AURKAIP1通過(guò)穩(wěn)定三陰性乳腺癌中DDX5推動(dòng)腫瘤進(jìn)展

       極光-A 激酶互作蛋白 1（AURKAIP1）作為極光-A 激酶的負(fù)調(diào)控因子，已被證明在癌癥中起著中間作用。然而，AURKAIP1本身是否以及如何直接參與調(diào)控惡性腫瘤仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，AURKAIP1在三陰性乳腺癌（TNBC）中明確上調(diào)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和預(yù)后不良呈正相關(guān)。沉默AURKAIP1可明顯抑制TNBC細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移。機(jī)制上，AURKAIP1通過(guò)阻止泛素化和降解直接與 DEAD-box螺旋酶5（DDX5）蛋白相互作用并使其穩(wěn)定。AURKAIP1沉默以DDX5依賴的方式抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性。該研究于2023年12月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. AURKAIP1在TNBC中上調(diào)，并與不利的臨床結(jié)果相關(guān)

       利用多個(gè)GEO數(shù)據(jù)集（GSE38959、GSE45827和GSE65194）篩選TNBC組織與正常乳腺樣本之間的差異表達(dá)基因（DEGs），得到TNBC樣本與正常組織相比的3835個(gè)DEGs（|log2FC|>1且FDR<0.05）（圖1A）。為進(jìn)一步縮小DEGs 的范圍，對(duì)TCGA-BRCA 數(shù)據(jù)集中的3835個(gè)DEGs 進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，篩選出16 個(gè)候選基因（圖 1B）?？偨Y(jié)目前的分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，最終確定探討AURKAIP1在 TNBC 腫瘤進(jìn)展中的作用。對(duì)TCGA-BRCA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與未配對(duì)的正常乳腺組織和非TNBC樣本相比，AURKAIP1在TNBC樣本中明顯上調(diào)（圖1C）。同時(shí)，通過(guò)評(píng)估不同AURKAIP1表達(dá)之間的生存概率，驚人地發(fā)現(xiàn)AURKAIP1的高表達(dá)與TNBC患者而非非TNBC患者較差的OS和RFS相關(guān)，這充分證明AURKAIP1可能是TNBC特異性的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖1D）。為進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，研究人員通過(guò)IHC對(duì)10名SYSUCC TNBC患者的癌組織和相匹配的鄰近非癌組織進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證AURKAIP1的高表達(dá)（圖1E）。隨后，研究人員利用含有100個(gè)TNBC樣本的組織芯片（TMA）驗(yàn)證了AURKAIP1的表達(dá)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、T期、N期和TNM分期的關(guān)系（圖1F）。結(jié)果顯示，AURKAIP1高表達(dá)的TNBC患者往往腫瘤較大、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多且臨床分期較重。此外，多變量Cox回歸分析表明，AURKAIP1 和N分期一樣，可能是 TNBC 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（圖 1G）。此外，從Kaplan-Meier生存分析來(lái)看，AURKAIP1水平較高的TNBC患者的OS概率往往較低（圖1H），這重申AURKAIP1是TNBC的一個(gè)不利特征。

圖1. 在三陰性乳腺癌（TNBC）中觀察到 AURKAIP1 表達(dá)上調(diào)，這與 TNBC 患者預(yù)后較差有關(guān)

2. AURKAIP1 表達(dá)的改變會(huì)影響 TNBC 細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移

       通過(guò)qRT-PCR和Western印跡測(cè)定AURKAIP1在不同細(xì)胞系中的mRNA和蛋白水平，結(jié)果表明，與正常乳腺細(xì)胞系MCF 10A相比，AURKAIP1在TNBC細(xì)胞中的表達(dá)量明顯更高（圖2A）。在 MDA-MB-231 和 BT 549 細(xì)胞系中敲除或過(guò)表達(dá) AURKAIP1（圖 2B）。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)（圖2D）和克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖2C）表明，基于siRNA的AURKAIP1敲除大大抑制TNBC細(xì)胞的增殖能力，而過(guò)表達(dá)AURKAIP1則完全增強(qiáng)TNBC細(xì)胞的增殖能力。重要的是，這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)的異種移植實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)（圖 2E）。進(jìn)行跨孔實(shí)驗(yàn)（圖 3A、B）和傷口愈合實(shí)驗(yàn)（圖 3C）以評(píng)估 AURKAIP1 是否影響 TNBC 細(xì)胞遷移。結(jié)果表明，AURKAIP1沉默會(huì)異常降低細(xì)胞遷移能力，而AURKAIP1過(guò)表達(dá)則顯示出相反的效果。綜上所述，AURKAIP1失活會(huì)損害體外和體內(nèi)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移。

