ZNF689缺乏促進(jìn)三陰性乳腺癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和免疫治療耐藥

         三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性疾病，其特征是顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)，這給治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。然而，TNBC中ITH的臨床相關(guān)性和關(guān)鍵決定因素尚不清楚。在這里，作者使用多組學(xué)數(shù)據(jù)在作者中心的隊(duì)列(n=260)、癌癥基因組圖譜隊(duì)列(n=134)和四個(gè)免疫治療隊(duì)列(n=109)中全面表征ITH水平。作者的研究結(jié)果顯示，高ITH與患者生存差和免疫治療抵抗有關(guān)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白689 (ZNF689)缺乏是ITH形成的關(guān)鍵決定因素。ZNF689-TRIM28復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)直接結(jié)合到長(zhǎng)穿插元件-1 (LINE-1)的啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)H3K9ME3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默。ZNF689缺陷重新激活了LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位，加劇了基因組的不穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了ITH。單細(xì)胞RNA測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，ZNF689缺陷誘導(dǎo)的ITH抑制抗原呈遞和T細(xì)胞活化，賦予免疫治療抗性。藥物抑制LINE-1可顯著降低ITH，增強(qiáng)抗腫瘤免疫，最終使體內(nèi)缺乏ZNF689的腫瘤對(duì)免疫治療增敏。在臨床樣本中，ZNF689的表達(dá)與良好的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)?？傊髡叩难芯拷沂玖?span>ZNF689缺陷誘導(dǎo)ITH的機(jī)制，并建議LINE-1抑制聯(lián)合免疫治療作為TNBC的一種新的治療策略。該文章于2024年1月發(fā)表在《Cell research》，IF：44.1。

技術(shù)路線：

技術(shù)路線圖

主要研究結(jié)果：

1. 在TNBC中，高ITH降低了患者的生存率，并賦予了免疫治療耐藥性

         作者利用本中心隊(duì)列(FUSCC隊(duì)列，n = 260)和TCGA隊(duì)列(n = 134)的多組學(xué)數(shù)據(jù)，全面表征TNBC的ITH，包括全外顯子組測(cè)序(WES)結(jié)果、體細(xì)胞拷貝數(shù)變異(SCNV)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)、H&E圖像和臨床數(shù)據(jù)(圖1a)。為了推斷遺傳ITH，作者使用PyClone來(lái)估計(jì)每個(gè)腫瘤的亞克隆數(shù)量。為了研究ITH在TNBC中的臨床相關(guān)性，作者進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析。作者的研究結(jié)果表明，遺傳或組織學(xué)ITH的增加與FUSCC隊(duì)列中較低的總生存期(OS)、無(wú)復(fù)發(fā)生存期(RFS)和遠(yuǎn)端無(wú)轉(zhuǎn)移生存期(DMFS)相關(guān)(圖1b， c)。為了確定TNBC中ITH的下游通路，作者分析了FUSCC隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組差異?；蚣患治?span>(GSEA)結(jié)果顯示，高遺傳ITH與典型免疫特征(如IFN應(yīng)答和IL-6、JAK和STAT3途徑)呈反相關(guān)(圖1d)。此外，高ITH與CD8評(píng)分、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)評(píng)分和細(xì)胞溶解(CYT)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(圖1e)，表明高ITH可能導(dǎo)致免疫排斥腫瘤。以往的研究表明，ITH對(duì)免疫治療的療效有重大影響。因此，作者在四項(xiàng)基于抗pd -1的TNBC臨床試驗(yàn)(n = 109)中探討了ITH(通過(guò)H&E切片衍生的組織學(xué)ITH進(jìn)行評(píng)估)對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響(圖1f)。新輔助試驗(yàn)NCT04613674和NCT04418154分別包括29例和16例患者的H&E圖像，分析結(jié)果顯示，高ITH腫瘤的病理完全緩解(pCR)率顯著降低(圖1g， h)。在第三個(gè)隊(duì)列(NCT03805399)中，作者檢查了29例患者的H&E圖像，觀察到高ITH腫瘤的ORR較低(圖1i)。在最后一個(gè)隊(duì)列(NCT04129996)中，作者評(píng)估了35例患者的H&E圖像，發(fā)現(xiàn)高ITH腫瘤患者的ORR較低，無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和OS較短(圖1j)?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的研究結(jié)果表明，高ITH降低了TNBC患者的生存率，并賦予了免疫治療耐藥性。

