TREM2巨噬細胞通過SLC25A53重編程代謝促進心肌梗死心臟修復
心肌梗死（Myculal Infarction，MI）是常見的一種死亡原因，盡管可通過血運重建和藥物進行治療，但MI的死亡率并沒有顯著下降，對人類健康造成了嚴重威脅。MI的修復過程中需要單核細胞/巨噬細胞的及時參與以清除死亡的心肌細胞，并保持局部心肌中促炎和抗炎因子之間的平衡。髓樣細胞觸發(fā)受體2（Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2，TREM2）參與調(diào)節(jié)多種細胞反應，包括胞葬、細胞存活和炎癥。以往的研究主要集中在TREM2參與慢性疾病，而其在急性疾?。ㄈ缧募」Ｋ溃┲械淖饔蒙胁磺宄?。本研究旨在探討TREM2在心肌梗死中的作用，并闡明其在心臟修復過程中的功能。具體而言，作者觀察到TREM2影響巨噬細胞胞葬糖代謝和抗炎途徑，且TREM2在巨噬細胞中的過度表達可以改善心肌梗死后心臟功能的惡化，這是一種有希望的MI治療方法?？傊?，本研究揭示了巨噬細胞特異性TREM2在心肌梗死中的新作用，將胞葬與心臟修復過程中的免疫代謝聯(lián)系起來。
該研究于2024年1月5日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》，IF：12.4
技術路線
主要研究結果
1. TREM2+巨噬細胞參與MI早期階段
作者已確認了表達TREM2的主要細胞類型是巨噬細胞。接下來為了闡明TREM2在MI中的作用，首先檢測了心肌梗死后（post-MI）心臟中TREM2的表達，發(fā)現(xiàn)TREM2的表達水平顯著高于假心梗組，提示TREM2的表達與缺血激發(fā)的反應有關（圖1A-C）。值得注意的是，post-MI TREM2的表達表現(xiàn)出時間模式。post-MI第1天，TREM2的表達水平開始增加，第3天顯著升高，第7天達到峰值，最終恢復到基線（圖1A-C）。進一步研究MI不同區(qū)域的TREM2表達，發(fā)現(xiàn)它主要表達在MI邊緣區(qū)和缺血區(qū)（圖1A-C）。.此外，大多數(shù)TREM2+細胞為CD68+巨噬細胞，而不是Ly6G+中性粒細胞（圖1E-G）?？紤]到TREM2+中性粒細胞浸潤缺血性心臟組織的轉運募集，且TREM2+巨噬細胞在post-MI修復過程中存在時間較長，作者決定將研究重點放在MI中的TREM2+巨噬細胞上。
在WT小鼠中post-MI TREM2+巨噬細胞主要是CCR2+MHCIIlow細胞（圖1H，I為第3天和第7天），表明TREM2+巨噬細胞傾向于表現(xiàn)出抗炎表型。此外，對從MI患者獲得的外周血單個核細胞（PBMCs）中TREM2的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)MI患者的TREM2的水平升高，且在3-5天觀察到水平最高的。重要的是，這種TREM2表達的增加并不歸因于循環(huán)單核細胞數(shù)量的增加，根據(jù)人類單核細胞CD14正常表達后（圖1J）的實驗結果證實。提示MI患者PBMC中TREM2表達的升高可能是由于TREM2表達的誘導，而不是單核細胞群體的變化。
圖1：TREM2主要在免疫組織中表達，MI應激誘導TREM2表達
2. 巨噬細胞特異性TREM2缺失加重MI損傷
