解碼人類脊髓發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)空調(diào)控
脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，促進(jìn)感覺(jué)處理和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。盡管它很重要，但人類脊髓發(fā)育的時(shí)空密碼仍然難以捉摸。在這項(xiàng)研究中，作者引入了一種基于圖像的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（TF）表達(dá)解碼空間轉(zhuǎn)錄組方法（TF-seqFISH）來(lái)研究TF在人類脊髓發(fā)育過(guò)程中的空間表達(dá)和調(diào)控。通過(guò)結(jié)合TF-seqFISH的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，作者揭示了以組合TF為特征的神經(jīng)祖細(xì)胞沿背腹側(cè)軸的空間分布，以及沿中外側(cè)軸控制神經(jīng)元產(chǎn)生、遷移和分化的分子和空間特征。值得注意的是，作者觀察到一個(gè)三明治狀的興奮性和抑制性中間神經(jīng)元短暫出現(xiàn)在發(fā)育中的人脊髓背角。此外，作者整合了10x Visium的數(shù)據(jù)，確定了背角神經(jīng)發(fā)生的早期和晚期波，揭示了脊髓背角的形成。作者的研究還揭示了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）多樣化的空間差異和分子線索，以及MNs和小膠質(zhì)細(xì)胞中肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）風(fēng)險(xiǎn)基因的富集。有趣的是，作者在發(fā)育中的人類脊髓中檢測(cè)到疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）樣小膠質(zhì)細(xì)胞群，這些小膠質(zhì)細(xì)胞被預(yù)測(cè)易受ALS的影響，并參與TYROBP因果網(wǎng)絡(luò)和對(duì)未折疊蛋白的反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為人類脊髓的發(fā)育提供了時(shí)空轉(zhuǎn)錄組學(xué)資源，并為脊髓損傷修復(fù)和ALS治療提供了潛在的策略。該文章于2024年1月發(fā)表在《Cell research》，IF：44.1。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 發(fā)育中的人類脊髓的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜
作者在這里提出了一個(gè)全面的時(shí)空細(xì)胞圖譜的發(fā)展中的人類脊髓，基于兩個(gè)來(lái)源的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在單細(xì)胞分辨率。第一個(gè)數(shù)據(jù)集是通過(guò)對(duì)發(fā)育中的人類脊髓的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq獲得的，涵蓋了妊娠早期至晚期早期（GW7-27），得到了217，636個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。第二個(gè)數(shù)據(jù)集由兩組空間分解的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組成，分別使用10x Visium和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法獲得，該方法量化了1085個(gè)TF的表達(dá)水平（TF-seqFISH）（圖1a）。為了創(chuàng)建更全面的細(xì)胞景觀，作者將scRNA-seq數(shù)據(jù)與先前研究的數(shù)據(jù)整合在一起，產(chǎn)生了橫跨GW7至GW25的912，514個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄普查（圖1b）。作者的分析顯示，在細(xì)胞分裂周期中存在三種細(xì)胞類型，分別標(biāo)記為細(xì)胞周期-1、-2和-3，以及神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）和In-INs、Ex-INs和MNs的神經(jīng)元類型（圖1b）。此外，作者在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系中檢測(cè)到不同的細(xì)胞類型，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（OPCs）、定向少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（COPs）、髓鞘形成少突膠質(zhì)細(xì)胞（MFOLs）和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（MOLs）（圖1b）。在UMAP包埋中，作者還發(fā)現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（APCs），以及一組位于星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系之間的膠質(zhì)祖細(xì)胞（GPCs）（圖1b）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)嵴細(xì)胞、中胚層細(xì)胞和室管膜細(xì)胞（圖1b）。
圖1 人類脊髓發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組變化的全面時(shí)空視圖
