AURKAIP1通過穩(wěn)定三陰性乳腺癌中DDX5推動腫瘤進展

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2024-08-21
AURKAIP1通過阻止泛素化和降解直接與 DEAD-box螺旋酶5(DDX5)蛋白相互作用并使其穩(wěn)定......

 

       極光-A 激酶互作蛋白 1AURKAIP1)作為極光-A 激酶的負調控因子,已被證明在癌癥中起著中間作用。然而,AURKAIP1本身是否以及如何直接參與調控惡性腫瘤仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),AURKAIP1在三陰性乳腺癌(TNBC)中明確上調,與腫瘤大小、淋巴結轉移、病理分期和預后不良呈正相關。沉默AURKAIP1可明顯抑制TNBC細胞在體外和體內的增殖和遷移。機制上,AURKAIP1通過阻止泛素化和降解直接與 DEAD-box螺旋酶5DDX5)蛋白相互作用并使其穩(wěn)定。AURKAIP1沉默以DDX5依賴的方式抑制Wnt/β-catenin信號轉導的活性。該研究于202312月發(fā)表在《Cell Death & Disease》,IF9.0。

技術路線:

 

主要研究結果:

1. AURKAIP1TNBC中上調,并與不利的臨床結果相關

       利用多個GEO數(shù)據(jù)集(GSE38959、GSE45827GSE65194)篩選TNBC組織與正常乳腺樣本之間的差異表達基因(DEGs),得到TNBC樣本與正常組織相比的3835DEGs|log2FC|>1FDR<0.05)(圖1A)。為進一步縮小DEGs 的范圍,對TCGA-BRCA 數(shù)據(jù)集中的3835DEGs 進行Kaplan-Meier生存分析,篩選出16 個候選基因(圖 1B)??偨Y目前的分析結果和文獻報道,最終確定探討AURKAIP1 TNBC 腫瘤進展中的作用。對TCGA-BRCA數(shù)據(jù)進行分析,結果顯示,與未配對的正常乳腺組織和非TNBC樣本相比,AURKAIP1TNBC樣本中明顯上調(圖1C)。同時,通過評估不同AURKAIP1表達之間的生存概率,驚人地發(fā)現(xiàn)AURKAIP1的高表達與TNBC患者而非非TNBC患者較差的OSRFS相關,這充分證明AURKAIP1可能是TNBC特異性的預后生物標志物(圖1D)。為進一步證實這些發(fā)現(xiàn),研究人員通過IHC10SYSUCC TNBC患者的癌組織和相匹配的鄰近非癌組織進行檢測,驗證AURKAIP1的高表達(圖1E)。隨后,研究人員利用含有100TNBC樣本的組織芯片(TMA)驗證了AURKAIP1的表達與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分級、T期、N期和TNM分期的關系(圖1F)。結果顯示,AURKAIP1高表達的TNBC患者往往腫瘤較大、腋窩淋巴結轉移較多且臨床分期較重。此外,多變量Cox回歸分析表明,AURKAIP1 N分期一樣,可能是 TNBC 的獨立預后指標(圖 1G)。此外,從Kaplan-Meier生存分析來看,AURKAIP1水平較高的TNBC患者的OS概率往往較低(圖1H),這重申AURKAIP1TNBC的一個不利特征。


1. 在三陰性乳腺癌(TNBC)中觀察到 AURKAIP1 表達上調,這與 TNBC 患者預后較差有關

 

2. AURKAIP1 表達的改變會影響 TNBC 細胞在體外和體內的增殖和遷移

       通過qRT-PCRWestern印跡測定AURKAIP1在不同細胞系中的mRNA和蛋白水平,結果表明,與正常乳腺細胞系MCF 10A相比,AURKAIP1TNBC細胞中的表達量明顯更高(圖2A)。在 MDA-MB-231 BT 549 細胞系中敲除或過表達 AURKAIP1(圖 2B)。CCK8增殖實驗(圖2D)和克隆形成實驗(圖2C)表明,基于siRNAAURKAIP1敲除大大抑制TNBC細胞的增殖能力,而過表達AURKAIP1則完全增強TNBC細胞的增殖能力。重要的是,這些體外實驗結果在體內的異種移植實驗中得到進一步證實(圖 2E)。進行跨孔實驗(圖 3AB)和傷口愈合實驗(圖 3C)以評估 AURKAIP1 是否影響 TNBC 細胞遷移。結果表明,AURKAIP1沉默會異常降低細胞遷移能力,而AURKAIP1過表達則顯示出相反的效果。綜上所述,AURKAIP1失活會損害體外和體內TNBC細胞的增殖和遷移。


