肝Zbtb18（含鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域的18）通過FXR（法尼醇X受體）減輕肝脂肪性肝炎
脂肪酸合成和消耗之間的持續(xù)失衡會(huì)導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝?。?span>NAFLD），以及肝炎和胰島素抵抗。然而，潛在機(jī)制的細(xì)節(jié)尚不完全清楚。在本研究中，作者揭示了轉(zhuǎn)錄因子Zbtb18在NAFLD患者和小鼠模型的肝臟中的表達(dá)顯著降低。肝臟Zbtb18敲除促進(jìn)了NAFLD的特征，如能量消耗受損和脂肪酸氧化（FAO），并誘導(dǎo)胰島素抵抗。相反，在高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的小鼠或糖尿病小鼠中，肝臟Zbtb18過表達(dá)減輕了肝脂肪變性、胰島素抵抗和高血糖。值得注意的是，體外和體內(nèi)機(jī)制研究表明，Zbtb18轉(zhuǎn)錄激活法尼醇X受體（FXR）介導(dǎo)的FAO和網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC）蛋白可抑制NLRP3炎癥小體的活性。通過在小鼠和培養(yǎng)的小鼠原代肝細(xì)胞（MPHs）中敲除和強(qiáng)制表達(dá)FXR，進(jìn)一步驗(yàn)證了肝細(xì)胞Zbtb18表達(dá)減輕NAFLD和隨后的肝纖維化的關(guān)鍵機(jī)制。此外，敲除CLTC顯著消除了肝臟Zbtb18過表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活性的抑制作用。綜上所述，Zbtb18通過轉(zhuǎn)錄激活FXR介導(dǎo)的FAO和CLTC的表達(dá)，從而抑制NLRP3炎癥小體的活性，減輕炎癥應(yīng)激和胰島素抵抗，為治療肝脂肪變性和纖維化提供了有價(jià)值的藥物。本文于2024年1月發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：39.3，Q1。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1、肝臟Zbtb18表達(dá)下調(diào)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
為了系統(tǒng)全面地識(shí)別參與脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)分子，作者首先對(duì)NAFLD患者和正常對(duì)照的肝組織進(jìn)行了mRNA微陣列分析，并隨后將該臨床轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（來自NAFLD患者的GSE213621和來自NAFLD小鼠模型的GSE35961）進(jìn)行了交叉分析，以確定差異表達(dá)基因（DEGs）。結(jié)果顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)錄組分別有274、411和792個(gè)差異表達(dá)基因。此外，3個(gè)數(shù)據(jù)集中有33個(gè)DEGs重疊。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)在這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，肝臟Zbtb18的表達(dá)下調(diào)（圖1a）。此外，作者證實(shí)了NAFLD患者肝活檢組織中Zbtb18 mRNA和蛋白的顯著降低（圖1b）。作者還發(fā)現(xiàn)在幾種NAFLD小鼠模型（包括db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠和HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠）中，肝臟Zbtb18表達(dá)降低（圖1c-e）。此外，在油酸和棕櫚酸（OA和PA）培養(yǎng)的小鼠原代肝細(xì)胞（MPHs）中，肝臟Zbtb18的表達(dá)顯著降低（圖1f-g）。