圖2. AURKAIP1 促進(jìn)三陰性乳腺癌的細(xì)胞增殖和遷移

圖3. AURKAIP1 對(duì) TNBC 的細(xì)胞遷移有促進(jìn)作用

3. AURKAIP1 以 DDX5 介導(dǎo)的模式促進(jìn) TNBC 的發(fā)展

       采用了共免疫沉淀（CoIP）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS）的方法來(lái)研究與AURKAIP1相互作用的蛋白。在剔除用 IgG 進(jìn)行陰性對(duì)照的數(shù)據(jù)后，合并 MDA-MB-231 和 BT 549 細(xì)胞的 CoIP-MS 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) 63 個(gè)蛋白與 AURKAIP1 有相互作用（圖 4A）。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn) DDX5 在包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤中具有明確的作用機(jī)制，因此將 DDX5 確定為互作靶點(diǎn)，并進(jìn)一步研究 AURKAIP1 是否通過(guò) DDX5 媒介促進(jìn) TNBC 的發(fā)展。不出所料，在 MDA-MB-231 和 BT 549 細(xì)胞中進(jìn)行的進(jìn)一步 CoIP 試驗(yàn)支持 DDX5 與AURKAIP1 直接結(jié)合（圖 4B）。此外，雙重免疫熒光染色也顯示AURKAIP1 蛋白與 DDX5 蛋白的共定位（圖 4C）。綜上所述，目前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明 DDX5 和 AURKAIP1 直接相互作用。隨后研究AURKAIP1 對(duì) DDX5 的具體調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，減少 AURKAIP1 能明顯降低 DDX5 蛋白水平（圖 4E），而 mRNA 水平?jīng)]有明顯變化（圖 4D）。相應(yīng)地，過(guò)表達(dá) AURKAIP1 同樣增加DDX5 蛋白水平的表達(dá)，而不是 mRNA 標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞免疫熒光再次證實(shí)這一觀察結(jié)果（圖 4F），闡明AURKAIP1 可能通過(guò)翻譯后方式參與 DDX5 調(diào)節(jié)的內(nèi)在機(jī)制。

       鑒于AURKAIP1與DDX5之間存在調(diào)控關(guān)系，因此值得研究AURKAIP1是否通過(guò)DDX5對(duì)TNBC腫瘤發(fā)揮抗癌作用。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)均表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中單純過(guò)表達(dá)DDX5并不能改變AURKAIP1的表達(dá)，這為DDX5作為AURKAIP1的下游分子提供了線索（圖4G，H）。更令人信服的是，在 AURKAIP1 敲除細(xì)胞中過(guò)量表達(dá) DDX5 可以逆轉(zhuǎn)沉默 AURKAIP1 在 CCK8（圖 4I）和跨孔遷移試驗(yàn)（圖 4J）中產(chǎn)生的致癌表型。因此，AURKAIP1在TNBC發(fā)育過(guò)程中的功能確實(shí)是由DDX5介導(dǎo)的。

圖4. AURKAIP1與DDX5直接相互作用，并通過(guò)DDX5的介導(dǎo)促進(jìn)TNBC的進(jìn)展

4. AURKAIP1 的沉默有助于 DDX5 的泛素降解

       由于 AURKAIP1 對(duì) DDX5 的影響僅停留在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)上述結(jié)果推測(cè) AURKAIP1 可能通過(guò)降解來(lái)調(diào)節(jié) DDX5 蛋白質(zhì)。為驗(yàn)證這一推測(cè)，使用 CHX（50 ug/ml）阻斷蛋白質(zhì)的合成，并檢測(cè)到在 AURKAIP1 敲除的 MDA-MB-231 和 BT 549 細(xì)胞中 DDX5 的半衰期縮短了圖 5A）。耐人尋味的是，蛋白酶體抑制劑 MG132 恢復(fù)AURKAIP1 沉默引起的 DDX5 蛋白豐度下降（圖 5B）。研究進(jìn)一步表明，AURKAIP1 維持DDX5 蛋白的穩(wěn)定性，從而緩解其降解。

       盡管 DDX5 的翻譯后修飾包括泛素化、磷酸化以及總和化，但上述結(jié)果表明 AURKAIP1 通過(guò)泛素化影響DDX5 的蛋白水解。為進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，在轉(zhuǎn)染AURKAIP1 shRNA 或 Flag-AURKAIP1 質(zhì)粒的 HEK 293T 細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染MYC-Ub 和 HA-DDX5 質(zhì)粒。DDX5 泛素的檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 AURKAIP1 siRNA 后，HA-DDX5 泛素化的程度明顯高于空白對(duì)照（圖 5C）。同時(shí)，轉(zhuǎn)染 Flag-AURKAIP1時(shí)，HA-DDX5泛素化相對(duì)減少。綜上所述，這些結(jié)果表明AURKAIP1可抑制DDX5泛素化，從而減少其蛋白酶體降解。

