心肌缺血再灌注(I/R)損傷伴隨著心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡,表現(xiàn)為交感神經(jīng)張力過度激活和迷走神經(jīng)活性降低。在我們之前的研究中,我們率先開發(fā)了磁迷走神經(jīng)刺激(mVNS)系統(tǒng)。該系統(tǒng)能精確刺激迷走神經(jīng),對心肌梗死具有顯著的療效和安全性。然而,mVNS是否可以減輕心肌I/R損傷及其具體的潛在機制仍不確定。本研究采用大鼠心肌I/R損傷模型,探討mVNS對這類損傷的治療潛力。我們的研究結(jié)果顯示,mVNS治療導致心肌梗死面積減少,心室顫動(VF)發(fā)生率降低,炎癥細胞因子釋放抑制。從機制上講,mVNS通過M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制NLRP3介導的心肌焦亡,對心肌I/R損傷有有益作用??偟膩碚f,這些結(jié)果突出了mVNS作為心肌I/R損傷治療策略的潛力。本文于2023年11月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”(IF=10.2)上。
技術(shù)路線
結(jié)果:
1)磁刺激系統(tǒng)和磁迷走神經(jīng)刺激的建立
我們成功合成了SPIOCS/GP溫度敏感水凝膠(圖1A)。在動物實驗中,我們首先分離SD大鼠右側(cè)迷走神經(jīng),然后將SPIO-CS/GP水凝膠涂覆在迷走神經(jīng)表面,一旦錐體磁鐵經(jīng)過,對右側(cè)迷走神經(jīng)進行磁刺激(圖1B)。圖1C顯示了mVNS治療心肌I/R損傷的示意圖(圖1C)。
2)mVNS治療可減輕心肌I/R損傷、心室顫動和炎性細胞因子釋放
與I/R組相比,mVNS明顯減少了心臟梗死面積,改善了心功能(圖2A和B),而mVNS治療顯著降低了I/R損傷引起的血清心肌酶濃度升高(圖2C)。采用I/R致室性心律失常模型評估mVNS治療的抗心律失常效果。再灌注結(jié)束時,在程序電刺激后收集心電圖數(shù)據(jù)(圖2D)。我們發(fā)現(xiàn)mVNS可以顯著降低I/R誘導的VF的發(fā)生率和持續(xù)時間(圖2E, F)。結(jié)果還顯示,與假手術(shù)組相比,I/R損傷顯著增加了心率,而mVNS明顯降低I/R損傷引起的高心率(圖2G)。此外,與假手術(shù)組相比,I/R大鼠心肌炎癥細胞浸潤和IL-6表達均顯著升高。然而,mVNS治療減輕了心肌中炎癥細胞浸潤和IL-6的表達(圖2H)。血清中IL-6、TNF-α的表達也出現(xiàn)類似變化。mVNS可逆轉(zhuǎn)I/R誘導的血清IL-6和TNF-α濃度升高(圖2I)。
3)mVNS可減輕心肌I/R損傷所致的心肌焦亡
我們測量了心肌中Tunel陽性心肌細胞。結(jié)果顯示,與I/R組相比,mVSN治療有效緩解了Tunel陽性心肌細胞(圖3A)。隨后,我們評估了I/R損傷大鼠心肌組織內(nèi)的焦亡指標。值得注意的是,與假手術(shù)組相比,I/R組NLRP3心肌表達明顯升高(圖3B-D)。心肌中Cleaved caspase-1和Cleaved N端GSDMD表達升高(圖3C和D),I/R組大量炎癥因子(IL-1β和IL-18)釋放(圖3E)。然而,mVNS治療后心肌組織內(nèi)的焦亡相關(guān)蛋白水平和炎癥因子的釋放均有所減輕(圖3B-E)。提示mVNS具有抑制I/R誘導的焦亡的能力。
4)mVNS通過抑制OGDHL表達和改善線粒體損傷來調(diào)節(jié)心肌焦亡
我們初步證實,心肌I/R損傷時OGDHL的表達和活性顯著升高,而mVNS可以逆轉(zhuǎn)OGDHL的表達和活性上調(diào)(圖4A)。為了驗證OGDHL在mVNS減輕心肌焦亡中的作用,我們使用AAV9-cTNT-OGDHL在心肌中過表達OGDHL的表達。Western blot結(jié)果顯示,病毒轉(zhuǎn)染心肌后,OGDHL的表達明顯升高(圖4B)。Evans Blue/TTC雙染色顯示,OGDHL過表達減弱了mVNS減小心肌梗死大小的作用(圖4C)。超聲心動圖顯示OGDHL過表達削弱了mVNS對心功能的改善(圖4D)。同樣,提高OGDHL的表達水平也會阻礙mVNS減輕心肌焦亡和炎癥細胞因子釋放的能力(圖4F-4H)。我們進一步檢測了心肌組織的線粒體,發(fā)現(xiàn)mVNS顯著改善心肌I/R損傷引起的線粒體結(jié)構(gòu)損傷和mtROS的產(chǎn)生。然而,OGDHL過表達阻礙了mVNS介導的線粒體損傷改善和心肌中mtROS的產(chǎn)生(圖4I, J)。
