藤黃酰胺抗膠質(zhì)瘤機制：靶向WDR1依賴性的 細胞骨架重塑

       膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤之一，主要起源于膠質(zhì)組織。根據(jù)膠質(zhì)瘤的病理分級，膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma ，GBM）被歸類為最惡性的級別（4級），高發(fā)病率和死亡率，預(yù)后不良。血腦屏障（Blood?brain Barrier ，BBB）和膠質(zhì)瘤干細胞（Glioma Stem Cells，GSCs）的存在是導(dǎo)致化療治療膠質(zhì)瘤療效有限的關(guān)鍵影響因素。因此，迫切需要探索能夠跨越BBB并消除膠質(zhì)瘤細胞（Glioma Cells，GCs）和GSCs的新化合物。本研究中作者篩選到了一種靶向GSC的小分子化合物，藤黃酰胺（Gambogic Amide ，GA-amide），穿透BBB并在腫瘤區(qū)域內(nèi)顯著富集。通過CRISPR、細胞熱位移分析（CETSA）、藥物親和反應(yīng)靶點穩(wěn)定性（DARTS）、分子對接模擬等實驗，確定GA-amide 的直接結(jié)合靶點WD重復(fù)域1（WD Repeat Domain 1 ，WDR1）。進一步的，作者研究了GA-amide的機制，闡明GA-amide通過與其直接功能靶點結(jié)合進而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。

       該研究于2023年11月8日發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：39.3

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 體外GA-amide特異性抑制GSCs和PDCs

       首先，作者為了評估GA-amide在13個細胞系中的選擇性，用不同濃度的GA-amide處理細胞后測定IC50。發(fā)現(xiàn)GA-amide特異性降低了膠質(zhì)瘤相關(guān)細胞的活力，包括PDCs、GCs和GSCs，在其他癌癥干細胞和非腫瘤細胞中GA-amide的IC 50值要更高，表明膠質(zhì)瘤相關(guān)細胞對GA-amide處理更敏感（圖1a）。此外，由于自我更新能力反映了GCs的干性特征，因此通過有限稀釋法評估GA-amide預(yù)處理4小時后干性特征的變化。結(jié)果顯示，PDCs（T2-4）和GSC2細胞的自我更新均受到抑制（圖1b）。為了進一步評估GA-amide對PDCs和GSCs的影響，GA-amide預(yù)處理PDCs 4小時后收集細胞進行腫瘤成球?qū)嶒?，結(jié)果表明GA-amide停藥后PDCs的球形成受到抑制，繼發(fā)瘤球形成潛力降低（圖1c）。收集并解離第二次球體形成實驗的活細胞用于第三次腫瘤球形成實驗，發(fā)現(xiàn)來自 T2-4和 T12-2 的第三次腫瘤球形成仍然受到抑制，表明GA-amide處理在第二次傳代后也抑制腫瘤形成（圖 1d）。鑒于GBM的高度侵襲性，作者用0.1μM和0.3μM的GA-amide處理PDCs和GSCs以評估細胞侵襲性，結(jié)果顯示細胞數(shù)量顯著減少（圖1e）此外，用不同濃度的GA-amide處理 PDCs  4小時，收集并評估細胞凋亡，如圖 1f 所示，GA-amide處理以劑量依賴性方式誘導(dǎo) PDC 凋亡。