為了初步探究Zbtb18的生理功能，作者構(gòu)建了AD -Zbtb18感染的MPHs，發(fā)現(xiàn)Zbtb18過表達(dá)有效地增加了參與FAO和氧化磷酸化（OXPHOS）的基因表達(dá)，而顯著抑制了參與糖異生的基因（圖1h, i）。因此，Zbtb18過表達(dá)增加了脂肪酸的分解代謝，同時(shí)減少了MPHs中的脂質(zhì)沉積（圖1j-l）。因此，作者的研究表明肝臟Zbtb18與NAFLD的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。
圖1 肝臟Zbtb18 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
2、肝臟Zbtb18的消融使小鼠更容易發(fā)生脂肪性肝炎
為了探索肝臟Zbtb18的功能，作者首先生成了肝細(xì)胞特異性Zbtb18缺失（Zbtb18LKO）小鼠。以Zbtb18flox/flox小鼠作為Zbtb18LKO小鼠對(duì)照。接下來，作者長期給予這些小鼠高脂飲食（HFD），以進(jìn)一步探索肝臟Zbtb18在脂質(zhì)代謝中的生理作用。作者發(fā)現(xiàn)，肝臟Zbtb18缺失易使小鼠在長時(shí)間HFD暴露后發(fā)生肥胖，如小鼠較高的體重和脂肪量所示（圖2a, b）。組織學(xué)檢查（HE染色）也一致顯示Zbtb18LKO小鼠附睪白色脂肪組織（WAT）、腹股溝WAT和肩胛間棕色脂肪組織（BAT）的脂肪細(xì)胞肥大增加（圖2c）。相應(yīng)地，這些小鼠肩胛間BAT中產(chǎn)熱基因的表達(dá)受到抑制，這可能導(dǎo)致了它們的體重增加（圖2d）。然后，作者將小鼠飼養(yǎng)在代謝籠中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照小鼠相比，Zbtb18LKO小鼠的能量消耗、呼吸O2消耗和CO2生成程度較低（圖2e）。更重要的是，Zbtb18LKO小鼠顯示HFD喂養(yǎng)后小鼠的空腹血糖和胰島素水平增加（圖2f）。此外，Zbtb18LKO小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐量和胰島素敏感性的損害（圖2g）。隨后的蛋白質(zhì)印跡分析也顯示了Zbtb18LKO小鼠肝臟中AKT和GSK-3β磷酸化的降低，進(jìn)一步表明這些小鼠的胰島素敏感性受損（圖2h）。此外，肝臟Zbtb18缺失降低了參與FAO和OXPHOS的基因，上調(diào)了糖原生成基因，共同增加了高脂飲食小鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積（圖2i, j）。
圖2 肝臟Zbtb18的消融加重了HFD喂養(yǎng)的小鼠的脂肪性肝炎
3、肝臟Zbtb18過表達(dá)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性的保護(hù)作用
為了驗(yàn)證肝臟Zbtb18的增加是否可以改善肝臟的脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，作者通過將Alb-Cre小鼠和Rosa26-Zbtb18小鼠雜交，產(chǎn)生了肝臟特異性Zbtb18過表達(dá)（Zbtb18LKI）小鼠。以Zbtb18Rosa26基因敲入小鼠作為Zbtb18LKI對(duì)照。作者首先將這些小鼠暴露于HFD，發(fā)現(xiàn)Zbtb18過表達(dá)降低了體重，這可能歸因于脂肪量和肝臟重量的減少（圖3a, b）。此外，與同窩對(duì)照小鼠相比，Zbtb18LKI小鼠表現(xiàn)出能量消耗、呼吸氧消耗和CO2生成的增加，以及BAT中Ucp1（解偶聯(lián)蛋白1）基因表達(dá)的增加，最終導(dǎo)致體重下降（圖3c, d）。值得注意的是，Zbtb18過表達(dá)有效緩解了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性，包括肝細(xì)胞氣球樣變和脂質(zhì)沉積的改善（圖3e）。此外，Zbtb18LKI小鼠的血清酮體水平升高，肝臟和血清TGs水平降低（圖3f, g）。