接下來(lái)，作者采用RNA速度分析來(lái)推斷導(dǎo)致神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的譜系（圖1c）。有趣的是，分化軌跡顯示，細(xì)胞分裂（細(xì)胞周期-1/2/3）中的三個(gè)細(xì)胞組分別涉及星形細(xì)胞，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系，具有明顯的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖1）。這些發(fā)現(xiàn)表明，指導(dǎo)神經(jīng)源性、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的遺傳線索出現(xiàn)得很早，甚至在分裂細(xì)胞中也是如此。為了闡明發(fā)育中的人類脊髓中神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生事件的時(shí)間，作者分析了GWs中涉及神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的細(xì)胞比例動(dòng)力學(xué)（圖1c）。作者的結(jié)果表明，發(fā)育中的人類脊髓的神經(jīng)發(fā)生很早就開(kāi)始了，因?yàn)樯窠?jīng)源性分裂細(xì)胞（細(xì)胞周期-2）和NPC在GW7（作者的數(shù)據(jù)集中包含的最早階段）的比例很高（圖1c）。因此，豐富的神經(jīng)元子代，包括MNs， Ex-INs和In-INs，根據(jù)其神經(jīng)遞質(zhì)性質(zhì)分類，早在GW7就可以檢測(cè)到（圖1c）。
相比之下，膠質(zhì)源性事件則更具有滯后性。在星形細(xì)胞譜系中，星形細(xì)胞分裂細(xì)胞和APC在GW10左右可檢測(cè)到，并在GW15達(dá)到峰值，而星形細(xì)胞在GW10左右逐漸增加，并在GW20達(dá)到峰值（圖1c）。在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系中，低分化狀態(tài)的細(xì)胞類型，如少突膠質(zhì)分裂細(xì)胞（細(xì)胞周期-3），OPCs和COPs，在GW10左右出現(xiàn)，此后逐漸增加（圖1c）。分化良好的MFOLs和MOLs產(chǎn)生于GW18，并在GW20后顯著增加（圖1c）。免疫熒光染色進(jìn)一步支持了發(fā)育中的人脊髓神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生事件的這些時(shí)間規(guī)律，其中MNX1+ MNs， VGLUT1+ Ex-INs和GABA+ In-INs早在GW6就可以檢測(cè)到，特別是在腹角，這表明人脊髓的神經(jīng)發(fā)生可能比GW6更早發(fā)生（圖1d）。此外，作者還探測(cè)了GW9時(shí)MNX1+細(xì)胞和VGLUT1+細(xì)胞的空間組織特征（圖1e）。此外，作者對(duì)胚胎人脊髓膠質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因進(jìn)行了免疫染色。雖然在GW8時(shí)缺失，但在GW11時(shí)可以檢測(cè)到豐富的GFAP+星形細(xì)胞和PDGFRA+OLIG2+ OPCs（圖1f）。此外，在GW22時(shí)，脊髓白質(zhì)中檢測(cè)到MBP+少突膠質(zhì)細(xì)胞（圖1g）。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，在GW6前后，人類脊髓神經(jīng)發(fā)生的早期開(kāi)始，而在GW10前后，神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生的遲滯性發(fā)生。
2. 利用TF-seqFISH揭示神經(jīng)祖細(xì)胞的空間組織
為了研究人胚胎脊髓神經(jīng)發(fā)生的分子特征和空間組織原理，作者對(duì)提取的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行了scRNA-seq分析。通過(guò)實(shí)施無(wú)監(jiān)督聚類、RNA速度分析和隨后使用UMAP的可視化，作者確定了具有獨(dú)特分子特征的不同神經(jīng)元譜系（圖2a）。發(fā)現(xiàn)每個(gè)譜系中的NPC具有較低的偽時(shí)間值，并充當(dāng)起始細(xì)胞（圖2a）。作者根據(jù)認(rèn)可的TF標(biāo)記物的特征表達(dá)對(duì)這些譜系進(jìn)行了注釋，定義了不同的NPC池dp1、dp2、dp3-6、p0、p0/1、pMN和p2/3，以及相應(yīng)的神經(jīng)元類型dI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、V0、V1、MN、V2和V3（圖2a-c）。例如，dp1（例如MSX1， MSX2）和dI1（例如LHX2， LHX9和BARHL1）的小鼠TF標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)在譜系1的人類NPC和神經(jīng)元中特異性富集，因此作者將其分別定義為dp1和dI1（圖2a-c）。作者在發(fā)育中的人類脊髓中鑒定了六種神經(jīng)元譜系，每一種都具有獨(dú)特的細(xì)胞組成。譜系1由dp1和dI1組成；譜系2描述了從dp2向dI2的分化；譜系3包括不同類型的dp3-6和dI3、dI4、dI5、dI6；譜系4顯示p0-1向V1和V0分化；譜系5演示了pMN到MN的規(guī)范；和譜系6表明p2-3向V2和V3分化（圖2a）。值得注意的是，由于分子特征的相似性，在小鼠中很容易區(qū)分的某些細(xì)胞類型在人胎兒脊髓中很難識(shí)別，例如dp3-6、p0-1和p2-3（圖2a-c）。此外，作者觀察到具有相同神經(jīng)遞質(zhì)性質(zhì)的神經(jīng)元一致聚集在一起，在UMAP中，谷氨酸能dI3和dI5神經(jīng)元緊密聚集在一起，GABA能dI4和dI6也是如此（圖2a）。此外，作者在已知的遺傳標(biāo)記之外發(fā)現(xiàn)了新的基因表達(dá)模式。例如，作者發(fā)現(xiàn)在dI1中特異性表達(dá)CRABP1、LHX2和BARHL2，在dI5中特異性表達(dá)EBF1、EBF3和AJAP1，在dI6中特異性表達(dá)THSZ2、SST和CHL1，在MNs中特異性表達(dá)SLIT3、ISL1和ISL2（圖2c）。對(duì)CRABP1和經(jīng)典dI1標(biāo)記物LHX2進(jìn)行免疫染色，對(duì)SLIT3和MN特異性CHAT進(jìn)行免疫染色。