為了研究TREM2+巨噬細胞對MI的特異性影響，通過LysMCre小鼠與TREM2flox/flox小鼠雜交條件性敲除巨噬細胞中TREM2，并與對照小鼠（TREM2flox/flox）進行了比較。巨噬細胞中TREM2敲除后導致心功能顯著下降，如EF和FS減少，以及LVED和LVESV等與post-MI對照組相比增加（圖2A，B）。此外，Masson三色染色顯示整個心臟的一系列切片纖維化減少，以及Mac-TREM2 KO組梗死區(qū)左心室壁厚度顯著減少（圖2C，D）。接下來，作者對post-MI心臟的死細胞清除、血管生成和纖維化產(chǎn)生進行了組織學評估。與對照組相比，Mac-TREM2 KO小鼠的ACs（凋亡心肌細胞）顯著增加（圖2E，G）。此外，纖維化標志物，如Vimentin、α-SMA以及增殖標志物Ki67的免疫熒光染色顯示Mac-TREM2 KO組纖維化產(chǎn)生較少（圖2F，H，I）。這些發(fā)現(xiàn)表明Mac-TREM2 KO小鼠壞死細胞清除受損，纖維化產(chǎn)生減少。然而，兩組之間的血管生成沒有觀察到顯著差異（圖2J）。
此外，對巨噬細胞亞群進行了細胞學評估，發(fā)現(xiàn)MI組TREM2敲除小鼠在梗死后7天表現(xiàn)出MHCIIlow巨噬細胞水平顯著降低（圖2K，L）。這些發(fā)現(xiàn)表明TREM2可能調(diào)節(jié)post-MI巨噬細胞的功能和極化。為了進一步確認在MI中發(fā)揮主要作用的巨噬細胞來源，用CCR2趨化因子受體拮抗劑RS504393阻斷了循環(huán)單核細胞的招募，這不影響常駐巨噬細胞群體。有趣的是，CCR2抑制劑導致對照組EF減少和梗死面積增加，但它不影響Mac-TREM2 KO小鼠的post-MI心臟功能（圖2M，N）。這表明在MI中發(fā)揮作用的是招募的CCR2+TREM2+巨噬細胞。
圖2：巨噬細胞中TREM2的條件敲除對MI小鼠心臟的影響
3. 巨噬細胞中TREM2缺失抑制胞葬
通過生物信息學分析（GSE98563）觀察到TREM2巨噬細胞主要與增強的吞噬作用相關（圖3A）。此外，吞噬細胞和溶酶體相關基因的表達在TREM2 KO巨噬細胞中明顯較低，但在過表達TREM2的巨噬細胞中較高（圖3B-D）。為了評估TREM2+巨噬細胞在缺血性心臟病中的胞葬能力，Tdtomato+或ZsGreen+小鼠LAD結扎后從缺血心臟獲得的Td+或Zs+標記的ACs與巨噬細胞共培養(yǎng)。體內(nèi)，Td+或Zs+標記的ACs注射到對照組和Mac-TREM2 KO小鼠的腹腔和心肌中。體外，過表達TREM2的RAW264.7細胞孵育Td+ACs。正如預期的那樣，體內(nèi)和體外實驗的結果都支持了TREM2促進巨噬細胞胞葬的假設（圖3E-H）。我們進一步評估了心臟內(nèi)巨噬細胞吞噬心肌細胞的能力。Ter119+CD68+巨噬細胞數(shù)量顯著減少，普魯士藍染色減少，進一步證實post-MI第7天Trem2缺失與巨噬細胞吞噬功能缺陷相關。
圖3：TREM2缺失減弱巨噬細胞的胞葬能力
4. TREM2+巨噬細胞通過胞葬調(diào)控SYK-SMAD4信號通路抑制SLC25A53表達
為了深入了解TREM2如何影響巨噬細胞功能的潛在機制，對CCR2cre-EGFP和CCR2cre-EGFP TREM2flox/flox小鼠post-MI第7天的CCR2+細胞進行了RNA-seq。發(fā)現(xiàn)在MI發(fā)生中，TREM2 KO巨噬細胞經(jīng)歷了幾個與吞噬相關過程、碳水化合物代謝相關的轉錄程序改變（圖4A）。此外，SLC25A53被鑒定為TREM2 KO巨噬細胞體外（GSE98563）的差異表達基因，SLC家族與胞葬和體內(nèi)代謝相關（圖4B）。SLC程序在胞葬后被激活，這表明代謝程序發(fā)生了轉變，在這種轉變中改變的代謝物可以影響微環(huán)境中的大量細胞。