磁迷走神經(jīng)刺激通過(guò)抑制焦亡減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷

         心肌缺血再灌注(I/R)損傷伴隨著心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡，表現(xiàn)為交感神經(jīng)張力過(guò)度激活和迷走神經(jīng)活性降低。在我們之前的研究中，我們率先開(kāi)發(fā)了磁迷走神經(jīng)刺激(mVNS)系統(tǒng)。該系統(tǒng)能精確刺激迷走神經(jīng)，對(duì)心肌梗死具有顯著的療效和安全性。然而，mVNS是否可以減輕心肌I/R損傷及其具體的潛在機(jī)制仍不確定。本研究采用大鼠心肌I/R損傷模型，探討mVNS對(duì)這類(lèi)損傷的治療潛力。我們的研究結(jié)果顯示，mVNS治療導(dǎo)致心肌梗死面積減少，心室顫動(dòng)(VF)發(fā)生率降低，炎癥細(xì)胞因子釋放抑制。從機(jī)制上講，mVNS通過(guò)M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制NLRP3介導(dǎo)的心肌焦亡，對(duì)心肌I/R損傷有有益作用?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果突出了mVNS作為心肌I/R損傷治療策略的潛力。本文于2023年11月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.2）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）磁刺激系統(tǒng)和磁迷走神經(jīng)刺激的建立

         我們成功合成了SPIOCS/GP溫度敏感水凝膠(圖1A)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們首先分離SD大鼠右側(cè)迷走神經(jīng)，然后將SPIO-CS/GP水凝膠涂覆在迷走神經(jīng)表面，一旦錐體磁鐵經(jīng)過(guò)，對(duì)右側(cè)迷走神經(jīng)進(jìn)行磁刺激(圖1B)。圖1C顯示了mVNS治療心肌I/R損傷的示意圖(圖1C)。

2）mVNS治療可減輕心肌I/R損傷、心室顫動(dòng)和炎性細(xì)胞因子釋放

         與I/R組相比，mVNS明顯減少了心臟梗死面積，改善了心功能(圖2A和B)，而mVNS治療顯著降低了I/R損傷引起的血清心肌酶濃度升高(圖2C)。采用I/R致室性心律失常模型評(píng)估mVNS治療的抗心律失常效果。再灌注結(jié)束時(shí)，在程序電刺激后收集心電圖數(shù)據(jù)(圖2D)。我們發(fā)現(xiàn)mVNS可以顯著降低I/R誘導(dǎo)的VF的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間(圖2E, F)。結(jié)果還顯示，與假手術(shù)組相比，I/R損傷顯著增加了心率，而mVNS明顯降低I/R損傷引起的高心率(圖2G)。此外，與假手術(shù)組相比，I/R大鼠心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-6表達(dá)均顯著升高。然而，mVNS治療減輕了心肌中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-6的表達(dá)(圖2H)。血清中IL-6、TNF-α的表達(dá)也出現(xiàn)類(lèi)似變化。mVNS可逆轉(zhuǎn)I/R誘導(dǎo)的血清IL-6和TNF-α濃度升高(圖2I)。

3）mVNS可減輕心肌I/R損傷所致的心肌焦亡

         我們測(cè)量了心肌中Tunel陽(yáng)性心肌細(xì)胞。結(jié)果顯示，與I/R組相比，mVSN治療有效緩解了Tunel陽(yáng)性心肌細(xì)胞(圖3A)。隨后，我們?cè)u(píng)估了I/R損傷大鼠心肌組織內(nèi)的焦亡指標(biāo)。值得注意的是，與假手術(shù)組相比，I/R組NLRP3心肌表達(dá)明顯升高(圖3B-D)。心肌中Cleaved caspase-1和Cleaved N端GSDMD表達(dá)升高(圖3C和D)，I/R組大量炎癥因子(IL-1β和IL-18)釋放(圖3E)。然而，mVNS治療后心肌組織內(nèi)的焦亡相關(guān)蛋白水平和炎癥因子的釋放均有所減輕(圖3B-E)。提示mVNS具有抑制I/R誘導(dǎo)的焦亡的能力。

4）mVNS通過(guò)抑制OGDHL表達(dá)和改善線粒體損傷來(lái)調(diào)節(jié)心肌焦亡

         我們初步證實(shí)，心肌I/R損傷時(shí)OGDHL的表達(dá)和活性顯著升高，而mVNS可以逆轉(zhuǎn)OGDHL的表達(dá)和活性上調(diào)(圖4A)。為了驗(yàn)證OGDHL在mVNS減輕心肌焦亡中的作用，我們使用AAV9-cTNT-OGDHL在心肌中過(guò)表達(dá)OGDHL的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，病毒轉(zhuǎn)染心肌后，OGDHL的表達(dá)明顯升高(圖4B)。Evans Blue/TTC雙染色顯示，OGDHL過(guò)表達(dá)減弱了mVNS減小心肌梗死大小的作用(圖4C)。超聲心動(dòng)圖顯示OGDHL過(guò)表達(dá)削弱了mVNS對(duì)心功能的改善(圖4D)。同樣，提高OGDHL的表達(dá)水平也會(huì)阻礙mVNS減輕心肌焦亡和炎癥細(xì)胞因子釋放的能力(圖4F-4H)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了心肌組織的線粒體，發(fā)現(xiàn)mVNS顯著改善心肌I/R損傷引起的線粒體結(jié)構(gòu)損傷和mtROS的產(chǎn)生。然而，OGDHL過(guò)表達(dá)阻礙了mVNS介導(dǎo)的線粒體損傷改善和心肌中mtROS的產(chǎn)生(圖4I, J)。