在發(fā)育過(guò)程中，TF在調(diào)節(jié)神經(jīng)祖結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞規(guī)格和腦區(qū)域的模式方面是必不可少的。在這項(xiàng)研究中，作者引入了一種基于圖像的單細(xì)胞TF-seqFISH技術(shù)，在空間背景下檢測(cè)1085個(gè)TF在發(fā)育中的人脊髓中的表達(dá)譜。作者的重點(diǎn)是解讀心室區(qū)（VZ）駐留NPC內(nèi)TF的空間分布。因此，作者進(jìn)行了全面的分析，以確定適合進(jìn)行TF-seqFISH的脊髓組織。作者首先對(duì)SOX2和NEUN進(jìn)行免疫染色，以標(biāo)記發(fā)育中不同階段的人類脊髓中的NPC。結(jié)果表明，SOX2+ NPCs在GW8位點(diǎn)明顯富集，聚集在增厚的VZ區(qū)在作者的研究中，NPC沿背腹軸的空間分布（dp1→dp2→dp3-6→p0/1→pMN→p2/3）與在發(fā)育中的小鼠和小雞脊髓中的報(bào)道相似 （圖2e）。
圖2 發(fā)育中的人脊髓神經(jīng)祖細(xì)胞的分子和空間特征
此外，作者還研究了人類祖細(xì)胞細(xì)分的TF結(jié)構(gòu)的空間組織模式。作者的研究結(jié)果顯示，在VZ區(qū)域，對(duì)確定祖細(xì)胞身份至關(guān)重要的TF在空間上表達(dá)受限（圖2f）。其中，dp1特異性的ATOH1主要富集于背側(cè)大部分細(xì)胞，而dp3-6富集的PAX3、PAX7、GSX1、GSX2廣泛分布于中上部分（圖2f）。此外，作者觀察到腹側(cè)受限的tf如PRDM8、NKX6-1、NKX2-2、NKX2-8和FOXA2的表達(dá)（圖2f）。免疫染色證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖2g）。雖然作者的研究揭示了脊髓NPC在物種進(jìn)化過(guò)程中空間基因表達(dá)的顯著保守性，但作者也發(fā)現(xiàn)了人類脊髓發(fā)育的獨(dú)特特征。例如，PTF1A廣泛分布于人脊髓，其模式與dp3-6特異性GSX1、GSX2、PAX3和PAX7相似（圖2f），不同于其對(duì)小鼠脊髓dp4神經(jīng)元的限制這種差異可能解釋了dp3-6祖細(xì)胞在人類脊髓中的不可區(qū)分性。
綜上所述，作者的研究不僅基于scRNA-seq分析鑒定了轉(zhuǎn)錄多樣性的NPC，而且闡明了NPC和TF在發(fā)育中的人脊髓表達(dá)的空間組織模式。作者的研究結(jié)果表明，盡管NPCs的空間轉(zhuǎn)錄組在物種進(jìn)化中很大程度上是保守的，但人類胎兒脊髓的發(fā)育遵循著微妙的不同的遺傳調(diào)控規(guī)則。
3. 利用TF-seqFISH揭示神經(jīng)元分化和沿中-外側(cè)軸遷移的空間動(dòng)力學(xué)
在描述了NPC的空間轉(zhuǎn)錄組之后，作者試圖闡明在發(fā)育中的人類脊髓中控制神經(jīng)元組織的規(guī)則。為此，作者基于TF-seqFISH數(shù)據(jù)集中1085個(gè)TF的表達(dá)，采用無(wú)監(jiān)督分類方法，鑒定出18個(gè)不同的分子簇（圖3a，b）。通過(guò)基于相關(guān)性的分析，這些集群進(jìn)一步劃分為5個(gè)空間離散域（區(qū)域1-5）（圖3a）。具體來(lái)說(shuō)，集群2、7、9、11、12、16和18與區(qū)域1相關(guān)；第4組和第13組分配給區(qū)域2；聚類10與區(qū)域3相關(guān)；集群14和集群5位于區(qū)域4；集群1、3、6、8和17被分組在區(qū)域5（圖3a）。根據(jù)發(fā)育中的人脊髓圖譜，22區(qū)1位于中間，主要由分裂的祖細(xì)胞組成。區(qū)域2，一個(gè)與增殖區(qū)相鄰的中間區(qū)（IZ），被指定為暫居區(qū)，包含預(yù)遷移神經(jīng)元。背側(cè)定位的地幔區(qū)3區(qū)由背角神經(jīng)元遷移和定居組成。第4區(qū)是間地幔區(qū)（MZ），包含中間神經(jīng)元和向腹角方向遷移的神經(jīng)元。最后，腹角特異區(qū)5主要由固定的腹角神經(jīng)元組成（圖3a）。這些TF分類的空間區(qū)域?yàn)槊枥L神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)提供了有價(jià)值的分子基礎(chǔ)。
然后，作者結(jié)合TF-seqFISH和scRNA-seq數(shù)據(jù)，計(jì)算了轉(zhuǎn)錄組全基因的表達(dá)譜。利用這些數(shù)據(jù)，作者還推導(dǎo)出了非TF基因的空間表達(dá)模式，為解碼發(fā)育中的人類胎兒脊髓的細(xì)胞和分子組織原理提供了全面的資源。利用這個(gè)數(shù)據(jù)集，作者旨在解開(kāi)人類脊髓中神經(jīng)元遷移和分化的謎團(tuán)。在背角，區(qū)域1、2和3高度層積（圖3a）。DEGs和基因本體（GO）分析顯示，1區(qū)的VZ細(xì)胞參與細(xì)胞分裂、維持神經(jīng)干細(xì)胞群體和調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生（圖3c）。相反，側(cè)定位區(qū)域2 （IZ）和3 （MZ）中的細(xì)胞與神經(jīng)元分化、遷移、投射發(fā)育和脊髓背側(cè)發(fā)育有關(guān)（圖3c）。
圖3 發(fā)育中的人脊髓中外側(cè)組織模式的空間分辨特征