圖1：GA-amide的體外抗腫瘤作用

2. GA-amide治療表現(xiàn)出安全性和BBB通透性，并可特異性靶向腫瘤區(qū)域

       替莫唑胺（Temozolomide，TMZ)是一種具有BBB滲透性的GBM標準治療劑。作者建立U87MG-SLC 的顱內(nèi)異種移植小鼠模型比較 TMZ 和 GA-amide的BBB通透性。在靜脈注射GA-amide后僅2分鐘濃度就達到了峰值174 ng/g組織，而且腫瘤區(qū)域的濃度至少是非腫瘤區(qū)域的兩倍，這表明GA-amide特異性靶向腫瘤區(qū)域（圖2a）。大腦的腫瘤區(qū)域和非腫瘤區(qū)域檢測到的TMZ分布無明顯差異（圖2b）。GA-amide與TrkA在近膜區(qū)結(jié)合是GA-amide膜滲透所必需的，基于此，作者檢查了TrkA在同一小鼠正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達。結(jié)果顯示，分子量為140 kDa的糖基化TrkA在小鼠腫瘤組織中高表達，這有助于GA-amide的膜滲透（圖2c）。作者還評估了TrkA在正常組織和不同等級的膠質(zhì)瘤組織中的表達，發(fā)現(xiàn)TrkA在膠質(zhì)瘤組織中表現(xiàn)出高水平的表達，而在正常腦組織中幾乎檢測不到（圖2d）。這可能解釋了GA-amide的腫瘤特異性富集，并表明TrkA高表達的患者可能對GA-amide處理更敏感。此外，細胞活力檢測顯示，GA-amide有效地降低TMZ耐藥細胞如PDCs和GSCs的存活率（圖2e）。作者建立膠質(zhì)瘤皮下PDX模型，進一步確定GA-amide與TMZ-GAC的體內(nèi)抗癌活性。荷瘤小鼠分為四個治療組：對照組（載體）、GA-amide組、TMZ組和GAC組，觀察到GA-amide、TMZ和GAC治療組的腫瘤體積與對照組相比均有明顯減少（圖2f和2g）。

圖2： GA-amide與TMZ的BBB通透性和抑癌能力比較

3. GA-amide抑制異種移植模型和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長

       為了進一步闡明GA-amide在體內(nèi)的作用，作者應(yīng)用了注射GSC的皮下異種移植模型，其中GA-amide連續(xù)11天以2mg/kg的劑量給藥，發(fā)現(xiàn)GA-amide的給藥顯著抑制了腫瘤的生長（圖3a和3b）。進一步研究GA-amide對顱內(nèi)異種移植模型的治療作用，我們連續(xù)13天用GA-amide（1mg/kg）治療攜帶GSC2的顱內(nèi)異種移植物的裸鼠，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療的裸鼠表現(xiàn)出延長的存活時間（圖3c），但實驗組和對照組之間的小鼠體重沒有顯著差異（圖3d）。此外，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠模型作為原發(fā)性腦腫瘤模型來模擬原發(fā)性膠質(zhì)瘤的特征，如圖3e所示，小鼠大腦注射慢病毒以激活H-RasV12并沉默p53，注射12天后，根據(jù)磁共振成像（MRI）結(jié)果將小鼠隨機分為GA-酰胺治療組和對照組（圖3f和3g）。GA-amide（1 mg/kg）治療10天后通過MRI評估GA-amide的治療效果，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療的小鼠的腫瘤小于對照小鼠（圖3h和3i）。此外，構(gòu)建顱內(nèi)原位PDX模型（圖3j）進一步評估GA-amide的體內(nèi)功效，模型構(gòu)建一周后小鼠隨機分成對照和治療兩組進行MRI，發(fā)現(xiàn)各組腫瘤體積沒有顯著差異（圖3k和3l）。GA-amide（1 mg/kg，靜脈注射）治療 10 天后進行 MRI 評估療效，發(fā)現(xiàn)GA-amide治療小鼠的腫瘤體積明顯小于對照小鼠（圖3m和3n）。

圖3： GA-amide對膠質(zhì)瘤干細胞衍生小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的抑制作用

4. CRISPR篩選鑒定PDCs中的GA-amide敏感基因

       為了確定GA-amide的可藥用靶點，作者使用高度優(yōu)化的Brunello CRISPR sgRNA文庫進行基因組規(guī)模的CRISPR篩選。篩選程序的流程圖如圖4a所示。慢病毒sgRNA文庫成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的T2-4細胞用高劑量（LD80）GA-amide、低劑量（LD20）的GA-amide和二甲基亞砜（DMSO）處理21天，然后進行深測序和相關(guān)分析以發(fā)現(xiàn)sgRNA 的分布。圖4b表明所有樣品中約99.9%的sgRNA序列保留，這確保了CRISPR文庫篩選的幾乎完整的文庫覆蓋率。同時，第21天GA-amide處理組的sgRNA分布與DMSO處理組的sgRNA分布明顯不同（圖4c）。通過分析第21天對照組和高劑量GA-amide處理組的sgRNA，作者確定了1534個作為藥物敏感基因的陽性富集基因（圖4d）；前10個基因如圖4e所示。九象限圖顯示了與必需基因不同的前 5 個正選基因（圖4f）。