相應(yīng)地，Zbtb18過表達(dá)增加了參與脂肪分解、FAO和OXPHOS的基因表達(dá)，而與脂肪生成相關(guān)的基因表達(dá)略有變化（圖3h）。此外，改善肝臟過度脂質(zhì)蓄積可有效減輕HFD誘導(dǎo)的肝臟脂毒性。這減輕了炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥細(xì)胞因子的釋放，最終逆轉(zhuǎn)了HFD引起的肝炎，改善了肝功能，表現(xiàn)為炎癥基因表達(dá)和血清ALT、AST水平的降低（圖3i-l）。同樣，由于肝臟Zbtb18的過表達(dá)，這些小鼠表現(xiàn)出較低的空腹血糖和胰島素水平（圖3m, n）。肝臟Zbtb18過表達(dá)還改善了HFD喂養(yǎng)的小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性，并提高了肝臟中AKT和GSK-3β的磷酸化，表明HFD暴露導(dǎo)致的胰島素信號(hào)通路改變得到了恢復(fù)（圖3o, p）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明了肝臟Zbtb18在維持全身糖脂平衡中發(fā)揮著重要作用。
圖3 肝臟Zbtb18過表達(dá)對(duì)抗高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性
4、強(qiáng)制肝臟Zbtb18表達(dá)減輕糖尿病小鼠的肝脂肪變性
鑒于肝臟Zbtb18在保護(hù)飲食誘導(dǎo)的糖脂紊亂方面的主要作用，作者接下來測(cè)試其過表達(dá)是否會(huì)改善糖尿病db/db小鼠的脂肪肝表型。因此，通過尾靜脈注射AAV-Zbtb18, db/db小鼠的肝臟Zbtb18表達(dá)增加（補(bǔ)充圖7）。與此一致，AAV-Zbtb18感染的db/db小鼠體重和肝臟重量/體重比值降低（圖4a, b）。AAV介導(dǎo)的肝臟Zbtb18過表達(dá)也顯著改善了db/db小鼠的脂肪肝表型，如TGs含量的總體變化和組織學(xué)分析所示（圖4c, d）。同樣，AAV-Zbtb18感染的db/db小鼠顯示空腹血糖和胰島素水平降低（圖4e）。后一結(jié)果暗示db/db小鼠中葡萄糖紊亂的改善，這通過改善的葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗進(jìn)一步證實(shí)（圖4f）。此外，在注射AAV-Zbtb18的db/db小鼠中也觀察到血清酮體水平升高（圖4g）。相應(yīng)地，肝臟Zbtb18過表達(dá)顯著增加了脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，而糖原基因包括Pgc-1α和Pepck被抑制（圖4h）。同時(shí)，肝臟中AKT和GSK-3β磷酸化的增加促進(jìn)了db/db小鼠胰島素功能障礙的恢復(fù)（圖4i）。同時(shí)，Zbtb18過表達(dá)的db/db小鼠肝臟F4/80和cd11b陽性巨噬細(xì)胞在肝臟內(nèi)的聚集顯著減少，同時(shí)炎性細(xì)胞因子水平降低（圖4j, k）。所有這些變化都有助于肝功能障礙的改善，正如這些小鼠血清ALT和AST水平的降低所證明的（圖4l）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，靶向肝臟Zbtb18是阻止db/db小鼠肝臟脂肪變性進(jìn)展的有效方法。
圖4 挽救肝臟Zbtb18表達(dá)可減輕糖尿病小鼠的肝脂肪變性
5、Zbtb18通過轉(zhuǎn)錄激活FXR介導(dǎo)的FAO加速脂質(zhì)分解代謝