圖1 高ITH降低了TNBC患者的生存率，并導(dǎo)致免疫治療抵抗

2. 缺乏ZNF689可促進(jìn)TNBC的ITH

         為了探索TNBC中ITH的關(guān)鍵決定因素，作者使用隊(duì)列數(shù)據(jù)分析了拷貝數(shù)改變、體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)錄組。由于高遺傳ITH或組織學(xué)ITH腫瘤表現(xiàn)出與低ITH腫瘤相似的SCNVs和突變景觀，作者專(zhuān)注于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。分別在遺傳水平和組織學(xué)水平上獲得高ITH組和低ITH組的差異表達(dá)基因后，作者發(fā)現(xiàn)共有6個(gè)差異表達(dá)基因(MUC19、PGC、DHRS2、ZNF689、TDRD12和C20orf114)(圖2a)。接下來(lái)，作者設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了誘導(dǎo)TNBC ITH的最關(guān)鍵基因(圖2b)。LM2球體的h&e染色圖像顯示，使用短發(fā)夾RNA (shRNAs)敲除ZNF689顯著增加組織學(xué)ITH(圖2c， d)。具體來(lái)說(shuō)，與低ITH組相比，高遺傳和組織學(xué)ITH組ZNF689的平均表達(dá)分別降低了3倍和2.6倍。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明ZNF689可能是TNBC中ITH調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，需要更深入的實(shí)驗(yàn)探索。

         為了研究ZNF689是否能在體內(nèi)影響TNBC ITH，作者設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，使用免疫缺陷和免疫正常的小鼠(圖2e)。(1)作者選擇了一個(gè)TNBC患者來(lái)源的異種移植(PDX)標(biāo)本，該標(biāo)本具有低遺傳ITH(由兩個(gè)亞克隆證明)和低組織學(xué)ITH，同時(shí)ZNF689表達(dá)升高。在該PDX模型建立后，作者進(jìn)行了針對(duì)ZNF689的siRNA瘤內(nèi)注射。值得注意的是，ZNF689的缺失顯著增加了遺傳ITH和組織學(xué)ITH水平(圖2f)。用siZNF689處理的PDX腫瘤也顯示出比對(duì)照組更快的生長(zhǎng)速度。(2)將穩(wěn)定表達(dá)shNC和shZNF689的LM2細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊(mfp)中。作者發(fā)現(xiàn)ZNF689敲低顯著增加免疫缺陷小鼠異種移植物的遺傳和組織學(xué)ITH水平(圖2g)。(3)將穩(wěn)定表達(dá)載體和ZNF689的LM2細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的mfp中。作者觀察到ZNF689過(guò)表達(dá)限制了LM2腫瘤異種移植物的遺傳ITH和組織學(xué)ITH(圖2h)。 (4)將過(guò)表達(dá)ZNF689或ZNF689的4T1細(xì)胞皮下注射到BALB/c小鼠的mfp中。作者發(fā)現(xiàn)ZNF689缺失導(dǎo)致4T1同基因移植物的組織學(xué)ITH顯著升高(圖2i)。相比之下，ZNF689過(guò)表達(dá)導(dǎo)致組織學(xué)ITH程度較低(圖2j)。綜上所述，這些結(jié)果表明，ZNF689缺乏在體內(nèi)和體外都能促進(jìn)TNBC中的ITH。