從增殖祖細(xì)胞到有絲分裂后神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變受到不同分子的嚴(yán)格調(diào)控。例如，作者發(fā)現(xiàn)SOX2、VIM和HES5在VZ區(qū)（1區(qū)）富集，而ST18、NHLH1、ROBO3和INSM1在空間上僅限于IZ區(qū)（2區(qū)）。相比之下，DCX、CRABP1和ELAVL4的表達(dá)僅限于更偏側(cè)的MZ區(qū)（3區(qū)）（圖3c，d）。在區(qū)域2細(xì)胞中富集的基因中，NHLH1和INSM1在晚期神經(jīng)元祖細(xì)胞和新生神經(jīng)元中短暫表達(dá)，進(jìn)一步表明了尚未完全分化并到達(dá)最終位置的區(qū)域2細(xì)胞的新生身份。因此，通過(guò)探測(cè)區(qū)域2的特異性基因表達(dá)，作者在發(fā)育中的人脊髓的IZ中發(fā)現(xiàn)了一組有絲分裂后神經(jīng)元的早期標(biāo)記，包括NHLH1、INSM1、ST18、ROBO3、KLHL35等。此外，作者在側(cè)MZ（3區(qū)）較晚、更成熟的有絲分裂后細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)的基因，如CRABP1、STMN2、DCX和ZFHX3（圖3c、d）。然而，腹側(cè)增殖性VZ區(qū)比其背側(cè)對(duì)應(yīng)區(qū)薄得多，可能是由于腹側(cè)區(qū)域更早的神經(jīng)發(fā)生（圖3a）。
總的來(lái)說(shuō)，作者的TF-seqFISH數(shù)據(jù)集為理解發(fā)育中的人類脊髓神經(jīng)解剖劃分的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)提供了寶貴的資源。此外，作者的數(shù)據(jù)集提供了對(duì)神經(jīng)元生成、遷移和分化背后的空間和分子程序的詳細(xì)理解。
4. 發(fā)育中的人脊髓的脊髓背角發(fā)育
脊髓神經(jīng)元可以根據(jù)其神經(jīng)遞質(zhì)特性進(jìn)一步分類，它們?cè)谏窠?jīng)元功能和電路連接中起著至關(guān)重要的作用。脊髓中有三種主要類型的神經(jīng)遞質(zhì)定義的神經(jīng)元:谷氨酸能Ex-INs、GABA能/甘氨酸能In-INs和乙酰膽堿能MNs。通過(guò)對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)集的DEG分析，作者確定了區(qū)分這些神經(jīng)元類型的特征分子譜，如MNs中的NEFM、SLIT2、SNCG、ECEL1和NRP2， In-INs中的LAMP5、PAX2、PAX8和ID2， Ex-IN中的TLX3、NRN1、EBF3、CACNA2D1和CRABP1（圖3e）。為了進(jìn)一步研究這三種神經(jīng)元類型的空間分布，作者將TF-seqFISH細(xì)胞映射到轉(zhuǎn)錄組分類中，并分配了最匹配的神經(jīng)元身份。結(jié)果表明，MNs主要分布在腹角，而Ex-IN和In-INs主要分布在背角和中間部分（圖3f）。有趣的是，在GW8時(shí)，Ex-INs被夾在背角的兩個(gè)空間分叉的In-INs群之間（圖3f）。值得注意的是，位于VZ附近的In-INs與一些Ex-INs呈現(xiàn)混合模式（圖3f）。Ex-INs和In-INs富集基因的空間表達(dá)譜也揭示了這種獨(dú)特的組織模式，這種組織模式在整個(gè)脊髓中保持一致（圖3f）。在成人脊髓中，背角神經(jīng)元被組織成不同的層，接受特定的感覺(jué)輸入人類胎兒脊髓背角中Ex-INs和In-INs的三明治狀組織可能是形成適當(dāng)?shù)幕芈愤B接以感知環(huán)境和內(nèi)部信號(hào)的中間狀態(tài)。
接下來(lái)，作者的目標(biāo)是揭示在廣泛的時(shí)間范圍內(nèi)背角發(fā)育的分子和細(xì)胞事件。為此，作者對(duì)不同胎齡（GW8、GW9、GW13、GW27）的人脊髓組織發(fā)育進(jìn)行了10× Visium實(shí)驗(yàn)，豐富了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源。利用無(wú)監(jiān)督聚類，作者根據(jù)分子特征和空間位置對(duì)13個(gè)具有分子特征的斑點(diǎn)簇進(jìn)行了分類，包括腹側(cè)灰色細(xì)胞、背側(cè)灰色細(xì)胞、中間灰色細(xì)胞、外側(cè)皮質(zhì)脊髓束、分裂細(xì)胞、室管膜、中胚層、背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞（僅從GW8和GW9的組織中捕獲）、背側(cè)和腹側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞以及兩組MNs（圖4a，b）。作者發(fā)現(xiàn)GW8樣本中沒(méi)有一組斑點(diǎn)，主要由群集12和群集13組成（用紅色圓圈勾畫(huà)）（圖4c），當(dāng)空間可視化時(shí)，這組斑點(diǎn)位于背角的表面（圖4d）。在GW9、GW13和GW27處，除了一些具有Cluster 8身份的黃色斑點(diǎn)外，作者還可以在背角處檢測(cè)到Cluster 12和Cluster 13的斑點(diǎn)（圖4d）。然而，在GW8時(shí)，背角僅能檢測(cè)到Cluster 8的斑點(diǎn)，而Cluster 12和13的斑點(diǎn)則完全缺失（圖4c，d）。作者的結(jié)果表明，在GW8時(shí)或之前出現(xiàn)了早生神經(jīng)元（Cluster 8），在GW8后出現(xiàn)了晚生神經(jīng)元（Cluster 12和13）。GW9時(shí)晚生神經(jīng)元的出現(xiàn)與發(fā)育中的人類脊髓背角的擴(kuò)張相吻合，表明它們?cè)诒辰菢?gòu)建中的重要性（圖4d）。
此外，作者還進(jìn)行了DEG分析，以探測(cè)背角中早生和晚生神經(jīng)元的分子特征。作者發(fā)現(xiàn)，簇8中早生的神經(jīng)元對(duì)CRABP1、RBP1、ROBO3、MEIS2和OTP具有特異性，而簇12和13中晚生的神經(jīng)元?jiǎng)t表現(xiàn)出獨(dú)特的分子特異性（圖4e）。集群12具有ENC1、SST、EBF3、GRIA2和PCDH8的特征，而集群13具有MAF、MAFA、CCK和RORB的特征（圖4e）。通過(guò)分析其在所有不同簇中的表達(dá)，也確定了CRABP1在簇8中的特異性富。CRABP1和DRGX的空間表達(dá)譜進(jìn)一步說(shuō)明了背角的模塊化結(jié)構(gòu)，它們分別代表了早期和晚期的神經(jīng)元（圖4f， g）。值得注意的是，DRGX在GW8時(shí)特異性地在DRG細(xì)胞中表達(dá)豐富，而在脊髓中沒(méi)有表達(dá)（圖4f）。通過(guò)整合scRNA-seq和10x Visium數(shù)據(jù)集，作者還鑒定了集群8、12和13的神經(jīng)元身份。Cluster 8中早出生的神經(jīng)元主要定位于dI1、dI2、dI3和dI4神經(jīng)元類型，而Cluster 12和13中晚出生的神經(jīng)元主要定位于dI5和dI6神經(jīng)元類型（圖4h）。此外，作者對(duì)GW8和GW9的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的分析顯示，大多數(shù)dI5和dI6神經(jīng)元起源于GW9，這表明這些神經(jīng)元具有晚出生的身份。有趣的是，與圖1c-g所描述的觀察結(jié)果一致，作者的研究還揭示了背側(cè)和腹側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的緩慢出現(xiàn)（圖4c）。