為了研究在Zbtb18介導(dǎo)的肝臟保護(hù)作用中涉及的效應(yīng)器或信號(hào)節(jié)點(diǎn)的細(xì)節(jié)，作者對(duì)Zbtb18過表達(dá)的MPHs進(jìn)行了RNA-seq。因此，作者發(fā)現(xiàn)7347個(gè)基因因Zbtb18的過表達(dá)而發(fā)生了不同的變化，其中3628個(gè)基因上調(diào)，3719個(gè)基因下調(diào)（圖5a）。隨后的GO分析表明，Zbtb18過表達(dá)伴隨著肝臟炎癥和脂肪酸代謝通路的明顯顯著改變（圖5b）。為了深入了解Zbtb18調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸代謝和炎癥的潛在機(jī)制，作者分析了從Zbtb18過表達(dá)的MPHs和NAFLD患者肝臟中發(fā)現(xiàn)的重疊DEGs。值得注意的是，結(jié)果顯示大部分重疊的DEGs涉及FXR靶基因（圖5c, d）。此外，在Zbtb18過表達(dá)的MPHs和NAFLD患者的肝臟中鑒定的上述DEGs的基因集富集分析（GSEA）顯示，“FXR信號(hào)通路”與Zbtb18的表達(dá)呈正相關(guān)，提示這些DEGs的表達(dá)可能是由FXR依賴的機(jī)制驅(qū)動(dòng)的（圖5e）。此外，在Zbtb18過表達(dá)的肝臟中，FXR mRNA和蛋白水平均上調(diào)（圖5f-g）。與此一致，Zbtb18過表達(dá)也顯著增加了培養(yǎng)的MPHs中FXR蛋白及其靶基因的總水平和細(xì)胞核水平（圖5h）。
為了進(jìn)一步探索Zbtb18激活FXR的潛在機(jī)制，作者在MPHs中進(jìn)行了Zbtb18特異性ChIP-seq。結(jié)果顯示在FXR基因中有一個(gè)顯著的Zbtb18結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域（圖5i）。此外，作者進(jìn)一步分析了ChIP-seq數(shù)據(jù)，并證實(shí)位于FXR啟動(dòng)子區(qū)域的“AACTCACTCT”是Zbtb18的關(guān)鍵結(jié)合基序（圖5j）。然后，使用一系列已報(bào)道的構(gòu)建體（pFXR-1838, pFXR-1074和pFXR-677）在HepG2和MIHA細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。作者發(fā)現(xiàn)，Zbtb18顯著刺激pFXR-1838和pFXR-1074的轉(zhuǎn)錄活性，而pFXR-677沒有產(chǎn)生影響，這表明Zbtb18轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)從-1074 bp到-677 bp（圖5k, l，左）。更重要的是，FXR啟動(dòng)子區(qū)AACTCACTT突變?yōu)?span>TTTTTTTT減弱了Zbtb18對(duì)FXR轉(zhuǎn)錄活性的刺激作用，表明其結(jié)合位點(diǎn)位于FXR區(qū)域（圖5k, l，右）。此外，作者的ChIP-qPCR分析顯示，在db/db小鼠和HFD喂養(yǎng)的小鼠的肝臟中，FXR啟動(dòng)子上的Zbtb18轉(zhuǎn)錄因子的占用顯著降低，這進(jìn)一步詳細(xì)說明了這些小鼠中FXR失調(diào)的機(jī)制（圖5 m）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證FXR在介導(dǎo)Zbtb18誘導(dǎo)的保護(hù)作用中的關(guān)鍵作用，作者構(gòu)建了FXR敲除的MPHs，并發(fā)現(xiàn)FXR缺失顯著削弱了Zbtb18對(duì)FAO的保護(hù)作用，導(dǎo)致MPHs中的脂質(zhì)積累水平未發(fā)生改變（圖5n-p）。相反，FXR過表達(dá)減輕了Zbtb18缺乏引起的MPHs中脂質(zhì)沉積（圖5q）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Zbtb18介導(dǎo)的FXR轉(zhuǎn)錄激活與肝細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。
圖5 FXR的Zbtb18轉(zhuǎn)錄激活通過FAO加速脂質(zhì)分解代謝
6、肝臟Zbtb18通過FXR介導(dǎo)的CLTC蛋白表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化
