（Gambogic Amide ，GA-amide），穿透BBB并在腫瘤區(qū)域內(nèi)顯著富集。通過CRISPR、細(xì)胞熱位移分析（CETSA）、藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）、分子對接模擬等實(shí)驗(yàn)，確定GA-amide 的直接結(jié)合靶點(diǎn)WD重復(fù)域1（WD Repeat Domain 1 ，WDR1）。進(jìn)一步的，作者研究了GA-amide的機(jī)制，闡明GA-amide通過與其直接功能靶點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。

       該研究于2023年11月8日發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：39.3

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 體外GA-amide特異性抑制GSCs和PDCs

       首先，作者為了評估GA-amide在13個(gè)細(xì)胞系中的選擇性，用不同濃度的GA-amide處理細(xì)胞后測定IC50。發(fā)現(xiàn)GA-amide特異性降低了膠質(zhì)瘤相關(guān)細(xì)胞的活力，包括PDCs、GCs和GSCs，在其他癌癥干細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞中GA-amide的IC 50值要更高，表明膠質(zhì)瘤相關(guān)細(xì)胞對GA-amide處理更敏感（圖1a）。此外，由于自我更新能力反映了GCs的干性特征，因此通過有限稀釋法評估GA-amide預(yù)處理4小時(shí)后干性特征的變化。結(jié)果顯示，PDCs（T2-4）和GSC2細(xì)胞的自我更新均受到抑制（圖1b）。為了進(jìn)一步評估GA-amide對PDCs和GSCs的影響，GA-amide預(yù)處理PDCs 4小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行腫瘤成球?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明GA-amide停藥后PDCs的球形成受到抑制，繼發(fā)瘤球形成潛力降低（圖1c）。收集并解離第二次球體形成實(shí)驗(yàn)的活細(xì)胞用于第三次腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來自 T2-4和 T12-2 的第三次腫瘤球形成仍然受到抑制，表明GA-amide處理在第二次傳代后也抑制腫瘤形成（圖 1d）。鑒于GBM的高度侵襲性，作者用0.1μM和0.3μM的GA-amide處理PDCs和GSCs以評估細(xì)胞侵襲性，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖1e）此外，用不同濃度的GA-amide處理 PDCs  4小時(shí)，收集并評估細(xì)胞凋亡，如圖 1f 所示，GA-amide處理以劑量依賴性方式誘導(dǎo) PDC 凋亡。

圖1：GA-amide的體外抗腫瘤作用

2. GA-amide治療表現(xiàn)出安全性和BBB通透性，并可特異性靶向腫瘤區(qū)域

       替莫唑胺（Temozolomide，TMZ)是一種具有BBB滲透性的GBM標(biāo)準(zhǔn)治療劑。作者建立U87MG-SLC 的顱內(nèi)異種移植小鼠模型比較 TMZ 和 GA-amide的BBB通透性。在靜脈注射GA-amide后僅2分鐘濃度就達(dá)到了峰值174 ng/g組織，而且腫瘤區(qū)域的濃度至少是非腫瘤區(qū)域的兩倍，這表明GA-amide特異性靶向腫瘤區(qū)域（圖2a）。大腦的腫瘤區(qū)域和非腫瘤區(qū)域檢測到的TMZ分布無明顯差異（圖2b）。GA-amide與TrkA在近膜區(qū)結(jié)合是GA-amide膜滲透所必需的，基于此，作者檢查了TrkA在同一小鼠正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，分子量為140 kDa的糖基化TrkA在小鼠腫瘤組織中高表達(dá)，這有助于GA-amide的膜滲透（圖2c）。作者還評估了TrkA在正常組織和不同等級的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TrkA在膠質(zhì)瘤組織中表現(xiàn)出高水平的表達(dá)，而在正常腦組織中幾乎檢測不到（圖2d）。這可能解釋了GA-amide的腫瘤特異性富集，并表明TrkA高表達(dá)的患者可能對GA-amide處理更敏感。此外，細(xì)胞活力檢測顯示，GA-amide有效地降低TMZ耐藥細(xì)胞如PDCs和GSCs的存活率（圖2e）。作者建立膠質(zhì)瘤皮下PDX模型，進(jìn)一步確定GA-amide與TMZ-GAC的體內(nèi)抗癌活性。荷瘤小鼠分為四個(gè)治療組：對照組（載體）、GA-amide組、TMZ組和GAC組，觀察到GA-amide、TMZ和GAC治療組的腫瘤體積與對照組相比均有明顯減少（圖2f和2g）。