因此，通過(guò)采用空間視角，作者對(duì)支撐人類脊髓背角發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)制進(jìn)行了全面的研究（圖4i）。在胚胎初期，作者在背角中發(fā)現(xiàn)了典型的背腹層狀神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，這為體感覺(jué)回路的構(gòu)成奠定了基礎(chǔ)。利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集，作者不僅確定了發(fā)育中的人類脊髓背角的早期神經(jīng)源性事件，而且還確定了延遲的事件，并將GW8時(shí)代歸因于背角個(gè)體發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間間隔。
圖4 探索人類脊髓背角發(fā)育的空間、細(xì)胞和分子基礎(chǔ)
5. 人類脊髓發(fā)育過(guò)程中MNs的分子和空間多樣性
脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在形態(tài)、連通性和功能特征上表現(xiàn)出多樣性。MN多樣性的一個(gè)值得注意的方面是它們分為不同的柱狀群，每個(gè)柱狀群在脊髓內(nèi)占據(jù)特定的背側(cè)位置，并支配獨(dú)特的外周靶組織陣列。MN柱狀群主要有四大類:LMC（外側(cè)運(yùn)動(dòng)柱），可進(jìn)一步分為外側(cè)（LMCl）和內(nèi)側(cè)（LMCm）子柱；節(jié)前運(yùn)動(dòng)柱（PGC）；軸下運(yùn)動(dòng)柱（HMC）和正中運(yùn)動(dòng)柱（MMC）（圖5a）。
圖5 MN的分子程序占早期規(guī)范的多樣性
在闡明了控制背角神經(jīng)元回路形成的復(fù)雜細(xì)胞和分子原理之后，作者將努力揭示驅(qū)動(dòng)MN多樣化的因素，這是對(duì)感知到的外周信號(hào)做出反應(yīng)的唯一手段。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，作者深入研究了包含MN及其祖細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)集，根據(jù)無(wú)監(jiān)督聚類和顯著的基因表達(dá)模式，將其進(jìn)一步分類為MN的祖細(xì)胞（pMNs）、新生MN （nb MN-1和nb MN-2）和具有不同列身份的MN （LMCm、LMCl、MMC、PGC和HMC）（圖5b-d）。利用RNA速度推斷發(fā)育軌跡，揭示了MNs從pMN到新生MN到具有不同柱身份的MN的分化（圖5b）。還確定了每種細(xì)胞類型的節(jié)段偏好，即頸、胸和腰椎來(lái)源（圖5b）。有趣的是，作者的分析揭示了MNs在GW7-8的早期柱狀特性，這是作者研究中最早的時(shí)間點(diǎn)（圖5b-d）。此外，作者使用免疫染色驗(yàn)證了柱狀身份的早期規(guī)范，以及它們的片段偏好（圖5e）。作者的研究還發(fā)現(xiàn)了新的柱特異性基因表達(dá)模式，為作者對(duì)柱特異性MNs的理解增加了一個(gè)新的維度。例如，作者發(fā)現(xiàn)TAC1、NRP1和NTRK2在LMC中富集，TSHZ2、DUSP4和ID4在LMCm中富集，PCDH9、DPP6和OPRK1在LMCl中富集，CXXC5、PEG3和CELF4在PGCs中上調(diào)（圖5d）。
不同的TF表達(dá)譜與針對(duì)不同目標(biāo)肌肉群的MN池有關(guān)作者在LMC神經(jīng)元中鑒定出具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組特征的亞群。這些亞組被稱為假定的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元池，通過(guò)評(píng)估池特異性基因的獨(dú)特表達(dá)來(lái)識(shí)別，如NKX6-1、NKX6-2、ETV1和ETV4。此外，作者還揭示了內(nèi)臟MNs（主要是胸椎衍生的交感PGCs）和軀體MNs（包括LMCm、LMCl、MMC和HMC）之間的轉(zhuǎn)錄差異，并通過(guò)GW13時(shí)頸椎和胸椎切片的空間轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證了這一點(diǎn)。因此，作者的分析揭示了推測(cè)的MN柱和MN池的早期轉(zhuǎn)錄規(guī)范。在發(fā)育過(guò)程中對(duì)軸突軌跡和神經(jīng)-肌肉連接至關(guān)重要。然而，在作者的數(shù)據(jù)集中，體細(xì)胞MNs并沒(méi)有表現(xiàn)出明確的α和γ亞型的亞聚類這一觀察結(jié)果可能歸因于作者數(shù)據(jù)集的特征，因?yàn)樗饕▉?lái)自早期胚胎階段的MNs。