越來越多的證據(jù)表明，肝細(xì)胞脂質(zhì)失衡通常會(huì)引發(fā)并促進(jìn)肝臟炎癥，進(jìn)而加重NAFLD的進(jìn)展。為了全面探討Zbtb18對(duì)NAFLD發(fā)展的影響，作者還研究了NLRP3炎癥小體的組裝和活化的變化，在肝臟Zbtb18獲得或丟失模型中，NLRP3炎癥小體在肝臟炎癥中起關(guān)鍵作用。肝臟Zbtb18缺失顯著增強(qiáng)了HFD誘導(dǎo)的炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括NLRP3, ASC和Caspase-1。這些作用被肝臟Zbtb18過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)（圖6a, b）。作者的結(jié)果表明，肝臟Zbtb18對(duì)NLRP3介導(dǎo)的炎癥小體激活具有抑制作用，這也在AAV-Zbtb18感染的db/db小鼠中得到了驗(yàn)證（圖6c）。隨后，作者對(duì)Ad-Zbtb18感染的肝細(xì)胞上清液進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以揭示參與肝細(xì)胞Zbtb18驅(qū)動(dòng)的炎癥抑制的關(guān)鍵遞質(zhì)。隨后對(duì)使用上述培養(yǎng)基處理的巨噬細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一假設(shè)，實(shí)驗(yàn)顯示在Ad-Zbtb18感染的肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，炎癥小體的活性受到抑制（圖6d）。有趣的是，在Zbtb18缺失的小鼠中，FXR缺失有效地消除了Zbtb18對(duì)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的抑制，而FXR過表達(dá)有效地阻斷了NLRP3炎癥小體的異常激活（圖6e-f）。在肝細(xì)胞中敲除CLTC可有效減弱Zbtb18條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的抑制作用（圖6g-h）。綜上所述，這些結(jié)果表明肝臟Zbtb18的表達(dá)通過FXR介導(dǎo)的CLTC蛋白表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化，從而幫助減輕小鼠NAFLD。
圖6 肝臟Zbtb18蛋白通過FXR介導(dǎo)的CLTC蛋白表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化
7、FXR活性有效地介導(dǎo)了Zbtb18誘導(dǎo)的肝脂肪變性的減輕
與上述結(jié)果一致，作者通過尾靜脈注射AAV-Zbtb18到FXR缺失的小鼠體內(nèi)來測(cè)試FXR在介導(dǎo)Zbtb18驅(qū)動(dòng)的有益效應(yīng)中的生理功能。因此，作者發(fā)現(xiàn)FXR缺失幾乎消除了Zbtb18誘導(dǎo)的體重和脂肪量減少，HFD小鼠的能量消耗發(fā)生了罕見的變化（圖7a, b）。此外，注射AAV-Zbtb18后，FXR缺失小鼠的血清酮體水平幾乎沒有變化（圖7c）。此外，肝臟Zbtb18過表達(dá)未能改變與FAO相關(guān)的肝臟基因的表達(dá)（圖7d）。這導(dǎo)致AAV-Zbtb18感染的FXR敲除小鼠的血清和肝臟中的TGs含量不變，同時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)的氣球樣變和脂滴積聚不變（圖7e, f）。同樣，FXR缺失消除了Zbtb18過表達(dá)后空腹血糖和血清胰島素水平的下降（圖7g）。此外，AAV-Zbtb18感染的FXR缺陷小鼠的葡萄糖耐量和胰島素抵抗無變化（圖7h）。這些結(jié)果表明，FXR在Zbtb18誘導(dǎo)的肝臟葡萄糖紊亂保護(hù)作用中起關(guān)鍵作用。值得注意的是，在FXR缺失的小鼠中沒有觀察到Zbtb18誘導(dǎo)的肝臟中AKT和GSK-3β磷酸化的增加（圖7i）。此外，在AAV-Zbtb18感染小鼠和AAV-Gfp感染小鼠之間，由于FXR缺失，未檢測(cè)到肝臟生糖基因（如Pgc-1α和Pepck）的表達(dá)有差異（圖7j）。Zbtb18同樣不能降低FXR缺陷小鼠的血清炎性細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β，以及ALT和AST水平（圖7k -1）。