圖2： GA-amide與TMZ的BBB通透性和抑癌能力比較

3. GA-amide抑制異種移植模型和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長

       為了進(jìn)一步闡明GA-amide在體內(nèi)的作用，作者應(yīng)用了注射GSC的皮下異種移植模型，其中GA-amide連續(xù)11天以2mg/kg的劑量給藥，發(fā)現(xiàn)GA-amide的給藥顯著抑制了腫瘤的生長（圖3a和3b）。進(jìn)一步研究GA-amide對顱內(nèi)異種移植模型的治療作用，我們連續(xù)13天用GA-amide（1mg/kg）治療攜帶GSC2的顱內(nèi)異種移植物的裸鼠，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療的裸鼠表現(xiàn)出延長的存活時(shí)間（圖3c），但實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的小鼠體重沒有顯著差異（圖3d）。此外，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠模型作為原發(fā)性腦腫瘤模型來模擬原發(fā)性膠質(zhì)瘤的特征，如圖3e所示，小鼠大腦注射慢病毒以激活H-RasV12并沉默p53，注射12天后，根據(jù)磁共振成像（MRI）結(jié)果將小鼠隨機(jī)分為GA-酰胺治療組和對照組（圖3f和3g）。GA-amide（1 mg/kg）治療10天后通過MRI評估GA-amide的治療效果，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療的小鼠的腫瘤小于對照小鼠（圖3h和3i）。此外，構(gòu)建顱內(nèi)原位PDX模型（圖3j）進(jìn)一步評估GA-amide的體內(nèi)功效，模型構(gòu)建一周后小鼠隨機(jī)分成對照和治療兩組進(jìn)行MRI，發(fā)現(xiàn)各組腫瘤體積沒有顯著差異（圖3k和3l）。GA-amide（1 mg/kg，靜脈注射）治療 10 天后進(jìn)行 MRI 評估療效，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療小鼠的腫瘤體積明顯小于對照小鼠（圖3m和3n）。

圖3： GA-amide對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞衍生小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的抑制作用

4. CRISPR篩選鑒定PDCs中的GA-amide敏感基因

       為了確定GA-amide的可藥用靶點(diǎn)，作者使用高度優(yōu)化的Brunello CRISPR sgRNA文庫進(jìn)行基因組規(guī)模的CRISPR篩選。篩選程序的流程圖如圖4a所示。慢病毒sgRNA文庫成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的T2-4細(xì)胞用高劑量（LD80）GA-amide、低劑量（LD20）的GA-amide和二甲基亞砜（DMSO）處理21天，然后進(jìn)行深測序和相關(guān)分析以發(fā)現(xiàn)sgRNA 的分布。圖4b表明所有樣品中約99.9%的sgRNA序列保留，這確保了CRISPR文庫篩選的幾乎完整的文庫覆蓋率。同時(shí)，第21天GA-amide處理組的sgRNA分布與DMSO處理組的sgRNA分布明顯不同（圖4c）。通過分析第21天對照組和高劑量GA-amide處理組的sgRNA，作者確定了1534個(gè)作為藥物敏感基因的陽性富集基因（圖4d）；前10個(gè)基因如圖4e所示。九象限圖顯示了與必需基因不同的前 5 個(gè)正選基因（圖4f）。