為了研究驅(qū)動(dòng)MN分化的分子程序，作者首先分析了頸椎、胸椎和腰椎節(jié)段之間的DEG，特別是頭尾側(cè)HOX的表達(dá)，這被認(rèn)為是指導(dǎo)不同節(jié)段的MN柱和池身份。接下來(lái)，利用發(fā)育軌跡推斷，作者揭示了pMN分化背后的分子級(jí)聯(lián)，pMN分化分為三個(gè)不同的基因模塊，分別富集于pMN、nbMN-1和nbMN-2（圖5f）。功能推斷顯示，包含DLL1、EPHA3、OLIG2、NEUROG1、NEUROG2和GPC3等基因的基因模塊1參與神經(jīng)干細(xì)胞群體的維持和分裂。基因模塊2由LHX3、ISL1、MNX1、NR2F1、CNTN2等基因組成，參與調(diào)控脊髓MN細(xì)胞命運(yùn)，促進(jìn)神經(jīng)元分化。最后，基因模塊3由SLIT2、LHX1、PBX1、PBX3和NRXN1等基因組成，與細(xì)胞增生、MN軸突引導(dǎo)和神經(jīng)元遷移有關(guān)（圖5f、g）。作者的TF-seqFISH數(shù)據(jù)顯示了這些pMN、新生MN-1和新生MN-2富集基因沿中外側(cè)軸的空間分布。此外，通過(guò)將新生MNs與不同列中的MNs進(jìn)行配對(duì)整合，作者確定了新生MNs具有假定的MMC、PGC、HMC、LMCl和LMCm命運(yùn)，從而揭示了新生MNs中列特異性轉(zhuǎn)錄規(guī)范（圖5h）。新生MNs的無(wú)監(jiān)督子簇與列特異性轉(zhuǎn)錄特征之間的強(qiáng)大相似性進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)。
總的來(lái)說(shuō)，作者的研究揭示了MNs在組織（MN柱和池）和功能（體細(xì)胞MNs和內(nèi)臟MNs）背景下的早期轉(zhuǎn)錄組特征。此外，作者的研究結(jié)果通過(guò)揭示控制MN多樣化的轉(zhuǎn)錄程序，為將干細(xì)胞編程為特定MN亞型提供了路線圖（圖5i）。
6. 人類脊髓發(fā)育過(guò)程中的星形細(xì)胞發(fā)生
對(duì)人類脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性的調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然有限。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者將細(xì)胞周期1細(xì)胞與指示星形細(xì)胞命運(yùn)的分子線索結(jié)合起來(lái)，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞和APC。采用無(wú)監(jiān)督聚類，作者確定了兩組不同的APC， APC-1和APC-2，以及五個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞亞簇（圖6a）。然后，根據(jù)原生質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞（PA）和纖維狀星形膠質(zhì)細(xì)胞（FA）的標(biāo)記基因SLC1A2和GFAP的表達(dá)，作者將5種不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞類型分別標(biāo)注為FA1-2和PA1-3（圖6a）。為了進(jìn)一步研究FA和PA在發(fā)育過(guò)程中是如何分化的，作者利用RNA速度分析在轉(zhuǎn)錄組水平上推斷了人類脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化軌跡。作者觀察到細(xì)胞周期-1作為起始細(xì)胞分化為APC-1和APC-2，然后分別產(chǎn)生FA和PA（圖6a）。這與APCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞成對(duì)整合的結(jié)果一致，如Sankey圖所示（圖6b）。這些發(fā)現(xiàn)表明FA和PA起源于不同的祖細(xì)胞群，這使作者研究了APC-1和APC-2中活性差異的遺傳程序（圖6c）。作者的分析揭示了NTRK2、GFAP、ZFP36L1和IGFBP5在APC-1中的特異性表達(dá)，以及GLUL、MT3、APOE和SLC6A11在APC-2中的獨(dú)特表達(dá)，為指導(dǎo)不同類型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的分子密碼提供了重要的見(jiàn)解（圖6c， d）。此外，作者發(fā)現(xiàn)了定義FA和PA的新基因，如CRYAB、SAT1和ID3在FA中的特異性表達(dá)，以及MT3、ALDOC、CST3和ATP1B1在PA中的特異性表達(dá)，這通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集和免疫染色結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證（圖6e， f）。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，人類脊髓中的FA和PA來(lái)自具有不同基因表達(dá)譜的不同細(xì)胞系。
圖6 發(fā)育中的人脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間異質(zhì)性
為了探索人類胎兒脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間特征，作者對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類，并鑒定出具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組譜的四種不同組:背側(cè)FA、背側(cè)PA、腹側(cè)FA和腹側(cè)PA（圖6g，h）。使用GW27的10× Visium數(shù)據(jù)，作者在空間上可視化了這些轉(zhuǎn)錄不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型（圖6g）。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)一些參與指定神經(jīng)元空間命運(yùn)的基因，如PAX3和ZIC1，也在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，這表明神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間規(guī)范可能在一定程度上共享共同的轉(zhuǎn)錄編碼（圖6h，i，2f）。此外，作者分析了不同發(fā)育階段背側(cè)和腹側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例，并觀察到腹側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞在早期胚胎階段首次被檢測(cè)到。隨后，背部星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例增加，并在大約GW16時(shí)與腹側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞大致相等（圖6j）。這些發(fā)現(xiàn)為人類胎兒脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的空間動(dòng)力學(xué)提供了重要的見(jiàn)解，并提出了星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育與神經(jīng)元之間的潛在聯(lián)系。