圖7 FXR消融減弱了Zbtb18誘導(dǎo)的對(duì)脂肪性肝炎的保護(hù)作用。
相反，FXR的強(qiáng)制表達(dá)有效地增加了其靶基因在肝Zbtb18LKO小鼠肝臟中的表達(dá)（圖8a）。由于FXR的表達(dá)，這些小鼠的脂肪量減少，能量消耗增加（圖8b, c）。相應(yīng)地，Zbtb18LKO小鼠肝臟重量/體重比值、血清酮體水平和TGs含量的變化由于FXR的恢復(fù)激活而逆轉(zhuǎn)，同時(shí)這些小鼠中涉及fao的肝臟基因表達(dá)和肝臟脂肪變性的改善，如肝細(xì)胞內(nèi)脂滴積聚導(dǎo)致的氣球樣變減少（圖8d-f）。此外，FXR表達(dá)增加降低了Zbtb18LKO小鼠的空腹血糖和胰島素水平。此外，FXR表達(dá)的增加顯著減輕了Zbtb18缺失引起的肝臟葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗（圖8g, h）。在FXR過表達(dá)后，作者觀察到對(duì)肝臟中AKT和GSK-3β磷酸化的類似刺激作用，這表明Zbtb18LKO小鼠的肝臟胰島素信號(hào)活性得到挽救，并且參與糖生成的基因得到有益的調(diào)節(jié)（圖8i, j）。值得注意的是，強(qiáng)制肝臟FXR表達(dá)有效減輕了Zbtb18缺陷刺激的CD11b+和F4/80+巨噬細(xì)胞在肝臟中的聚集，從而減輕了炎癥應(yīng)激，最終促進(jìn)了這些小鼠NAFLD的改善（圖8k-m）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明了Zbtb18介導(dǎo)的FXR轉(zhuǎn)錄激活在維持肝臟糖脂穩(wěn)態(tài)方面的潛在工作機(jī)制。
圖8 肝臟FXR強(qiáng)制表達(dá)減輕肝臟Zbtb18缺失小鼠的NAFLD表型
8、肝臟Zbtb18蛋白通過轉(zhuǎn)錄激活FXR保護(hù)MCD誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化
越來越多的證據(jù)表明，肝臟內(nèi)脂質(zhì)的長期異常積累會(huì)導(dǎo)致纖維結(jié)締組織的過度沉積以及肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，從而促進(jìn)NASH進(jìn)展?？紤]到Zbtb18在減少肝臟脂質(zhì)沉積方面的明顯作用，作者懷疑Zbtb18可能對(duì)肝纖維化具有顯著的保護(hù)作用。接下來，作者用MCD飲食喂養(yǎng)Zbtb18LKO小鼠，以證明Zbtb18在MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展中的生理功能。正如預(yù)期的那樣，與同窩對(duì)照小鼠不同，在MCD飲食暴露后，Zbtb18LKO小鼠的ALT和AST水平升高（圖9a），這表明這些小鼠發(fā)生了重度肝損傷和肝細(xì)胞死亡。此外，在MCD飲食喂養(yǎng)后，Zbtb18缺失導(dǎo)致TGs水平和肝臟脂質(zhì)沉積均加重，如脂滴積累和隨后的肝細(xì)胞氣球樣變所示（圖9b, c）。此外，作者的天狼星紅染色分析表明，在Zbtb18消融的肝臟小鼠中，MCD飲食誘導(dǎo)的致死性實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外周纖維化的發(fā)生促進(jìn)了α-SMA染色水平的急性升高（圖9d）。相應(yīng)的，MCD飲食誘導(dǎo)的與肝纖維化發(fā)展相關(guān)的肝基因表達(dá)（包括α-SMA、Col1a1和TGF-β）也在肝Zbtb18LKO小鼠中受到刺激，同時(shí)FXR及其靶基因的表達(dá)受損（圖9e、f）。此外，肝臟Zbtb18缺失加劇了MCD飲食誘導(dǎo)的肝臟炎癥應(yīng)激，如炎癥基因（如F4/80和TNF-α）的上調(diào)，血清炎癥細(xì)胞因子水平的升高，以及肝臟中F4/80+和CD11b+巨噬細(xì)胞的聚集增加（圖9e, g, h）。所有這些事件都會(huì)導(dǎo)致脂肪性肝炎的快速發(fā)展。