2. AURKAIP1 促進三陰性乳腺癌的細胞增殖和遷移

 

3. AURKAIP1 TNBC 的細胞遷移有促進作用

 

3. AURKAIP1 DDX5 介導的模式促進 TNBC 的發(fā)展

       采用了共免疫沉淀(CoIP)和串聯(lián)質譜(MS)的方法來研究與AURKAIP1相互作用的蛋白。在剔除用 IgG 進行陰性對照的數(shù)據(jù)后,合并 MDA-MB-231 BT 549 細胞的 CoIP-MS 數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn) 63 個蛋白與 AURKAIP1 有相互作用(圖 4A)。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn) DDX5 在包括乳腺癌在內的腫瘤中具有明確的作用機制,因此將 DDX5 確定為互作靶點,并進一步研究 AURKAIP1 是否通過 DDX5 媒介促進 TNBC 的發(fā)展。不出所料,在 MDA-MB-231 BT 549 細胞中進行的進一步 CoIP 試驗支持 DDX5 AURKAIP1 直接結合(圖 4B)。此外,雙重免疫熒光染色也顯示AURKAIP1 蛋白與 DDX5 蛋白的共定位(圖 4C)。綜上所述,目前的實驗證據(jù)表明 DDX5 AURKAIP1 直接相互作用。隨后研究AURKAIP1 DDX5 的具體調控作用。結果發(fā)現(xiàn),減少 AURKAIP1 能明顯降低 DDX5 蛋白水平(圖 4E),而 mRNA 水平?jīng)]有明顯變化(圖 4D)。相應地,過表達 AURKAIP1 同樣增加DDX5 蛋白水平的表達,而不是 mRNA 標準。細胞免疫熒光再次證實這一觀察結果(圖 4F),闡明AURKAIP1 可能通過翻譯后方式參與 DDX5 調節(jié)的內在機制。

       鑒于AURKAIP1DDX5之間存在調控關系,因此值得研究AURKAIP1是否通過DDX5TNBC腫瘤發(fā)揮抗癌作用。qRT-PCRWestern blot實驗均表明,在MDA-MB-231細胞中單純過表達DDX5并不能改變AURKAIP1的表達,這為DDX5作為AURKAIP1的下游分子提供了線索(圖4GH)。更令人信服的是,在 AURKAIP1 敲除細胞中過量表達 DDX5 可以逆轉沉默 AURKAIP1 CCK8(圖 4I)和跨孔遷移試驗(圖 4J)中產生的致癌表型。因此,AURKAIP1TNBC發(fā)育過程中的功能確實是由DDX5介導的。


4. AURKAIP1DDX5直接相互作用,并通過DDX5的介導促進TNBC的進展

 

4. AURKAIP1 的沉默有助于 DDX5 的泛素降解

       由于 AURKAIP1 DDX5 的影響僅停留在蛋白質水平,根據(jù)上述結果推測 AURKAIP1 可能通過降解來調節(jié) DDX5 蛋白質。為驗證這一推測,使用 CHX50 ug/ml)阻斷蛋白質的合成,并檢測到在 AURKAIP1 敲除的 MDA-MB-231 BT 549 細胞中 DDX5 的半衰期縮短了圖 5A)。耐人尋味的是,蛋白酶體抑制劑 MG132 恢復AURKAIP1 沉默引起的 DDX5 蛋白豐度下降(圖 5B)。研究進一步表明,AURKAIP1 維持DDX5 蛋白的穩(wěn)定性,從而緩解其降解。

       盡管 DDX5 的翻譯后修飾包括泛素化、磷酸化以及總和化,但上述結果表明 AURKAIP1 通過泛素化影響DDX5 的蛋白水解。為進一步證實這一點,在轉染AURKAIP1 shRNA Flag-AURKAIP1 質粒的 HEK 293T 細胞中同時轉染MYC-Ub HA-DDX5 質粒。DDX5 泛素的檢測結果表明,轉染 AURKAIP1 siRNA 后,HA-DDX5 泛素化的程度明顯高于空白對照(圖 5C)。同時,轉染 Flag-AURKAIP1時,HA-DDX5泛素化相對減少。綜上所述,這些結果表明AURKAIP1可抑制DDX5泛素化,從而減少其蛋白酶體降解。