圖2 ZNF689缺失促進(jìn)TNBC中ITH

3. ZNF689通過(guò)TRIM28復(fù)合體抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄

         為了分析ZNF689缺乏如何促進(jìn)TNBC中ITH的潛在機(jī)制，作者應(yīng)用基于細(xì)胞培養(yǎng)(SILAC)的氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)篩選ZNF689相互作用蛋白。作者選擇了排名最高的蛋白TRIM28進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)合驗(yàn)證。TRIM28是kr<s:1> pel-associated box domain zinc finger protein (KRAB-ZFP)轉(zhuǎn)錄因子的通用輔因子。內(nèi)源性ZNF689和TRIM28的共免疫沉淀(co-IP)實(shí)驗(yàn)以及western blotting表明，這兩種蛋白可以在LM2、Hs578T和HEK293T細(xì)胞中以?xún)?nèi)源性水平相互作用(圖3a)。利用重組ZNF689和TRIM28蛋白進(jìn)行的體外下拉實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，這種相互作用可能是直接的(圖3b)。

圖3 ZNF689通過(guò)TRIM28復(fù)合體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位

         KRAB-ZNFs的主要作用是通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TRIM28和組蛋白H3 Lys9三甲基化(H3K9me3)依賴(lài)性異染色質(zhì)形成和DNA甲基化的相關(guān)介質(zhì)來(lái)沉默重復(fù)元件(REs)。由于REs是遺傳變異和基因組進(jìn)化的主要參與者，作者推測(cè)ZNF689可能通過(guò)調(diào)控REs抑制TNBC ITH。為了研究是否有任何已知的REs受到ZNF689缺失的調(diào)控，作者對(duì)siNC-和siZNF689處理的LM2細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。使用RepEnrich軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，量化RE表達(dá)。GSEA還顯示，在siZNF689處理的細(xì)胞中，人LINE-1基因標(biāo)記顯著上調(diào)(圖3c)。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)和western blotting來(lái)定量LINE-1。作者觀察到，ZNF689缺陷顯著上調(diào)了人(LM2和Hs578T)和鼠(4T1和AT3) TNBC細(xì)胞系中LINE-1 mRNA及其編碼蛋白ORF1p和ORF2p(圖3d)。為了檢查在沒(méi)有ZNF689的情況下LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位活性是否會(huì)增加，作者使用工程的LINE-1報(bào)告系統(tǒng)對(duì)ZNF689敲除細(xì)胞(MDA-MB-231和Hs578T)進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位分析(圖3f)。值得注意的是，在敲除ZNF689的細(xì)胞中，LINE-1的反轉(zhuǎn)錄頻率高于對(duì)照細(xì)胞(圖3g)。作者還通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)到在ZNF689敲除的人和鼠TNBC細(xì)胞系中LINE-1的基因組DNA含量升高(圖3h)。LINE-1的轉(zhuǎn)錄是由LINE-1 5 '-非翻譯區(qū)(UTR)的內(nèi)部啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的為了驗(yàn)證ZNF689是否直接調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄，作者將人LINE-1的5′-UTR克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中。ZNF689過(guò)表達(dá)強(qiáng)烈抑制Hs578T和HEK293T細(xì)胞的熒光素酶活性(圖3i)。使用測(cè)序(ATAC-seq)對(duì)轉(zhuǎn)座酶可接近的染色質(zhì)進(jìn)行分析，支持了ZNF689缺陷導(dǎo)致全長(zhǎng)LINE-1啟動(dòng)子的抑制和染色質(zhì)可接近性增加的觀點(diǎn)(圖3j)。

         TRIM28作為沉默復(fù)合體的支架，沉默復(fù)合體包括組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1、核小體重塑和去乙?；?span>(NuRD)復(fù)合體、異染色質(zhì)蛋白1 (HP1)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)聯(lián)合ip分析，作者鑒定出SETDB1、DNMT3B、HP1α、HP1γ和SUV39H1是額外的ZNF689相互作用蛋白。LINE-1的啟動(dòng)子選擇性富集于組蛋白變體H3.3和組蛋白標(biāo)記H3K9me3中，這對(duì)維持LINE-1.30的抑制狀態(tài)至關(guān)重要。因此，作者假設(shè)ZNF689可能將這些酶招募到LINE-1啟動(dòng)子中，以增強(qiáng)H3K9me3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默。ChIP-seq分析顯示，ZNF689基因敲低后，全長(zhǎng)LINE-1啟動(dòng)子上的H3K9me3修飾減少(圖3k)。隨后的分析顯示，在缺乏ZNF689的情況下，TRIM28在該位點(diǎn)的募集減弱(圖31)。這些數(shù)據(jù)支持ZNF689和TRIM28協(xié)同結(jié)合介導(dǎo)LINE-1啟動(dòng)子上的H3K9me3修飾(圖3m)。綜上所述，這些結(jié)果表明ZNF689通過(guò)TRIM28復(fù)合體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位(圖3n)。