圖9 肝臟Zbtb18缺失加重MCD誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)展
相比之下，如正常血清ALT和AST水平與同窩對(duì)照組小鼠相比所示，肝臟Zbtb18過表達(dá)保護(hù)小鼠免受MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化（圖10a）。此外，通過HE染色和油紅O染色分析顯示，Zbtb18過表達(dá)有效改善了MCD飲食刺激的TGs升高和肝臟脂肪沉積（圖10b, c）。Sirius染色和α-SMA免疫組化分析一致表明，在肝臟Zbtb18過表達(dá)的小鼠中，即使喂食MCD飲食，實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外周纖維化的發(fā)展也受到了部分阻礙（圖10d）。與此同時(shí)，密切相關(guān)的基因（包括α-SMA、Col1a1和TGF-β）表達(dá)減少（圖10e）。此外，肝臟Zbtb18過表達(dá)抑制了MCD飲食誘導(dǎo)的肝臟炎癥基因F4/80、TNF-α、CXCL1和CXCL10，從而降低炎癥細(xì)胞因子的血清水平和肝臟炎癥細(xì)胞的浸潤，有助于改善脂肪性肝炎（圖10e-g）。
圖10 肝臟Zbtb18過表達(dá)對(duì)MCD誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有保護(hù)作用
總之，這些發(fā)現(xiàn)提示肝臟Zbtb18在防御脂肪性肝炎方面具有潛在的治療作用，其部分機(jī)制是通過激活FXR及其下游靶基因（圖11）。
圖11 Zbtb18通過轉(zhuǎn)錄激活FXR介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)代謝，抑制NLRP3炎癥小體的活性，減輕炎癥應(yīng)激和胰島素抵抗
結(jié)論：
綜上所述，作者證明了肝臟Zbtb18可以通過直接結(jié)合FXR啟動(dòng)子區(qū)的AACTCTCT元件來增加FXR mRNA和蛋白的表達(dá)。反過來，FXR可以刺激其靶基因加速FAO，從而阻止NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。此外，Zbtb18/FXR軸刺激的CLTC蛋白顯著減輕肝臟炎癥浸潤和纖維化。因此，Zbtb18/FXR軸是一個(gè)新的治療NAFLD和NASH的候選靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法：
臨床組織制備；動(dòng)物和治療；組織學(xué)分析、免疫熒光分析和脂滴染色；脂肪酸氧化檢測(cè)；耐量試驗(yàn)；代謝籠和MRI；ELISA和TGs和TCs檢測(cè)；熒光素酶報(bào)告基因法；染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析；RNA測(cè)序；CHIP測(cè)序和發(fā)現(xiàn)峰；Western blot；實(shí)時(shí)定量PCR；細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理。
參考文獻(xiàn)：
Zhang L, Chen J, Yang X, Shen C, Huang J, Zhang D, Liu N, Liu C, Zhong Y, Chen Y, Tang K, Guo J, Cui T, Duan S, Li J, Huang S, Pan H, Zhang H, Tang X, Chang Y, Gao Y. Hepatic Zbtb18 (Zinc Finger and BTB Domain Containing 18) alleviates hepatic steatohepatitis via FXR (Farnesoid X Receptor). Signal Transduct Target Ther. 2024 Jan 24;9(1):20. doi: 10.1038/s41392-023-01727-7. PMID: 38263084; PMCID: PMC10806020.