5. AURKAIP1 通過阻止DDX5的泛素降解來穩(wěn)定DDX5

 

5. AURKAIP1 通過靶向 DDX5 觸發(fā) Wnt/β-catenin 信號通路

       對源數(shù)據(jù)集(GSE38959、GSE45827 GSE65194)進行基因組富集分析(GSEA),以揭示 AURKAIP1 功能所涉及的信號通路(圖 6A)。結果顯示,AURKAIP1 的功能與 Wnt/β-catenin 信號通路密切相關(圖6B)。此外,AURKAIP1Wnt/β-catenin信號通路的表達數(shù)據(jù)在TCGA-TNBC中顯示出明顯的正相關(圖6C)。根據(jù)這些研究證據(jù)推測AURKAIP1TNBC中是通過DDX5介導的Wnt/β-catenin信號通路調控發(fā)揮作用的。首先,TOP/FOP-閃爍熒光素酶實驗也顯示沉默AURKAIP1可以明顯抑制Wnt/β-catenin信號傳導(圖6D)。為證實AURKAIP1確實對Wnt/β-catenin信號轉導有影響,WB分析檢測β-cateninCyclinD1、c-MycMet的蛋白水平(圖6E)。不出所料,敲除 AURKAIP1 后,β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同時受到抑制,而過表達 AURKAIP1 后,β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同樣升高。此外,細胞免疫熒光也可觀察到β-catenin蛋白的變化(圖 6F)。CCK8Transwell遷移實驗再次反映出AURKAIP1確實通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路對TNBC有積極作用(圖6GH)。

       過表達 DDX5 明顯改善AURKAIP1 沉默導致的 TOP/FOP-flash 熒光素酶活性的降低(圖 6I)。同樣,敲除 AURKAIP1 導致的涉及 Wnt/β-catenin 通路的某些關鍵分子的蛋白下調也被 DDX5 的過表達所有效逆轉(圖6J)。此外,檢測AURKAIP1DDX5 β-catenin 之間的上下游關系,結果表明 AURKAIP1 可以在 β-catenin 的上游發(fā)揮正調控作用(圖 6K-M)。最終,AURKAIP1TNBC中的作用機制如圖7所示。至此,這些發(fā)現(xiàn)表明AURKAIP1TNBC中可能具有新的腫瘤促進作用,首次表明AURKAIP1在人類癌癥中確實具有獨特的作用,而這種作用并不依賴于Aurora-A的調控。


6. AURKAIP1 通過靶向DDX5激活Wnt/β-catenin信號通路

 

7. AURKAIP1-DDX5-β-catenin軸在TNBC進展中的直觀表現(xiàn)

 

結論

       綜上所述,本研究表明AURKAIP1 上調并與 TNBC 的不良預后有關。AURKAIP1可直接與DDX5蛋白相互作用并穩(wěn)定DDX5蛋白,提高其表達和β-連環(huán)蛋白活性。siRNA治療AURKAIP1可減緩腫瘤生長,這預示著AURKAIP1TNBC的腫瘤發(fā)生和侵襲性至關重要。既然AURKAIP1可以在TNBC中發(fā)揮不可忽視的作用,那么它的額外蛋白質伴侶和人類癌癥的潛在機制值得深入研究。

實驗方法

       生物信息學分析,細胞培養(yǎng),實時定量PCR,細胞瞬時轉染和構建穩(wěn)定細胞系,體外細胞增殖和遷移實驗,WBCoIP,TOP/FOP熒光素酶報告實驗,免疫熒光,免疫組化,蛋白質穩(wěn)定性檢測,體外泛素化測定,TNBC 異種移植體內腫瘤模型

參考文獻

       Tian W, Tang Y, Luo Y, Xie J, Zheng S, Zou Y, Huang X, Wu L, Zhang J, Sun Y, Tang H, Du W, Li X, Xie X. AURKAIP1 actuates tumor progression through stabilizing DDX5 in triple negative breast cancer. Cell Death Dis. 2023 Dec 1;14(12):790. doi: 10.1038/s41419-023-06115-1. PMID: 38040691; PMCID: PMC10692340.