4. ZNF689缺陷誘導(dǎo)的LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位加劇了基因組不穩(wěn)定性并促進(jìn)ITH

圖4 ZNF689缺陷誘導(dǎo)的LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位加劇了基因組不穩(wěn)定性并促進(jìn)ITH

         LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位是基因組不穩(wěn)定性的主要來(lái)源，表現(xiàn)為雙鏈DNA斷裂增加和染色體不穩(wěn)定性(CIN)。因此，作者假設(shè)ZNF689缺陷可能通過(guò)抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位來(lái)促進(jìn)ITH，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加。首先，作者檢測(cè)了磷酸化組蛋白H2AX (γH2AX)，這是一種用于評(píng)估基因組不穩(wěn)定性的DNA雙鏈斷裂標(biāo)記IF檢測(cè)(圖4a)顯示，ZNF689敲低可增強(qiáng)γ - h2ax水平，這與ZNF689敲低原位LM2腫瘤的結(jié)果一致(圖4b)。接下來(lái)，作者探討了ZNF689缺乏在CIN中的潛在作用。中期染色體擴(kuò)散試驗(yàn)顯示，ZNF689敲低細(xì)胞中染色體畸變明顯增加(圖4c)。H&E切片的組織學(xué)檢查也證實(shí)了ZNF689缺陷與后期染色體錯(cuò)分離增加之間的顯著相關(guān)性(圖4d)。這些結(jié)果表明，ZNF689缺陷導(dǎo)致TNBC基因組不穩(wěn)定性增加。

         逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑如EFV可以有效阻斷內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性，被認(rèn)為是LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位的潛在特異性抑制劑。作者觀察到EFV有效地減輕了ZNF689敲低誘導(dǎo)的LINE-1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位和基因組DNA含量改變(圖4e)。隨后的IF測(cè)試(圖4f)顯示，EFV處理減弱了ZNF689敲低誘導(dǎo)的γ - h2ax上調(diào)。EFV還減少了ZNF689缺失細(xì)胞的染色體畸變(圖4g)。這些結(jié)果表明，ZNF689缺陷通過(guò)LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位加劇了基因組的不穩(wěn)定性。接下來(lái)，作者在體內(nèi)研究了ZNF689缺陷誘導(dǎo)的ITH是否可以通過(guò)抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位來(lái)逆轉(zhuǎn)。作者用shNC或shZNF689 LM2細(xì)胞構(gòu)建MFP異種移植模型。1周后，NOD/SCID小鼠隨機(jī)分組，每天給藥(Veh)對(duì)照或腹腔注射EFV (圖4h)。值得注意的是，EFV顯著降低了ZNF689缺失腫瘤的遺傳ITH(圖4i)和組織學(xué)ITH(圖4j)，這表明ZNF689缺失的ITH促進(jìn)作用依賴(lài)于LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位。原位腫瘤免疫組化(IHC)分析顯示，EFV可有效降低ZNF689缺陷腫瘤中γ - h2ax陽(yáng)性區(qū)域(圖4k)。此外，EFV顯著下調(diào)了ZNF689缺陷腫瘤中LINE-1的DNA含量(圖41)?？傊Y(jié)果支持ZNF689缺陷通過(guò)抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位加劇基因組不穩(wěn)定性以促進(jìn)ITH(圖4m)。