7. 揭示ALS細(xì)胞類型易感性的分子基礎(chǔ)
肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種毀滅性的神經(jīng)退行性疾病，其特征是逐漸喪失MNs，導(dǎo)致肌肉無(wú)力、萎縮、癱瘓，最終導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡盡管付出了巨大的努力，ALS發(fā)病機(jī)制的潛在分子機(jī)制仍然不完全清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者對(duì)發(fā)育中的人類脊髓的scRNA-seq數(shù)據(jù)集與GWAS數(shù)據(jù)集進(jìn)行了綜合分析，其中包括29，612名ALS患者和122，656名對(duì)照作者應(yīng)用單細(xì)胞疾病相關(guān)評(píng)分（scDRS）來(lái)評(píng)估scRNA-seq數(shù)據(jù)中單個(gè)細(xì)胞的多基因疾病富集情況。作者的分析顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、MNs和周細(xì)胞是GWAS鑒定的ALS風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)最脆弱的細(xì)胞類型（圖7a）。通過(guò)將ALS基因列表與這四種細(xì)胞類型中的DEGs交叉，作者確定了在這四種易感細(xì)胞類型中特異性富集的ALS風(fēng)險(xiǎn)基因:MNs（157個(gè)基因）、小膠質(zhì)細(xì)胞（70個(gè)基因）、內(nèi)皮細(xì)胞（92個(gè)基因）和周細(xì)胞（29個(gè)基因）。鑒于MN功能障礙和死亡是ALS的主要標(biāo)志，作者首先關(guān)注了MN中富集的ALS風(fēng)險(xiǎn)基因（圖7b）。在這些MN富集的ALS風(fēng)險(xiǎn)基因中，MAPT、OPTN、NRXN3、UNC13A、KIF5A等基因在ALS中的作用已經(jīng)在前人的研究中得到了探討，為作者的分析提供了證據(jù)支持。作者的氧化石墨烯富集分析表明，在MNs中富集的風(fēng)險(xiǎn)基因主要參與細(xì)胞投射組織、化學(xué)突觸傳遞、跨突觸信號(hào)傳導(dǎo)和突觸信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)等過(guò)程（圖7b，c）。
除了MNs外，作者的研究還深入了解了非神經(jīng)元細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用，這與該疾病的非細(xì)胞自主病理一致（圖7a）。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要常駐免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出免疫特性，根據(jù)不同的情況，它既可以是神經(jīng)保護(hù)細(xì)胞，也可以是神經(jīng)毒性細(xì)胞。雖然越來(lái)越多的證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞在ALS中起作用，但它們對(duì)病理的確切貢獻(xiàn)尚不清楚。為了更好地了解發(fā)育中的人類脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞景觀，作者用獨(dú)特的分子特征表征了異質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞類型。其中包括表達(dá)MKI67的增生性小膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)表達(dá)穩(wěn)態(tài)基因的小膠質(zhì)細(xì)胞，如CX3CR1、TMEM119和CSF1R，以及具有APOE、SPP1和DDIT4等遺傳特征的潛在活性狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖7d-f）。此外，作者確定了表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物MBP的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖7e），這在其他研究中也被記錄在小鼠腦白質(zhì)發(fā)育以及小鼠脊髓中。IBA1和MBP的免疫染色進(jìn)一步證明了MBP+小膠質(zhì)細(xì)胞存在于發(fā)育中的人脊髓中，并優(yōu)先分布在白質(zhì)中（圖7f）。除了不同的小膠質(zhì)細(xì)胞類型，作者還鑒定了四個(gè)表達(dá)髓細(xì)胞標(biāo)記物的髓細(xì)胞簇，如LYZ、LYVE1、S100A4和S100A9。作者的目的是研究哪些小膠質(zhì)細(xì)胞亞型優(yōu)先參與ALS病理。ScDRS分析顯示MG-2、MG-4、MG-5、MG-6和My-4與GWAS風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)顯著相關(guān)，表明它們優(yōu)先參與ALS病理（圖7g）。
