由于WT1在小鼠顆粒細(xì)胞中積累，EPG5缺乏導(dǎo)致原發(fā)性卵巢功能不全

        原發(fā)性卵巢功能不全(POI)，也稱為卵巢早衰，是人類的一種卵巢缺陷，其特征是40歲之前卵巢卵泡過早耗竭。然而，POI背后的機(jī)制在很大程度上仍然未知。在這里，作者表明敲除EPG5(異位P顆粒自噬蛋白5同源物)導(dǎo)致雌性小鼠的生育能力低下，雌性小鼠表現(xiàn)出POI樣表型。單細(xì)胞RNA測序分析顯示，敲除EPG5影響顆粒細(xì)胞(GCs)的分化。進(jìn)一步的研究表明，敲除EPG5阻斷巨自噬/自噬通量，導(dǎo)致WT1(WT1轉(zhuǎn)錄因子)的積累，WT1是GC的必需轉(zhuǎn)錄因子，表明WT1需要通過自噬途徑選擇性降解。作者發(fā)現(xiàn)，WT1在竇卵泡期的降解不足導(dǎo)致類固醇生成相關(guān)基因的表達(dá)減少，從而破壞GC分化。綜上所述，作者的研究表明，EPG5促進(jìn)GC中WT1的降解，表明GC中EPG5的失調(diào)可以觸發(fā)POI發(fā)病機(jī)制。該研究于2022年7月發(fā)表于《Autophagy》上，題為“Epg5 deficiency leads to primary ovarian insufficiency due to WT1 accumulation in mouse granulosa cells”，影響因子13.3。

技術(shù)路線

研究思路

1.  敲除EPG5可導(dǎo)致小鼠卵巢早衰導(dǎo)致生育能力低下

        與許多其他自噬相關(guān)基因不同，最近發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因EPG5的敲除不會(huì)導(dǎo)致小鼠的嬰兒死亡，因此可以研究其在生育中的作用。作者初步檢測了EPG5在小鼠各種組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它在卵巢中顯著表。蛋白水平上，經(jīng)WB證實(shí)EPG5在GCs中高表達(dá)。卵巢免疫組織化學(xué)染色顯示，在原始、原發(fā)、繼發(fā)和竇卵泡的GCs中，EPG5信號(hào)強(qiáng)烈。這些結(jié)果提示EPG5可能參與了GC的某些功能。

        為了進(jìn)一步研究EPG5在生殖中的潛在功能，作者對(duì)EPG5基因敲除小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。首先通過卵巢樣本的免疫印跡證實(shí)了基因敲除效率(圖1a)。8周齡EPG5基因敲除小鼠的卵巢形態(tài)檢查顯示，與對(duì)照組小鼠相比，卵巢大小明顯減小(圖1b)。此外，作者發(fā)現(xiàn)EPG5基因敲除小鼠的卵巢重量：體重比也顯著降低(圖1c)。為了研究EPG5基因敲除對(duì)雌性生殖能力的影響，研究人員進(jìn)行了一項(xiàng)育種試驗(yàn)，將對(duì)照組或敲除EPG5的雌性小鼠與具有生育能力的雄性小鼠交配6個(gè)月。與對(duì)照組相比，EPG5基因敲除雌性小鼠的生育能力降低(圖1d)。EPG5基因敲除組每窩幼崽數(shù)量少于WT對(duì)照組；EPG5基因敲除小鼠的平均產(chǎn)仔數(shù)為2.1±0.59，而WT為7.6±1.41(圖1e)。最后，作者使用蘇木精和伊紅(H&E)染色對(duì)16周齡小鼠卵巢橫切面進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，敲除EPG5的卵巢有異常的卵泡發(fā)育(圖1f，g)。

圖1  敲除EPG5的雌性小鼠不育

        為了研究EPG5的缺失如何阻礙生育，作者比較了不同年齡的卵巢形態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)EPG5基因敲除和3周大的對(duì)照卵巢沒有明顯的形態(tài)學(xué)差異:兩種基因型的卵巢都有相似數(shù)量的不同分期的卵泡，包括被扁平的顆粒前細(xì)胞包圍的小卵母細(xì)胞，以及含有增大卵母細(xì)胞的激活卵泡。然而，當(dāng)作者檢測6周大的小鼠時(shí)，有明顯的差異，在EPG5基因敲除的卵巢中，原始卵泡、初級(jí)卵泡和竇卵泡的數(shù)量顯著減少。這些結(jié)果共同表明，EPG5基因缺失導(dǎo)致雌性卵巢卵泡發(fā)育功能障礙和生育能力低下。