5.ZNF689缺陷誘導(dǎo)的高ITH損害抗原呈遞和T細(xì)胞活化

         作者發(fā)現(xiàn)，高ITH賦予TNBC免疫治療耐藥性(圖1f-j)。為了直接評(píng)估ITH誘導(dǎo)下的腫瘤微環(huán)境重塑，作者進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)來(lái)表征shZNF689或shNC 4T1同基因移植物收獲的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化(圖5a)。最后，作者從shZNF689組收集了10，913個(gè)細(xì)胞，從shNC組收集了14，788個(gè)細(xì)胞。整合所有獲得的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)后，統(tǒng)一流形近似和投影(UMAP)可視化顯示了六種細(xì)胞類(lèi)型，包括癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和內(nèi)皮細(xì)胞。值得注意的是，T細(xì)胞在ZNF689缺陷腫瘤細(xì)胞中的比例下降(補(bǔ)充信息，圖S8d)。為了準(zhǔn)確地定義T細(xì)胞，作者將T細(xì)胞分為7個(gè)亞型:活化的CD8+ T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Tcf7+ T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞(Teff)、增殖T細(xì)胞(Tpro)、Isg+ T細(xì)胞和CD4+ na?ve T細(xì)胞(圖5b)。ZNF689缺陷組活化的CD8+ T細(xì)胞、Teff、Tpro和Isg+ T細(xì)胞減少，而Tregs、Tcf7+ T細(xì)胞和CD4+ na?ve T細(xì)胞增加(圖5c)。這一發(fā)現(xiàn)也通過(guò)BALB/c小鼠4T1腫瘤免疫細(xì)胞譜的流式細(xì)胞分析得到了驗(yàn)證，其中ZNF689敲除降低了腫瘤CD4+ T細(xì)胞浸潤(rùn)、CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)以及顆粒酶B+ (GZMB+)和IFN-γ+ CD8+ T細(xì)胞的百分比(圖5d)。同樣，scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，ZNF689缺陷腫瘤中的T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物(Ifng、Nkg7、Prf1和Gzmb)水平降低，但抑制性T細(xì)胞標(biāo)志物(Ctla4和Btla)和Treg標(biāo)志物(Foxp3、II2ra和Ikzf3)水平升高(圖5e)。

圖5 ZNF689缺陷誘導(dǎo)的ITH損害抗原呈遞和T細(xì)胞活化

         接下來(lái)，作者研究了ZNF689缺陷誘導(dǎo)的ITH調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的詳細(xì)機(jī)制。來(lái)自scRNA-seq的T細(xì)胞和癌細(xì)胞通路分析顯示，在ZNF689缺陷組中，IFN反應(yīng)和抗原加工和遞呈(APP)下調(diào)(圖5f， g)。Bulk RNA-seq證實(shí)，在siZNF689處理的LM2細(xì)胞和高ITH腫瘤中，APP通路明顯缺失(圖5h)。為了揭示ZNF689缺陷是否影響單細(xì)胞的空間分布和基因表達(dá)，作者對(duì)BALB/c小鼠的4T1腫瘤進(jìn)行了空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。與之前的研究結(jié)果一致，ZNF689缺陷腫瘤在CIN評(píng)分中顯示出明顯且強(qiáng)烈的活性(圖5i)。如圖5j所示，在ZNF689缺陷點(diǎn)的腫瘤中，T細(xì)胞(包括CD4+和CD8+ T細(xì)胞)的特征評(píng)分、T細(xì)胞活化以及通過(guò)MHC-I進(jìn)行的APP均較低且具有異質(zhì)性。這些特征主要在ZNF689缺陷腫瘤的瘤周區(qū)域觀察到，表明免疫排斥的微環(huán)境更多。此外，原位LM2腫瘤中HLA-ABC、B2M、TAP1和PSMB9的免疫組化分析表明，ZNF689敲除后，MHC-I app相關(guān)標(biāo)志物的下調(diào)主要是由于染色細(xì)胞百分比的降低，而不是染色強(qiáng)度的降低(圖5k)，表明ITH也誘導(dǎo)了MHC-I app相關(guān)蛋白表達(dá)的空間異質(zhì)性。然而，使用LINE-1抑制劑EFV治療顯著消除了原位LM2腫瘤中ZNF689敲低導(dǎo)致的MHC-I app相關(guān)蛋白表達(dá)空間異質(zhì)性的增加(圖5k)。