5)ACh通過逆轉(zhuǎn)OGDHL表達升高和減輕線粒體損傷來減少焦亡
首先,我們證實了體外H/R模型誘導焦亡的有效性和ACh的有效性(圖5A)。我們通過OGD和再氧化驗證了OGDHL表達和活性的升高,而ACh被發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)NRCM中OGDHL和活性的上調(diào)(圖5B)。為了證實OGDHL參與了ACh對焦亡的緩解作用,我們利用Ad-OGDHL上調(diào)了NRCM中OGDHL的表達。Western blot分析顯示,轉(zhuǎn)染Ad-OGDHL后,NRCM中OGDHL的表達顯著增加(圖5C)。如圖5D所示,ACh處理逆轉(zhuǎn)了H/R存在下裂解的GSDMD-N從細胞質(zhì)溶質(zhì)到質(zhì)膜的移位,而OGDHL過表達減弱了ACh對裂解的GSDMD-N移位的影響(圖5D)。此外,我們的研究表明,NRCM中OGDHL的過表達抑制了ACh在減輕焦亡相關(guān)蛋白表達方面的有益作用(圖5E, F)。此外,我們評估了NRCM的mtROS和線粒體功能。結(jié)果表明,OGD和再氧化導致大量mtROS的產(chǎn)生和顯著的線粒體損傷,ACh處理抑制ROS的產(chǎn)生,改善線粒體結(jié)構(gòu),增強ATP的產(chǎn)生。而OGDHL過表達則阻礙了ACh介導的NRCM線粒體損傷和mtROS產(chǎn)生的改善(圖5G-5I)。
6)mVNS激活M2AChR抑制體內(nèi)OGDHL的表達和焦亡
為了進一步研究M2AChR是否參與mVNS的抗焦亡作用,我們利用M2AChR拮抗劑Otenzepad抑制M2AChR的激活。結(jié)果顯示,M2AChR拮抗劑Otenzepad減弱了mVNS減小心肌梗死大小和改善心功能的作用(圖6A和B)。進一步的研究表明,mVNS的抗焦亡作用也通過抑制M2AChR的活性而受到抑制(圖6D-F)。同樣,我們還觀察到M2AChR拮抗劑Otenzepad促進OGDHL表達,隨后導致心臟組織中ROS產(chǎn)生的增加(圖6E和G)。
7)ACh激活M2AChR抑制OGDHL的表達和活性以對抗焦亡
我們還評估了M2AChR拮抗劑Otenzepad對ACh體外抑制作用的影響。結(jié)果顯示,Otenzepad減弱了ACh對抑制OGDHL表達水平的影響(圖7A)。mtROS熒光染色顯示,M2AChR拮抗劑Otenzepad降低了ACh抑制過量mtROS生成的作用(圖7B)。正如預期的那樣,M2AChR拮抗劑Otenzepad也抑制了ACh抑制NRCM中裂解的GSDMD-N易位的作用(圖7C)。
結(jié)論:
mVNS治療通過M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制心肌焦亡,從而減輕心肌I/R損傷。我們的研究結(jié)果強調(diào)了mVNS對心肌I/R損傷的治療潛力,具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價值。
實驗方法:
動物心肌I/R模型,SPIO-CS/GP水凝膠注射和磁迷走神經(jīng)刺激,梗死面積測定,心功能評估,程控電刺激,心率變異性(HRV)分析,免疫組織化學染色,Elisa檢測,Tunel染色,心肌超微結(jié)構(gòu)檢查,AAV9-cTNT-OGDHL治療,細胞培養(yǎng)和處理,ATP測定,免疫熒光,腺病毒構(gòu)建與細胞感染,免疫印跡分析
參考文獻:
Lu Y, Chen K, Zhao W, Hua Y, Bao S, Zhang J, Wu T, Ge G, Yu Y, Sun J, Zhang F. Magnetic vagus nerve stimulation alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by the inhibition of pyroptosis through the M2AChR/OGDHL/ROS axis in rats. J Nanobiotechnology. 2023 Nov 14;21(1):421. doi: 10.1186/s12951-023-02189-3.