2.  敲除EPG5對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育能力無影響

        在哺乳動(dòng)物中，雌性的生殖能力是通過卵母細(xì)胞和卵泡的調(diào)節(jié)發(fā)育來維持的。鑒于作者已經(jīng)在EPG5基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)了與年齡相關(guān)的低生育能力和卵巢形態(tài)異常，作者探討了卵母細(xì)胞功能障礙是否有助于解釋作者的觀察結(jié)果。與對(duì)照組小鼠相比，EPG5基因敲除小鼠的MII卵母細(xì)胞數(shù)量減少(圖2a)；然而，EPG5基因敲除組和對(duì)照組的極體-1(PB1)擠壓程度沒有差異(圖2b)。

        為了評(píng)估EPG5缺失的卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，作者在體外培養(yǎng)了3周齡EPG5敲除小鼠和對(duì)照組的生發(fā)囊泡(GV)卵母細(xì)胞。與體內(nèi)成熟結(jié)果相似，敲除EPG5的卵母細(xì)胞的MII率與對(duì)照卵母細(xì)胞沒有差異(圖2c，d)。免疫熒光和共聚焦顯微鏡也顯示，敲除EPG5的卵母細(xì)胞能夠成功擠出PB1(圖2e)，并且敲除EPG5的卵母細(xì)胞與對(duì)照卵母細(xì)胞的異常MII比例沒有變化(圖2f)。為了進(jìn)一步研究EPG5基因敲除小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，按照先前的描述進(jìn)行了體外受精。作者發(fā)現(xiàn)，在EPG5基因敲除小鼠和對(duì)照組之間，雙細(xì)胞胚胎和囊胚的形成率沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，EPG5基因敲除小鼠的低生育能力是由于卵泡發(fā)育和排卵缺陷造成的，而不是由于卵母細(xì)胞發(fā)育改變。

圖2 來自EPG5基因敲除小鼠的卵母細(xì)胞能夠完成減數(shù)分裂成熟。

3.  敲除EPG5可導(dǎo)致GCs老化和細(xì)胞死亡

        GCs為卵母細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)和類固醇，在卵泡發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。作者評(píng)估了GC功能失調(diào)是否可能是EPG5基因敲除小鼠poi樣表型的基礎(chǔ)。衰老相關(guān)GLB1/β-半乳糖苷酶(SAGLB1/β-gal)檢測顯示，與對(duì)照組相比，EPG5基因敲除的GCs中SAGLB1/β-gal活性顯著增加(圖3a，b)。作者還分別采用增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(dUTP)缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色法檢測了發(fā)育卵泡GCs的增殖率和細(xì)胞死亡率。6周齡EPG5基因敲除組卵巢中tunel陽性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(圖3c-g)，EPG5基因敲除組卵巢細(xì)胞增殖明顯降低(圖3d-h)。同時(shí)，細(xì)胞死亡標(biāo)志物cleavedCASP3(caspase3)的免疫染色信號(hào)在繼發(fā)性和竇性卵泡的GCs中非常強(qiáng)(圖3e-i)。此外，考慮到已知GCs在細(xì)胞死亡的后期階段表現(xiàn)出核變化(包括DNA斷裂)，作者想知道EPG5的丟失是否會(huì)導(dǎo)致GCs中的DNA損傷。在EPG5基因敲除的GCs中，γ-H2AX水平顯著升高，表明DNA雙鏈斷裂積累(圖3f-j)。這些結(jié)果表明，EPG5的缺失減少了GC的增殖并誘導(dǎo)GC死亡，表明GC功能失調(diào)(即甾體生成)可能驅(qū)動(dòng)了EPG5基因敲除卵巢中觀察到的卵泡發(fā)育缺陷。