在TREM2 KO BMDM中，ACs刺激下SLC25A53表達增加，而在吞噬抑制劑細胞松弛素D處理后減少，這表明巨噬細胞中TREM2影響SLC25A53的表達（圖4C，D）。為了探索TREM2如何調(diào)節(jié)SLC25A53，用KnockTF篩選潛在的調(diào)節(jié)因子。結果表明SMAD4是關鍵的調(diào)節(jié)因子（圖4E），TREM2可能通過激活SYK促進SMAD4的表達。在對照組和TREM2 KO細胞間驗證這一假設（圖4F）。使用SYK抑制劑或SMAD4抑制劑能夠挽救表型，證明SYK-SMAD4-SLC25A53信號通路（圖4G）。綜上得出結論，TREM2在胞葬后通過SYK-SMAD4抑制SLC25A53的表達。
圖4：胞葬后TREM2+巨噬細胞通過SYK-SMAD4-SLC25A53途徑下調(diào)SLC25A53表達
5. TREM2+巨噬細胞通過胞葬后影響線粒體SLC25A53轉運NAD+
已有研究結果促使作者進一步研究SLC25A53的功能。該基因有一個能將NAD+導入線粒體哺乳動物轉運體中的重要同源物SLC25A51。因此，作者懷疑SLC25A53也可以轉運NAD+。為了探索這一假設，首先采用AutoDock Vina模擬SLC25A53和NAD+之間的分子對接，結合能為-8 kcal/mol，表明二者具有很強的真正結合潛力（圖5A）。接下來評估了SLC25A53體外轉運NAD+的能力。TREM2 KO中，線粒體NAD+水平顯著增加，但細胞松弛素D處理后這種增加消失了（圖5B）。此外，轉染si-SLC25A53后，TREM2 KO線粒體中NAD+水平升高受到抑制（圖5C）。在不添加NAD+的情況下，si-SLC25A53組線粒體NAD+水平幾乎與NAD+合成抑制劑FK866處理組相當，而外源性NAD+并沒有增加si-SLC25A53中線粒體NAD+的含量（圖5D）。這表明在TREM2+巨噬細胞中線粒體轉運NAD+時SLC25A53起了作用，但對NAD+的整體細胞水平?jīng)]有影響。
6. TREM2通過SLC25A53促進巨噬細胞中衣康酸生成
研究表明，胞葬后發(fā)生代謝重編程，胞葬的代謝副產(chǎn)物可以影響周圍的細胞。post-MI Mac-TREM2 KO中ACs減少和纖維化增加，為了調(diào)查TREM2+巨噬細胞是否分泌影響缺血微環(huán)境內(nèi)心肌細胞或成纖維細胞的產(chǎn)物。作者先使用壞死心肌細胞的上清液來刺激對照和Mac-TREM2 KO BMDMs，然后收集這些BMDMs的條件上清來刺激缺血和缺氧心肌細胞以及成纖維細胞。值得注意的是，來自TREM2 KO巨噬細胞的上清液處理時觀察到心肌細胞凋亡的增加和成纖維細胞增殖的減少（圖5E，F(xiàn)）。根據(jù)已有的研究結果和文獻，提出了一個新假設，即TREM2+巨噬細胞通過胞葬后下調(diào)SLC25A53的表達，從而影響糖代謝，其代謝副產(chǎn)物可能對心肌細胞和成纖維細胞產(chǎn)生影響。
為了驗證猜想并尋找可能的代謝物，作者將凋亡的H9C2細胞與BMDM一起孵育，然后對分離的線粒體進行LC-MS代謝譜分析。觀察到TREM2 KO BMDM中TCA循環(huán)代謝物的水平較高（圖5G），在分析的代謝物中，衣康酸是最顯著的代謝物（圖5H）。比較衣康酸衍生物4-OI和衣康酸對缺血和缺氧條件下心肌細胞或成纖維細胞的影響。結果表明4-OI和衣康酸處理組均表現(xiàn)出較高的成纖維細胞增殖（圖5I）和較低的細胞凋亡。衣康酸來源于巨噬細胞中TCA循環(huán)中的順烏頭酸，這種有機酸被認為是代謝過程中異檸檬酸（ICIT）轉化為氧戊二酸（AKG）時潛在斷點的結果。此外，干擾NAD+運輸進入線粒體后TCA循環(huán)中斷，這種干擾與導致衣康酸產(chǎn)生的斷點相吻合。這表明TREM2+巨噬細胞中的SLC25A53下調(diào)通過非活性NAD+運輸中斷TCA循環(huán)導致衣康酸上調(diào)（圖5J）。