圖4：  藥物敏感基因的全基因組CRISPR/Cas9篩選

5. WDR1是GA-amide的藥物靶點，可恢復(fù)PDCs中GA-amide的抑制作用

       為了驗證與GA-amide相互作用的候選基因中的藥物靶點，作者應(yīng)用了細胞熱位移測定（CETSA）。對候選靶點的蛋白質(zhì)印跡分析表明，在67°C-70°C用DMSO處理的細胞中，對應(yīng)于WDR1的條帶幾乎完全消失，而用GA-amide處理的細胞中條帶持續(xù)存在（圖5a）。接下來，作者使用另一種靶點識別技術(shù)DARTS進一步研究藥物與其靶點的接合。發(fā)現(xiàn)隨著PDCs中GA-amide濃度的增加，WDR1的穩(wěn)定性增加，表明GA-amide可以與WDR1結(jié)合（圖5b）。為了進一步研究WDR1與GA-amide的特定相互作用位點，使用AutoDock進行了分子對接模擬，找到四個預(yù)測的結(jié)合位點：Lys-65、Asp-153、Arg-196和Gln-288。為了驗證這一預(yù)測，構(gòu)建了具有四個結(jié)合位點突變的mut-WDR1質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)GA-amide處理細胞保護了wt-WDR1，但沒有保護mut-WDR1（圖5c）。為了探究哪個位點起關(guān)鍵作用，構(gòu)建了單殘基突變體WDR1質(zhì)粒，結(jié)果表明，R196A-WDR1突變體中，GA-amide的保護減少，而其他殘基的突變體仍然表現(xiàn)出GA-amide的保護。隨后作者用過表面等離子共振（SPR）來量化GA-amide與WDR1的直接相互作用。純化了包括四個相互作用位點的含WD2至WD7重復(fù)序列的His-WD2-7蛋白，SPR分析結(jié)果顯示GA-amide和His-WD2-7之間存在強大的結(jié)合相互作用，KD為46.7μM（圖5d）。在CRISPR/Cas9文庫篩選的結(jié)果中，所有WDR1靶向的sgRNA都在高劑量GA-amide處理的T2-4細胞中顯著富集，這意味著WDR1的丟失導(dǎo)致T2-4細胞對GA-amide處理的耐藥性（圖5e）。為了驗證篩選結(jié)果們通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)文庫中包含的sgRNA和對照sgRNA建立了WDR1敲除PDCs（圖5f）。WDR1敲除細胞GA-amide處理后細胞增殖的抑制作用被減弱（圖5g）。此外，體內(nèi)實驗還表明，GA-amide不能抑制注射WDR1缺陷U87MG-SLC細胞的小鼠腫瘤生長（圖5h）。0.1μM和0.3μM GA-amide處理WDR1敲除PDCs，發(fā)現(xiàn)細胞侵襲的抑制作用幾乎消失（圖5i和5j）。上述發(fā)現(xiàn)揭示了WDR1是藤GA-amide的直接靶點，并且WDR1的缺失導(dǎo)致細胞對藤黃酰胺的抗性。

圖5：WDR1是GA-amide的直接靶點

6. GA-amide與WDR1互作通過破壞細胞骨架穩(wěn)態(tài)抑制PDC侵襲

       為了探討GA-amide抑制PDCs生長的機制，作者通過RNA測序（RNA-seq）進行了基因表達譜分析。GA-amide處理后，與對照相比，sg-WDR1細胞系恢復(fù)了1278個基因的上調(diào)和2799個基因的下調(diào)，因此這些基因被定義為恢復(fù)基因（圖6a）。為了了解GA-amide通過WDR1調(diào)節(jié)的途徑，KEGG分析發(fā)現(xiàn)TOP 20途徑包括調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架和凋亡（圖6b）。過表達WDR1的T2-4細胞進行免疫沉淀和質(zhì)譜（IP-MS）實驗，發(fā)現(xiàn)在GA-amide處理后，差異結(jié)合的蛋白質(zhì)在肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、遷移、侵襲和細胞連接等途徑中富集（圖6c）。與IP-MS分析結(jié)果一致，體外IP實驗顯示WDR1與肌球蛋白重鏈9（MYH9）、肌動蛋白和Coflin等細胞骨架蛋白之間的相互作用增強（圖6d）。WDR1敲除細胞中發(fā)現(xiàn)細胞骨架的改變（圖6e）；GA-amide處理后在sg-NC細胞中觀察到F-肌動蛋白水平的降低（圖6f），在WDR1敲除細胞中沒有觀察到。