         為了進(jìn)一步闡明ZNF689調(diào)控MHC-I app相關(guān)基因的具體機(jī)制，作者對(duì)Flag-ZNF689 ChIP-seq數(shù)據(jù)的分析顯示，ZNF689并不直接結(jié)合這些關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子。這與假設(shè)一致，即這種抑制與缺乏ZNF689時(shí)LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位升高有關(guān)。為了評(píng)估ZNF689缺陷是否會(huì)由于MHC-I表達(dá)受損而限制CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，作者將小鼠卵白蛋白(OVA)特異性CD8+ T細(xì)胞(OT-I)與表達(dá)OVA的shNC和shZNF689 AT3腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)(圖51)。腫瘤細(xì)胞中ZNF689的缺乏導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和CD8+ T細(xì)胞活化的降低，如GZMB、IFN-γ和CD137的表達(dá)降低(圖5m)。這些數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于與shNC細(xì)胞相比，shZNF689 AT3腫瘤細(xì)胞中SIINFEKL (OVA肽)-H-2Kb復(fù)合物的表達(dá)減少(圖5m)。然而，當(dāng)用LINE-1抑制劑EFV處理腫瘤-免疫細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞和T細(xì)胞活化得到了恢復(fù)(圖5m)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，ZNF689缺陷誘導(dǎo)的ITH減少了抗原呈遞，抑制了T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，從而促進(jìn)了TNBC的免疫逃逸和免疫治療抵抗。

6. LINE-1抑制使ZNF689缺陷誘導(dǎo)的高ITH腫瘤對(duì)免疫治療增敏

圖6 LINE-1抑制使ZNF689缺陷誘導(dǎo)的TNBC高ITH腫瘤對(duì)免疫治療增敏

         鑒于LINE-1抑制在調(diào)節(jié)ITH和抗原提呈中的重要性，作者進(jìn)一步探索LINE-1抑制劑EFV是否可以逆轉(zhuǎn)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。然后將4T1細(xì)胞植入BALB/c小鼠的mfp中。在ZNF689缺乏組中，EFV顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖6a)并延長(zhǎng)存活時(shí)間(圖6b)，而不影響小鼠體重或食物消耗。EFV可有效降低ZNF689缺陷腫瘤的組織學(xué)ITH(圖6c)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)EFV處理的ZNF689缺陷腫瘤比Veh對(duì)照組有更多的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、GZMB+和IFN-γ+ CD8+ T細(xì)胞(圖6d)。這些觀察結(jié)果表明，結(jié)合LINE-1抑制和免疫治療具有潛在的協(xié)同抗腫瘤作用。因此，作者在BALB/c小鼠中原位MFP移植了ZNF689敲低的4T1細(xì)胞，以研究靶向LINE-1是否能使高ITH腫瘤對(duì)抗pd-1治療增敏。雖然shNC組和shZNF689組之間的抗pd-1反應(yīng)變化很，但與對(duì)照組相比，通過(guò)腫瘤體積評(píng)估，聯(lián)合治療在shZNF689組中顯示出協(xié)同抗腫瘤作用(圖6e)。此外，EFV聯(lián)合抗pd -1治療可顯著延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間(圖6f)。原位4T1腫瘤顯示，聯(lián)合治療可顯著降低ZNF689缺陷腫瘤的組織學(xué)ITH(圖6g)。此外，作者檢測(cè)了聯(lián)合治療小鼠的微環(huán)境重塑；相關(guān)變化包括H2d MHC-I同種異體抗原水平(圖6h)、CD4+ T細(xì)和CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)以及GZMB+和IFN-γ+ CD8+ T細(xì)胞的百分比(圖6i)的顯著增加。

         為了排除細(xì)胞系或小鼠株特異性效應(yīng)，作者將AT3細(xì)胞原位注射到C57BL/6小鼠的mfp中，建立了AT3乳腺癌模型。作者再次觀察到，在使用LINE-1抑制劑EFV聯(lián)合抗pd-1治療的ZNF689缺陷組中，腫瘤生長(zhǎng)延遲(圖6j)，生存時(shí)間延長(zhǎng)(圖6k)。此外，聯(lián)合治療顯著降低了ZNF689缺陷腫瘤的組織學(xué)ITH，增強(qiáng)了抗原呈遞，并協(xié)調(diào)了CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活。這些數(shù)據(jù)表明，藥物抑制LINE-1結(jié)合免疫治療，通過(guò)阻斷ITH和增強(qiáng)抗原呈遞，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞的募集和激活，從而誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫。