圖5. AURKAIP1 通過(guò)阻止DDX5的泛素降解來(lái)穩(wěn)定DDX5

5. AURKAIP1 通過(guò)靶向 DDX5 觸發(fā) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路

       對(duì)源數(shù)據(jù)集（GSE38959、GSE45827 和 GSE65194）進(jìn)行基因組富集分析（GSEA），以揭示 AURKAIP1 功能所涉及的信號(hào)通路（圖 6A）。結(jié)果顯示，AURKAIP1 的功能與 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路密切相關(guān)（圖6B）。此外，AURKAIP1與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)數(shù)據(jù)在TCGA-TNBC中顯示出明顯的正相關(guān)（圖6C）。根據(jù)這些研究證據(jù)推測(cè)AURKAIP1在TNBC中是通過(guò)DDX5介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控發(fā)揮作用的。首先，TOP/FOP-閃爍熒光素酶實(shí)驗(yàn)也顯示沉默AURKAIP1可以明顯抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)（圖6D）。為證實(shí)AURKAIP1確實(shí)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有影響，WB分析檢測(cè)β-catenin、CyclinD1、c-Myc和Met的蛋白水平（圖6E）。不出所料，敲除 AURKAIP1 后，β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同時(shí)受到抑制，而過(guò)表達(dá) AURKAIP1 后，β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同樣升高。此外，細(xì)胞免疫熒光也可觀察到β-catenin蛋白的變化（圖 6F）。CCK8和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)再次反映出AURKAIP1確實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)TNBC有積極作用（圖6G，H）。

       過(guò)表達(dá) DDX5 明顯改善AURKAIP1 沉默導(dǎo)致的 TOP/FOP-flash 熒光素酶活性的降低（圖 6I）。同樣，敲除 AURKAIP1 導(dǎo)致的涉及 Wnt/β-catenin 通路的某些關(guān)鍵分子的蛋白下調(diào)也被 DDX5 的過(guò)表達(dá)所有效逆轉(zhuǎn)（圖6J）。此外，檢測(cè)AURKAIP1、DDX5 和 β-catenin 之間的上下游關(guān)系，結(jié)果表明 AURKAIP1 可以在 β-catenin 的上游發(fā)揮正調(diào)控作用（圖 6K-M）。最終，AURKAIP1在TNBC中的作用機(jī)制如圖7所示。至此，這些發(fā)現(xiàn)表明AURKAIP1在TNBC中可能具有新的腫瘤促進(jìn)作用，首次表明AURKAIP1在人類癌癥中確實(shí)具有獨(dú)特的作用，而這種作用并不依賴于Aurora-A的調(diào)控。

圖6. AURKAIP1 通過(guò)靶向DDX5激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路

圖7. AURKAIP1-DDX5-β-catenin軸在TNBC進(jìn)展中的直觀表現(xiàn)

結(jié)論

       綜上所述，本研究表明AURKAIP1 上調(diào)并與 TNBC 的不良預(yù)后有關(guān)。AURKAIP1可直接與DDX5蛋白相互作用并穩(wěn)定DDX5蛋白，提高其表達(dá)和β-連環(huán)蛋白活性。siRNA治療AURKAIP1可減緩腫瘤生長(zhǎng)，這預(yù)示著AURKAIP1對(duì)TNBC的腫瘤發(fā)生和侵襲性至關(guān)重要。既然AURKAIP1可以在TNBC中發(fā)揮不可忽視的作用，那么它的額外蛋白質(zhì)伴侶和人類癌癥的潛在機(jī)制值得深入研究。

實(shí)驗(yàn)方法

       生物信息學(xué)分析，細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)時(shí)定量PCR，細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，體外細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)，WB，CoIP，TOP/FOP熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，免疫熒光，免疫組化，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)，體外泛素化測(cè)定，TNBC 異種移植體內(nèi)腫瘤模型

參考文獻(xiàn)

       Tian W, Tang Y, Luo Y, Xie J, Zheng S, Zou Y, Huang X, Wu L, Zhang J, Sun Y, Tang H, Du W, Li X, Xie X. AURKAIP1 actuates tumor progression through stabilizing DDX5 in triple negative breast cancer. Cell Death Dis. 2023 Dec 1;14(12):790. doi: 10.1038/s41419-023-06115-1. PMID: 38040691; PMCID: PMC10692340.