圖5：TREM2+巨噬細胞通過SLC25A53影響線粒體NAD+的轉運進而促進衣康酸釋放
7. 注射TREM2腺病毒后改善左心室重構
小鼠LAD結扎后立即向心肌注射TREM2（Ad-TREM2）腺病毒和對照（Ad-NC）腺病毒來進行挽救實驗，以驗證TREM2在體內(nèi)的效果。接受Ad-TREM2治療的小鼠在post-MI第7天的EF顯著提高（圖6A）。此外，Ad-TREM2組表現(xiàn)出更好的LV重塑（圖6B、C），TREM2表達較高，SLC25A53表達較低（圖6D）。此外，研究顯示心臟中近80%的Ad-TREM2（GFP+TREM2+）細胞是CD64+巨噬細胞（圖6E）。此外，Ad-TREM2小鼠中分離的心臟巨噬細胞中SLC25A53表達水平較低，NAD+含量降低（圖6F，G）。這些結果證實了TREM2過表達下調(diào)巨噬細胞中的SLC25A53，并改善心肌梗死后心臟的功能和結構。進一步研究了衣康酸對心肌梗死后心臟損傷的作用。結果表明，4-OI注射導致EF顯著恢復（圖6H）。Masson染色顯示4-OI給藥的小鼠壁厚增加（圖6I，J）。這些結果提示衣康酸衍生物對心肌梗死的潛在治療作用。.
圖6：體內(nèi)注射TREM2-過表達腺病毒后改善左心室重構
結論
本研究表明心肌梗死中巨噬細胞特異性表達TREM2，使用RNA-seq、蛋白質(zhì)和分子對接以及靶向代謝組學（LC-MS），發(fā)現(xiàn)表達TREM2的巨噬細胞在胞葬后通過SYK-SMAD4信號通路抑制SLC25A53轉錄，損害NAD+運輸?shù)骄€粒體功能，SLC25A53下調(diào)導致三羧酸循環(huán)中出現(xiàn)斷點，隨后增加衣康酸的產(chǎn)生。體外實驗證實，TREM2+巨噬細胞分泌的衣康酸抑制心肌細胞凋亡并促進成纖維細胞增殖。相反，在巨噬細胞中過度表達TREM2可以改善心臟功能。機制圖如下所示?？傊?，本研究為TREM2巨噬細胞在心肌梗死中的作用提供了新的見解，并揭示了潛在的機制，為增強損傷后心臟修復開辟了新的可能性。
實驗方法
小鼠心肌梗死模型及超聲心動圖，免疫熒光染色和激光共聚焦熒光顯微鏡分析，組織學，蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡檢測，定量聚合酶鏈反應PCR，流式細胞術，心臟內(nèi)注射腺病毒，骨髓來源巨噬細胞的生成，原代心肌細胞和成纖維細胞培養(yǎng)，從hiPSCs分化心肌細胞，原代心肌細胞動作電位的測定，外分泌體外試驗，衣康酸刺激，體內(nèi)和體外的胞葬實驗，NAD/NADH+檢測，粒體NAD+攝取測定，RNA測序，LC-MS分析
參考文獻
Gong Shiyu, Zhai Ming, Shi Jiayun, et al. TREM2 macrophage promotes cardiac repair in myocardial infarction by reprogramming metabolism via SLC25A53.[J] .Cell Death Differ, 2024, undefined: undefined.