圖3 敲除EPG5可導(dǎo)致GCs老化和細(xì)胞死亡

4. 在EPG5敲除的GCs中，自噬通量被阻斷

        EPG5通過與RAB7的直接相互作用以及與晚期內(nèi)體/溶酶體上的VAMP7(囊泡相關(guān)膜蛋白7)-VAMP8復(fù)合物結(jié)合而被招募到自噬體中[41]。接下來，作者研究了EPG5是否對(duì)小鼠卵巢的基礎(chǔ)自噬活性至關(guān)重要。與EPG5敲除小鼠腦和肌肉細(xì)胞一致，6周齡卵巢免疫印跡顯示，與對(duì)照組相比，EPG5敲除卵巢中自噬標(biāo)志物MAP1LC3/LC3-II和SQSTM1/p62水平顯著升高，表明自噬通量被阻斷(圖4a-c)。與免疫印跡結(jié)果一致，抗lc3b抗體免疫染色顯示，在6周齡EPG5基因敲除卵巢的所有卵泡期，lc3陽性GCs的數(shù)量均顯著增加(圖4d)。作者還在EPG5基因敲除的中央卵泡GCs中檢測到明顯的SQSTM1點(diǎn)信號(hào)積累，這在對(duì)照組中并不明顯(圖4e)。作者進(jìn)一步研究了EPG5基因敲除卵巢的自噬通量受損是否導(dǎo)致了EPG5基因敲除GCs中LC3點(diǎn)數(shù)量的增加。6周齡卵巢分離GCs的免疫印跡顯示，與對(duì)照組相比，EPG5敲除GCs中LC3和SQSTM1水平顯著升高(圖4f-h)。為了進(jìn)一步研究EPG5敲除對(duì)自噬通量的影響，作者通過延時(shí)顯微鏡監(jiān)測了EPG5敲除的GC的自噬通量。作者發(fā)現(xiàn)自噬體在對(duì)照GCs中以LC3點(diǎn)的形式與溶酶體融合(圖4i，k，1)，而LC3點(diǎn)在EPG5敲除的GCs中顯著積累，盡管離溶酶體很近(圖4i，k，1，j)。這些結(jié)果證實(shí)，在EPG5基因敲除的GCs中，自噬通量被阻斷。

圖4 EPG5基因敲除小鼠卵巢中自噬制造因子LC3-II和SQSTM1聚集物的積累

5.  單細(xì)胞RNA測序分析顯示EPG5敲除GCs分化異常

        為了研究EPG5在卵泡發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制，作者對(duì)6周齡EPG5基因敲除小鼠和對(duì)照組小鼠全卵巢的游離細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)分析(圖5a)。質(zhì)量控制后，作者在對(duì)照組和EPG5敲除小鼠卵巢體細(xì)胞中分別獲得6328和4950個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。使用統(tǒng)一歧形近似和投影(UMAP)對(duì)10×基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)了7種主要的細(xì)胞類型，作者計(jì)算了每種細(xì)胞類型中排名前30位的差異表達(dá)基因(deg)，過濾了平均loge變化>0.5的基因，按調(diào)整后的p值進(jìn)行排序(Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。為了可視化，作者為每個(gè)集群繪制了一個(gè)代表性的DEG。

圖5 單細(xì)胞RNA-seq分析揭示了EPG5敲除GCs的功能改變

        接下來，作者根據(jù)每簇50個(gè)最易表達(dá)的基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行聚類，并能夠區(qū)分五種主要的細(xì)胞類型:GC(四簇)、膜和基質(zhì)細(xì)胞(六簇)、平滑肌細(xì)胞(一簇)、內(nèi)皮細(xì)胞(一簇)、免疫細(xì)胞(三簇)和黃體細(xì)胞(一簇)。為了確認(rèn)UMAP中這些細(xì)胞類型的身份，作者根據(jù)預(yù)期標(biāo)記基因的表達(dá)水平對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了染色:Amh，Hsd3b1，Fshr，Wt1用于GCs；Pdgfrb，Lum為基質(zhì)細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞的Tagln和Rgs5；內(nèi)皮細(xì)胞的Pecam1和Cdh5；Cd68和Ptprc用于免疫細(xì)胞；以及黃體細(xì)胞的Epdr1和Avpl1。