圖6： GA-amide和WDR1的互作破壞細胞骨架以抑制細胞侵襲

7. GA-amide通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)GCs凋亡

       WDR1敲除T2-4細胞后基因的KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因正富集（圖7a）。為了證實WDR1可能在GA-amide誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮作用的假設(shè)，用GA-amide或DMSO處理對照細胞和WDR1敲除PDCs，并測定細胞凋亡的百分比。發(fā)現(xiàn)GA-amide處理誘導(dǎo)對照T2-4細胞凋亡，但WDR1被敲除時，GA-amide誘導(dǎo)的凋亡被減弱（圖7b）。CRISPR/Cas9篩選結(jié)果顯示，線粒體家族中富集的藥物敏感基因，特別是編碼細胞色素C的細胞色素c體細胞（CYCS）和caspase 9（CASP9），在篩選中也正富集（圖7c-e）。在GA-amide處理后，凋亡生物標志物PARP和caspase3水平增加，在WDR1敲除細胞中被逆轉(zhuǎn)（圖7f）。因此，作者進一步研究了GA-amide誘導(dǎo)凋亡的機制。GA-amide處理后，促凋亡蛋白Bcl-2-修飾因子（BMF） 和肌動蛋白的結(jié)合降低，在沒有 WDR1 的情況下被逆轉(zhuǎn)（圖 7g）。從線粒體和細胞質(zhì)中提取蛋白質(zhì)后進行WB，觀察到BMF、 BAX在細胞質(zhì)水平上降低，GA-酰胺處理后在線粒體內(nèi)的表達增加（圖7h）。用相同濃度的GA-amide處理后，WDR1敲除細胞中線粒體細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中的作用減弱（圖7i）。

       總的來說，作者認為GA-amide通過直接與WDR1結(jié)合促進細胞骨架的不穩(wěn)定，導(dǎo)致與肌動蛋白結(jié)合的BMF的釋放，從而使BMF易位到線粒體，觸發(fā)BAX通道的開放和細胞色素C的隨后釋放，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。（圖7j）。

圖7： GA-amide通過WDR1介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細胞凋亡

結(jié)論

       本研究已證明GA-amide直接與其可藥用靶點WDR1結(jié)合，從而抑制GCs侵襲和誘導(dǎo)WDR1介導(dǎo)的凋亡。具體而言，鑒于GA-amide的安全性、保護作用和生發(fā)效應(yīng)，將GA-amide與放療或化療結(jié)合可能會提高療效和減輕副作用，表明GA-amide作為膠質(zhì)瘤治療劑的臨床潛力。值得注意的是，CRISPR/Cas9篩選中的陰性選擇基因可能暗示了GA-amide聯(lián)合治療的可能方式?？傊?，本研究說明GA-amide是一種有前途的膠質(zhì)瘤化療新選擇，并揭示了其抗癌機制。

實驗方法

       細胞培養(yǎng)，IC50化驗，體外腫瘤球形成實驗和有限稀釋實驗，細胞侵襲實驗，蛋白質(zhì)印跡分析，異種移植小鼠模型，血腦屏障通透性測定，全基因組CRISPR篩查，轉(zhuǎn)染與感染，重組蛋白的表達和純化，細胞凋亡檢測，F-肌動蛋白的分離和檢測

參考文獻

       Qu Jiaorong, Qiu Bojun, Zhang Yuxin et al. The tumor-enriched small molecule gambogic amide suppresses glioma by targeting WDR1-dependent cytoskeleton remodeling. [J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8: 424.