5）ACh通過(guò)逆轉(zhuǎn)OGDHL表達(dá)升高和減輕線粒體損傷來(lái)減少焦亡

         首先，我們證實(shí)了體外H/R模型誘導(dǎo)焦亡的有效性和ACh的有效性(圖5A)。我們通過(guò)OGD和再氧化驗(yàn)證了OGDHL表達(dá)和活性的升高，而ACh被發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)NRCM中OGDHL和活性的上調(diào)(圖5B)。為了證實(shí)OGDHL參與了ACh對(duì)焦亡的緩解作用，我們利用Ad-OGDHL上調(diào)了NRCM中OGDHL的表達(dá)。Western blot分析顯示，轉(zhuǎn)染Ad-OGDHL后，NRCM中OGDHL的表達(dá)顯著增加(圖5C)。如圖5D所示，ACh處理逆轉(zhuǎn)了H/R存在下裂解的GSDMD-N從細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)到質(zhì)膜的移位，而OGDHL過(guò)表達(dá)減弱了ACh對(duì)裂解的GSDMD-N移位的影響(圖5D)。此外，我們的研究表明，NRCM中OGDHL的過(guò)表達(dá)抑制了ACh在減輕焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)方面的有益作用(圖5E, F)。此外，我們?cè)u(píng)估了NRCM的mtROS和線粒體功能。結(jié)果表明，OGD和再氧化導(dǎo)致大量mtROS的產(chǎn)生和顯著的線粒體損傷，ACh處理抑制ROS的產(chǎn)生，改善線粒體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)ATP的產(chǎn)生。而OGDHL過(guò)表達(dá)則阻礙了ACh介導(dǎo)的NRCM線粒體損傷和mtROS產(chǎn)生的改善(圖5G-5I)。

6）mVNS激活M2AChR抑制體內(nèi)OGDHL的表達(dá)和焦亡

         為了進(jìn)一步研究M2AChR是否參與mVNS的抗焦亡作用，我們利用M2AChR拮抗劑Otenzepad抑制M2AChR的激活。結(jié)果顯示，M2AChR拮抗劑Otenzepad減弱了mVNS減小心肌梗死大小和改善心功能的作用(圖6A和B)。進(jìn)一步的研究表明，mVNS的抗焦亡作用也通過(guò)抑制M2AChR的活性而受到抑制(圖6D-F)。同樣，我們還觀察到M2AChR拮抗劑Otenzepad促進(jìn)OGDHL表達(dá)，隨后導(dǎo)致心臟組織中ROS產(chǎn)生的增加(圖6E和G)。

7）ACh激活M2AChR抑制OGDHL的表達(dá)和活性以對(duì)抗焦亡

         我們還評(píng)估了M2AChR拮抗劑Otenzepad對(duì)ACh體外抑制作用的影響。結(jié)果顯示，Otenzepad減弱了ACh對(duì)抑制OGDHL表達(dá)水平的影響(圖7A)。mtROS熒光染色顯示，M2AChR拮抗劑Otenzepad降低了ACh抑制過(guò)量mtROS生成的作用(圖7B)。正如預(yù)期的那樣，M2AChR拮抗劑Otenzepad也抑制了ACh抑制NRCM中裂解的GSDMD-N易位的作用(圖7C)。

結(jié)論：

         mVNS治療通過(guò)M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制心肌焦亡，從而減輕心肌I/R損傷。我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了mVNS對(duì)心肌I/R損傷的治療潛力，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)方法：

         動(dòng)物心肌I/R模型，SPIO-CS/GP水凝膠注射和磁迷走神經(jīng)刺激，梗死面積測(cè)定，心功能評(píng)估，程控電刺激，心率變異性(HRV)分析，免疫組織化學(xué)染色，Elisa檢測(cè)，Tunel染色，心肌超微結(jié)構(gòu)檢查，AAV9-cTNT-OGDHL治療，細(xì)胞培養(yǎng)和處理，ATP測(cè)定，免疫熒光，腺病毒構(gòu)建與細(xì)胞感染，免疫印跡分析

參考文獻(xiàn)：

         Lu Y, Chen K, Zhao W, Hua Y, Bao S, Zhang J, Wu T, Ge G, Yu Y, Sun J, Zhang F. Magnetic vagus nerve stimulation alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by the inhibition of pyroptosis through the M2AChR/OGDHL/ROS axis in rats. J Nanobiotechnology. 2023 Nov 14;21(1):421. doi: 10.1186/s12951-023-02189-3.