圖4：  藥物敏感基因的全基因組CRISPR/Cas9篩選

5. WDR1是GA-amide的藥物靶點(diǎn)，可恢復(fù)PDCs中GA-amide的抑制作用

       為了驗(yàn)證與GA-amide相互作用的候選基因中的藥物靶點(diǎn)，作者應(yīng)用了細(xì)胞熱位移測定（CETSA）。對候選靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)印跡分析表明，在67°C-70°C用DMSO處理的細(xì)胞中，對應(yīng)于WDR1的條帶幾乎完全消失，而用GA-amide處理的細(xì)胞中條帶持續(xù)存在（圖5a）。接下來，作者使用另一種靶點(diǎn)識(shí)別技術(shù)DARTS進(jìn)一步研究藥物與其靶點(diǎn)的接合。發(fā)現(xiàn)隨著PDCs中GA-amide濃度的增加，WDR1的穩(wěn)定性增加，表明GA-amide可以與WDR1結(jié)合（圖5b）。為了進(jìn)一步研究WDR1與GA-amide的特定相互作用位點(diǎn)，使用AutoDock進(jìn)行了分子對接模擬，找到四個(gè)預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)：Lys-65、Asp-153、Arg-196和Gln-288。為了驗(yàn)證這一預(yù)測，構(gòu)建了具有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)突變的mut-WDR1質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)GA-amide處理細(xì)胞保護(hù)了wt-WDR1，但沒有保護(hù)mut-WDR1（圖5c）。為了探究哪個(gè)位點(diǎn)起關(guān)鍵作用，構(gòu)建了單殘基突變體WDR1質(zhì)粒，結(jié)果表明，R196A-WDR1突變體中，GA-amide的保護(hù)減少，而其他殘基的突變體仍然表現(xiàn)出GA-amide的保護(hù)。隨后作者用過表面等離子共振（SPR）來量化GA-amide與WDR1的直接相互作用。純化了包括四個(gè)相互作用位點(diǎn)的含WD2至WD7重復(fù)序列的His-WD2-7蛋白，SPR分析結(jié)果顯示GA-amide和His-WD2-7之間存在強(qiáng)大的結(jié)合相互作用，KD為46.7μM（圖5d）。在CRISPR/Cas9文庫篩選的結(jié)果中，所有WDR1靶向的sgRNA都在高劑量GA-amide處理的T2-4細(xì)胞中顯著富集，這意味著WDR1的丟失導(dǎo)致T2-4細(xì)胞對GA-amide處理的耐藥性（圖5e）。為了驗(yàn)證篩選結(jié)果們通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)文庫中包含的sgRNA和對照sgRNA建立了WDR1敲除PDCs（圖5f）。WDR1敲除細(xì)胞GA-amide處理后細(xì)胞增殖的抑制作用被減弱（圖5g）。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還表明，GA-amide不能抑制注射WDR1缺陷U87MG-SLC細(xì)胞的小鼠腫瘤生長（圖5h）。0.1μM和0.3μM GA-amide處理WDR1敲除PDCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲的抑制作用幾乎消失（圖5i和5j）。上述發(fā)現(xiàn)揭示了WDR1是藤GA-amide的直接靶點(diǎn)，并且WDR1的缺失導(dǎo)致細(xì)胞對藤黃酰胺的抗性。

圖5：WDR1是GA-amide的直接靶點(diǎn)

6. GA-amide與WDR1互作通過破壞細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)抑制PDC侵襲

       為了探討GA-amide抑制PDCs生長的機(jī)制，作者通過RNA測序（RNA-seq）進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析。GA-amide處理后，與對照相比，sg-WDR1細(xì)胞系恢復(fù)了1278個(gè)基因的上調(diào)和2799個(gè)基因的下調(diào)，因此這些基因被定義為恢復(fù)基因（圖6a）。為了了解GA-amide通過WDR1調(diào)節(jié)的途徑，KEGG分析發(fā)現(xiàn)TOP 20途徑包括調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和凋亡（圖6b）。過表達(dá)WDR1的T2-4細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀和質(zhì)譜（IP-MS）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在GA-amide處理后，差異結(jié)合的蛋白質(zhì)在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、遷移、侵襲和細(xì)胞連接等途徑中富集（圖6c）。與IP-MS分析結(jié)果一致，體外IP實(shí)驗(yàn)顯示WDR1與肌球蛋白重鏈9（MYH9）、肌動(dòng)蛋白和Coflin等細(xì)胞骨架蛋白之間的相互作用增強(qiáng)（圖6d）。WDR1敲除細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架的改變（圖6e）；GA-amide處理后在sg-NC細(xì)胞中觀察到F-肌動(dòng)蛋白水平的降低（圖6f），在WDR1敲除細(xì)胞中沒有觀察到。