先前的研究已經(jīng)確定了一種具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群，稱為DAM，用于神經(jīng)退行性疾病，如ALS和阿爾茨海默病。大壩的特點(diǎn)是下調(diào)穩(wěn)態(tài)基因特征和上調(diào)參與吞噬、脂質(zhì)代謝和溶酶體途徑的基因。因此，通過(guò)評(píng)估DAM基因評(píng)分，作者想知道在發(fā)育中的人類脊髓中發(fā)現(xiàn)的易感小膠質(zhì)細(xì)胞群（MG-2、MG-4、MG-5和MG-6）是否與DAM具有一些轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。作者的研究結(jié)果顯示，MG-2、MG-4、MG-5和MG-6的評(píng)分明顯更高，這表明成人大腦中的DAM與胚胎人類脊髓中的DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性（圖7h）。作者的免疫染色結(jié)果證實(shí)了DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育中的人類脊髓中的存在，其中小膠質(zhì)標(biāo)記物IBA1與DAM特異性標(biāo)記物如APOE（圖7f）、DDIT4和SPP1共定位。這些結(jié)果也強(qiáng)調(diào)了DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育中的人類脊髓白質(zhì)中的空間偏好。然后，對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步分析表明，DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)發(fā)生在GW16至GW25的發(fā)育階段。先前的研究也報(bào)道了健康個(gè)體發(fā)育中的大腦中存在DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞，這與作者的研究結(jié)果一致。
通過(guò)DEG深入研究四個(gè)DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞群的遺傳特征（圖7i）和GO分析顯示，它們參與小膠質(zhì)細(xì)胞中TYROBP因果網(wǎng)絡(luò)等活動(dòng)，對(duì)未折疊蛋白作出反應(yīng)，積極調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，對(duì)有毒物質(zhì)作出反應(yīng)，對(duì)軸突損傷作出反應(yīng)，參與神經(jīng)元凋亡過(guò)程，激活T細(xì)胞（圖7j，k）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。綜上所述，作者的研究在胚胎發(fā)育的人類脊髓中發(fā)現(xiàn)了四種轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞，為ALS發(fā)病機(jī)制背后的小膠質(zhì)細(xì)胞譜提供了有價(jià)值的見(jiàn)解。
圖7 聯(lián)合GWAS分析揭示了ALS發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞類型特異性特征
以往的研究已經(jīng)確定，血腦屏障和血脊髓屏障的破壞是ALS的關(guān)鍵因素，并將ALS歸類為神經(jīng)血管疾病。作者的研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞是與ALS遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)相關(guān)的主要細(xì)胞類型（圖7a）。在內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中特異性表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)基因通過(guò)將注釋的風(fēng)險(xiǎn)基因與其DEG相交來(lái)鑒定。氧化石墨烯分析顯示，內(nèi)皮富集的風(fēng)險(xiǎn)基因與血管生成、止血和細(xì)胞連接組織等過(guò)程有關(guān)，而周細(xì)胞富集的風(fēng)險(xiǎn)基因與脈管系統(tǒng)發(fā)育等過(guò)程有關(guān)。因此，作者關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞參與ALS以及這些細(xì)胞類型中相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因表達(dá)偏好的研究結(jié)果可能為ALS的神經(jīng)血管病因提供見(jiàn)解。
結(jié)論：
綜上所述，作者的研究結(jié)果揭示了ALS可能的細(xì)胞機(jī)制和特定細(xì)胞類型的風(fēng)險(xiǎn)基因表達(dá)偏好，這對(duì)作者對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的理解有深刻的見(jiàn)解，并可以為精確治療的發(fā)展提供信息。
實(shí)驗(yàn)方法：
10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，TF-seqFISH，免疫熒光，scRNA-seq和10x Visium數(shù)據(jù)的比對(duì)和準(zhǔn)備，scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，發(fā)育中的人類脊髓的發(fā)育軌跡推斷，探索人類皮層發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)源性和膠質(zhì)源性事件中的細(xì)胞類型比例動(dòng)態(tài)，神經(jīng)元譜系測(cè)定，MN發(fā)展分析，基因表達(dá)隨MN分化的變化，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和譜系軌跡推斷。確定星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間特性，聚類間DEG的鑒定，與GWAS聯(lián)合分析。
參考文獻(xiàn)：
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