        鑒于之前的結(jié)果，作者選擇GCs進(jìn)行進(jìn)一步分析，以進(jìn)一步闡明EPG5丟失對(duì)卵巢細(xì)胞反應(yīng)的影響。兩種基因型中GCs占總細(xì)胞百分比的相對(duì)比例顯示，EPG5敲除小鼠卵巢中GCs的比例從對(duì)照組的44.68%下降到33.07%。EPG5敲除小鼠的GCs中有25個(gè)差異表達(dá)基因(1個(gè)上調(diào)基因，24個(gè)下調(diào)基因)，包括編碼性激素生物合成酶的Cyp11a1和Cyp19a1(圖5b)。基因本體(GO)分析顯示，下調(diào)基因富集了“轉(zhuǎn)錄正調(diào)控”、“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合細(xì)胞”、“激素刺激應(yīng)答”、“雌激素信號(hào)通路”、“凋亡過程正調(diào)控”、“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工”等功能注釋(圖5c)。為了確定GC中的主調(diào)控因子，作者通過單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類(SCENIC)分析，構(gòu)建了包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。將GCs集群中的deg輸入到SCENIC以建立監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)。作者確定了包含868個(gè)基因的20個(gè)重要調(diào)控(圖5d和表S3)。值得注意的是，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控顯示高表達(dá)的調(diào)控包括Bclaf1、Atf4、Fos、Wt1、Jun和Foxo1調(diào)控，這些調(diào)控在維持GCs分化和卵泡閉鎖過程中都是明確的調(diào)控因子。而WB結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BCLAF1、ATF4、FOS、JUN/c-JUN和FOXO1的蛋白水平?jīng)]有變化(圖5e、f、g、h、j、k)。其中，在敲除EPG5的卵巢中，WT1的蛋白水平顯著升高(圖5e、i)?？傊?，scRNA-seq分析顯示，敲除EPG5顯著干擾了GC分化基因的表達(dá)。

6.  EPG5通過降解WT1調(diào)控GCs的分化

        眾所周知，WT1作為多種類固醇基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在卵泡發(fā)生過程中抑制GCs的分化。為了研究自噬缺陷如何影響GC分化，作者進(jìn)一步通過免疫熒光檢測WT1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，6周齡EPG5基因敲除的GC中WT1明顯積累(圖6a)。此外，免疫印跡顯示，在EPG5基因敲除的GCs中，WT1的數(shù)量顯著增加(圖6b，c)。作者推測在EPG5基因敲除的GCs中觀察到的強(qiáng)WT1積累可能是由于WT1蛋白降解被破壞的結(jié)果。

圖6 GCs中WT1的降解依賴于自噬

        就其背景而言，2周齡小鼠卵巢中的大多數(shù)卵泡是原發(fā)性或繼發(fā)性的，其中WT1蛋白水平較高。隨后，WT1水平開始從原發(fā)卵泡向竇卵泡和排卵前卵泡逐漸降低。作者構(gòu)建了一個(gè)卵泡同步模型來檢測敲除EPG5后WT1水平的變化。用馬絨毛膜促性腺激素(eCG)/妊娠母馬血清促性腺激素(PMSG)治療的3周齡雌性小鼠卵巢中出現(xiàn)了排卵前卵泡。在eCG/pmsg處理的3周齡EPG5基因敲除小鼠卵巢中觀察到WT1蛋白的積累，這與WT卵巢中觀察到的WT1水平急劇下降明顯不同(圖6d，e，f，g)。此外，作者觀察到EPG5基因敲除小鼠的心房卵泡中WT1沒有降解。這些結(jié)果表明，EPG5基因敲除小鼠的初級(jí)和次級(jí)卵泡具有正常的WT1積累，但WT1降解受損導(dǎo)致WT1在中央?yún)^(qū)和排卵期前的積累異常高。