7. 在TNBC中，ZNF689的表達(dá)與良好的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)

         為了進(jìn)一步驗(yàn)證作者在人類(lèi)TNBC樣本中的臨床前發(fā)現(xiàn)，作者通過(guò)組織微陣列(n = 283)的免疫組化分析，研究了ZNF689、LINE-1和CD8在TNBC患者隊(duì)列中的表達(dá)水平。與作者的發(fā)現(xiàn)一致，免疫組化結(jié)果顯示，在TNBC組織中，ZNF689的表達(dá)與LINE-1 ORF1p水平呈負(fù)相關(guān)，但與CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)(圖7a)。此外，作者的分析顯示，基于H&E染色，ZNF689的表達(dá)與組織學(xué)ITH水平呈負(fù)相關(guān)(圖7a)，這表明ZNF689是TNBC中與ITH相關(guān)的負(fù)相關(guān)因素。對(duì)于生存分析，作者觀察到低ZNF689水平在TNBC患者中的預(yù)后明顯差于相應(yīng)的高ZNF689表達(dá)，這可以通過(guò)更短的OS、RFS和DMFS來(lái)證明(圖7b)。來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Kaplan-Meier Plotter)的結(jié)果也顯示，低ZNF689表達(dá)與基底樣乳腺癌患者預(yù)后差相關(guān)。

圖7 在TNBC中，ZNF689的表達(dá)與良好的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)

         此外，作者通過(guò)多色IF進(jìn)一步評(píng)估了ZNF689、LINE-1、HLA-ABC和CD8在4個(gè)接受抗pd -1治療的TNBC試驗(yàn)中腫瘤的蛋白表達(dá)水平(n = 100)。IF染色結(jié)果顯示，在抗pd -1治療應(yīng)答者中，ZNF689與HLA-ABC和CD8表達(dá)呈正相關(guān)，而ZNF689與LINE-1 ORF1p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7c)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤中ZNF689的高表達(dá)與免疫治療的陽(yáng)性反應(yīng)相關(guān)(圖7d)。這些結(jié)果與作者的體外和體內(nèi)研究一致。為了評(píng)估這些觀察結(jié)果是否也適用于其他類(lèi)型的癌癥，作者檢查了接受抗pd -1治療的黑色素瘤數(shù)據(jù)集(GSE91061)和尿路上皮癌數(shù)據(jù)集(GSE176307)，觀察到應(yīng)答者中ZNF689水平較高(圖7e)。與ZNF689損失的影響類(lèi)似?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，ZNF689的表達(dá)與TNBC患者的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)。

         總之，作者的研究闡明了潛在的機(jī)制，并揭示了一種靶向LINE-1的治療策略，通過(guò)與免疫療法的協(xié)同作用，可以使高ITH腫瘤被根除，為聯(lián)合使用LINE-1抑制劑和免疫療法進(jìn)行TNBC精確治療提供了基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         遺傳ITH的定量， 組織學(xué)ITH定量， 質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和慢病毒shRNA載體， DNA和RNA分析， Western blotting和co-IP， IF和多重IF，三維腫瘤球分析及組織學(xué)分析，小鼠腫瘤的WES，流式細(xì)胞術(shù)，SILAC標(biāo)記和質(zhì)譜，RNA測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位報(bào)告試驗(yàn)，ChIP和ChIP-seq，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)，scRNA-seq

參考文獻(xiàn)：

         Ge LP, Jin X, Ma D, Wang ZY, Liu CL, Zhou CZ, Zhao S, Yu TJ, Liu XY, Di GH, Shao ZM, Jiang YZ. ZNF689 deficiency promotes intratumor heterogeneity and immunotherapy resistance in triple-negative breast cancer. Cell Res. 2024 Jan;34(1):58-75. doi: 10.1038/s41422-023-00909-w. Epub 2024 Jan 2. PMID: 38168642; PMCID: PMC10770380.