圖6： GA-amide和WDR1的互作破壞細(xì)胞骨架以抑制細(xì)胞侵襲

7. GA-amide通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)GCs凋亡

       WDR1敲除T2-4細(xì)胞后基因的KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因正富集（圖7a）。為了證實(shí)WDR1可能在GA-amide誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮作用的假設(shè)，用GA-amide或DMSO處理對照細(xì)胞和WDR1敲除PDCs，并測定細(xì)胞凋亡的百分比。發(fā)現(xiàn)GA-amide處理誘導(dǎo)對照T2-4細(xì)胞凋亡，但WDR1被敲除時(shí)，GA-amide誘導(dǎo)的凋亡被減弱（圖7b）。CRISPR/Cas9篩選結(jié)果顯示，線粒體家族中富集的藥物敏感基因，特別是編碼細(xì)胞色素C的細(xì)胞色素c體細(xì)胞（CYCS）和caspase 9（CASP9），在篩選中也正富集（圖7c-e）。在GA-amide處理后，凋亡生物標(biāo)志物PARP和caspase3水平增加，在WDR1敲除細(xì)胞中被逆轉(zhuǎn)（圖7f）。因此，作者進(jìn)一步研究了GA-amide誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。GA-amide處理后，促凋亡蛋白Bcl-2-修飾因子（BMF） 和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合降低，在沒有 WDR1 的情況下被逆轉(zhuǎn)（圖 7g）。從線粒體和細(xì)胞質(zhì)中提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行WB，觀察到BMF、 BAX在細(xì)胞質(zhì)水平上降低，GA-酰胺處理后在線粒體內(nèi)的表達(dá)增加（圖7h）。用相同濃度的GA-amide處理后，WDR1敲除細(xì)胞中線粒體細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中的作用減弱（圖7i）。

       總的來說，作者認(rèn)為GA-amide通過直接與WDR1結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞骨架的不穩(wěn)定，導(dǎo)致與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的BMF的釋放，從而使BMF易位到線粒體，觸發(fā)BAX通道的開放和細(xì)胞色素C的隨后釋放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（圖7j）。

圖7： GA-amide通過WDR1介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

結(jié)論

       本研究已證明GA-amide直接與其可藥用靶點(diǎn)WDR1結(jié)合，從而抑制GCs侵襲和誘導(dǎo)WDR1介導(dǎo)的凋亡。具體而言，鑒于GA-amide的安全性、保護(hù)作用和生發(fā)效應(yīng)，將GA-amide與放療或化療結(jié)合可能會(huì)提高療效和減輕副作用，表明GA-amide作為膠質(zhì)瘤治療劑的臨床潛力。值得注意的是，CRISPR/Cas9篩選中的陰性選擇基因可能暗示了GA-amide聯(lián)合治療的可能方式?？傊?，本研究說明GA-amide是一種有前途的膠質(zhì)瘤化療新選擇，并揭示了其抗癌機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法

       細(xì)胞培養(yǎng)，IC50化驗(yàn)，體外腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)和有限稀釋實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)印跡分析，異種移植小鼠模型，血腦屏障通透性測定，全基因組CRISPR篩查，轉(zhuǎn)染與感染，重組蛋白的表達(dá)和純化，細(xì)胞凋亡檢測，F-肌動(dòng)蛋白的分離和檢測

參考文獻(xiàn)

       Qu Jiaorong, Qiu Bojun, Zhang Yuxin et al. The tumor-enriched small molecule gambogic amide suppresses glioma by targeting WDR1-dependent cytoskeleton remodeling. [J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8: 424.