        考慮到研究結(jié)果顯示EPG5基因敲除GCs的自噬通量被阻斷，這一現(xiàn)象破壞了WT1蛋白在心房和排卵前卵泡中的降解，作者對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)。將自噬/溶酶體抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)加入轉(zhuǎn)染Wt1表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)基中。在環(huán)己亞胺(CHX)追逐實(shí)驗(yàn)中，WT1的降解在3-MA處理后明顯延遲(圖6h，i)。此外，HEK293T細(xì)胞的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，WT1可以與SQSTM1物理相互作用，但不能與NBR1、LC3和TOLLIP(toll相互作用蛋白)相互作用(圖6j)。作者還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照小鼠中，WT1和SQSTM1在竇卵泡GC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中相對(duì)較大的點(diǎn)上相互共定位(圖6k)。而在EPG5基因敲除的GCs中，SQSTM1沒有與WT1共定位(圖6k)，這表明在EPG5基因敲除的GCs中，WT1降解存在缺陷。總的來說，這些結(jié)果表明WT1是通過自噬-溶酶體途徑降解的。

7.  在敲除EPG5的GCs中，類固醇基因的表達(dá)可以通過敲除Wt1而部分恢復(fù)

        WT1功能的喪失已被證明會(huì)導(dǎo)致顆粒前細(xì)胞向甾體生成細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此作者檢測了EPG5敲除GC中已知的甾體生成蛋白的水平。Gao等人(2014)證實(shí)Wt1抑制GCs中FSHR(卵泡刺激素受體)、hsd3b1/3β-羥基類固醇脫氫酶(羥基-δ-5-類固醇脫氫酶，3β-和類固醇δ異構(gòu)酶1)、Cyp11a1和Cyp19a1等基因的表達(dá)。此外，Chen等人(2017)證明WT1通過直接結(jié)合Sf1啟動(dòng)子區(qū)域抑制Sf1表達(dá)，并表明WT1失活導(dǎo)致Sf1上調(diào)，進(jìn)而激活類固醇生成程序。作者的免疫印跡顯示，與eCG/pmsg處理的3周齡對(duì)照卵巢相比，eCG/pmsg處理的3周齡EPG5敲除卵巢中FSHR、HSD3B1、CYP11A1和CYP19A1水平降低(圖7a-e)。為了探討自噬對(duì)GC分化的影響，作者從5~6周齡的EPG5敲除小鼠和對(duì)照小鼠中分離培養(yǎng)GC。氯喹(Chloroquine，CQ)用于抑制GCs的自噬。cq處理的GCs免疫印跡顯示LC3-II和WT1水平顯著升高，與EPG5敲除的GCs相似(圖7f，g，h)。此外，作者觀察到EPG5敲除和cq處理的GCs中GC分化相關(guān)蛋白水平明顯降低(圖7f，i，j，k)。這些結(jié)果表明阻斷自噬顯著影響GC分化。為了驗(yàn)證EPG5敲除GCs中類固醇基因的下調(diào)是否與WT1積累有關(guān)，作者使用siRNA下調(diào)了EPG5敲除GCs中WT1的表達(dá)(圖7l，m)。正如預(yù)測的那樣，WT1的下調(diào)部分挽救了GC分化相關(guān)基因的表達(dá)(圖7l，n，o，p，q)，表明WT1是GC分化的主要自噬靶點(diǎn)。綜上所述，這些結(jié)果支持阻斷EPG5敲除GC的自噬導(dǎo)致WT1的異常積累，導(dǎo)致GC分化相關(guān)蛋白水平異常低。

圖7 Wt1敲低部分恢復(fù)了EPG5敲除GCs中類固醇基因的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)方法

        單細(xì)胞懸液制備、RNA測序和分析、超排卵和生育能力測試、組織采集和組織學(xué)分析、卵巢卵泡的定量、原代氣相色譜分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和敲低、活細(xì)胞成像、免疫熒光染色、免疫組化染色、蛋白質(zhì)印記分析、免疫沉淀、TUNEL檢測

參考文獻(xiàn)

        Liu W, Chen M, Liu C, Wang L, Wei H, Zhang R, Ren Z, Chen Y, Luo M, Zhao J, Jiang H, Gao F, Li W. Epg5 deficiency leads to primary ovarian insufficiency due to WT1 accumulation in mouse granulosa cells. Autophagy. 2023 Feb;19(2):644-659.