METTL1 通過(guò)前列腺癌中 tRNA 衍生的片段生物發(fā)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生

前列腺癌（Prostate cancer， PCa）是全球第二大最常診斷的癌癥，也是男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。常規(guī)療法針對(duì)疾病的雄激素相關(guān)信號(hào)通路。然而，高達(dá)30%的患者最終對(duì)治療和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生耐藥性，其治療選擇有限。隨著最近大規(guī)模腫瘤樣本平行測(cè)序的出現(xiàn)，分子分析工作揭示了高度多樣化的基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀，凸顯了識(shí)別具有治療潛力的替代改變和靶向分子通路的必要性。RNA 修飾在轉(zhuǎn)移 RNA （tRNA） 中普遍存在。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明，tRNA及其修飾酶的失調(diào)也與腫瘤發(fā)生有關(guān)。N7-甲基鳥(niǎo)苷（M7G）是真核生物中最普遍的tRNA修飾之一，存在于幾種tRNA物種的可變環(huán)區(qū)。在人類中，m7G由甲基轉(zhuǎn)移酶1（Methyltransferase1，METTL1）和WDR4形成的復(fù)合物催化。 從功能上講，m7G修飾的tRNA選擇性地調(diào)節(jié)特定轉(zhuǎn)錄本的翻譯。 在病理水平上，METTL1表達(dá)增加與幾種癌癥類型的腫瘤侵襲性有關(guān)。這些觀察結(jié)果表明了tRNA修飾在癌癥發(fā)展中的關(guān)鍵功能，并表明靶向癌癥中異常的轉(zhuǎn)錄后修飾可能有望成為有效的治療靶點(diǎn)。該文章于2023年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：37.3

技術(shù)路線： 

研究結(jié)果：

1.METTL1 在人和PCa小鼠 中升高

為了研究RNA修飾在PCa腫瘤發(fā)生中的潛在作用，我們采用了一種確保選擇與PCa腫瘤發(fā)生相關(guān)的RNA修飾的方法。我們?cè)谖屙?xiàng)PCa研究的數(shù)據(jù)集中鑒定132組帶注釋的RNAmodifying proteins (RMPs)的表達(dá)變化(圖1A)。此外，我們使用基因工程PCa小鼠模型將分析擴(kuò)展到小鼠PCa(圖1A)。我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PCa中表達(dá)差異最大的基因是METTL1(圖1B;)。從原發(fā)性到轉(zhuǎn)移性人類腫瘤，METTL1表達(dá)持續(xù)增加(圖1C)，分析發(fā)現(xiàn)METTL1高表達(dá)的預(yù)后較差(圖1D)。我們還發(fā)現(xiàn)m7g RNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)控亞基WDR4的表達(dá)升高(圖1C)[30,31]，在其他癌癥中也過(guò)表達(dá)，然而，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)WDR4過(guò)表達(dá)是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(圖1D)。病人樣本證實(shí)了METTL1和WDR4蛋白表達(dá)的增加(圖1E)?；谇傲邢侔┠[瘤的激素依賴性，我們進(jìn)行了METTL1、WDR4和AR的表達(dá)分析，但METTL1、WDR4與AR的表達(dá)沒(méi)有明顯的相關(guān)性(圖1E)。為了證實(shí)METTL1和WDR4的表達(dá)是否與晚期腫瘤狀態(tài)相關(guān)，我們通過(guò)S6K的磷酸化狀態(tài)來(lái)測(cè)量PI3K通路的活性，在大約70%的晚期PCa患者中，S6K的磷酸化狀態(tài)發(fā)生了改變。我們發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4表達(dá)與PI3K通路激活增強(qiáng)呈正相關(guān)(圖1E)，表明METTL1和WDR4表達(dá)在晚期PCa腫瘤中升高

綜上所述，我們的結(jié)果表明，METTL1是PCa中改變的主要表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)節(jié)因子，其過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。

圖1. METTL1 在人和PCa小鼠 中升高

2.METTL1 表達(dá)受 AKT-mTOR 下游信號(hào)通路調(diào)控

接下來(lái)，我們?cè)噲D闡明前列腺癌中METTL1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。由于雄激素受體(AR)活性的增加是PCa的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，我們分析了通過(guò)受體和下游靶基因(如KLK3)的表達(dá)來(lái)測(cè)量的AR表達(dá)或活性的增加是否與PCa中METTL1的表達(dá)相關(guān)。在Grasso數(shù)據(jù)集中，我們觀察到METTL1與AR和KLK3之間幾乎存在顯著的直接相關(guān)性。在Taylor數(shù)據(jù)集中，我們發(fā)現(xiàn)了METTL1和AR之間的直接相關(guān)性，支持了這兩個(gè)因素之間潛在關(guān)系的概念。然而，在KLK3的情況下，我們沒(méi)有觀察到顯著的相關(guān)性。我們使用TGCA數(shù)據(jù)集的分析揭示了METTL1和KLK3之間的直接相關(guān)性。然而，有趣的是，在這個(gè)特定的數(shù)據(jù)集中，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)METTL1和AR之間的顯著相關(guān)性。由于我們發(fā)現(xiàn)與良性前列腺增生標(biāo)本相比，前列腺癌標(biāo)本中METTL1蛋白表達(dá)與磷酸化- s6k呈正相關(guān)(圖1E)，我們接下來(lái)分析了METTL1表達(dá)是否與PTEN表達(dá)相關(guān)，PTEN是PI3K/AKT/mTOR通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在大約70%的晚期前列腺癌患者中缺失[47]。分析的所有數(shù)據(jù)集均顯示METTL1與PTEN表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖2A)，表明PI3K-mTOR軸調(diào)控了PCa中METTL1的表達(dá)。使用PI3K (BKM-120抑制劑)、AKT (MK2206)、mTORC1(雷帕霉素)和mTORC1/2 (Torin)的小分子抑制劑進(jìn)一步解剖PI3K - mTORC1/2通路發(fā)現(xiàn)，AKT抑制降低了METTL1 mRNA的水平，mTOR抑制劑持續(xù)降低了METTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖2B-C)，表明METTL1的表達(dá)是通過(guò)mTOR信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的。接下來(lái)，我們研究了METTL1表達(dá)水平是否有助于確定pten缺失相關(guān)的患者生存率下降，這是具有臨床意義的，并在臨床局限性腫瘤患者中區(qū)分惰性和侵襲性疾病。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)高M(jìn)ETTL1表達(dá)突出了pten -低患者預(yù)后不良的子集(圖2D)。為了確定前列腺癌中METTL1的上調(diào)是否是PTEN表達(dá)低或缺失的直接后果，我們分析了野生型(WT)小鼠和Probasine-Cre x Ptenflox/flox小鼠(以下簡(jiǎn)稱PTEN - ko)前列腺組織中METTL1 mRNA和蛋白水平，這些小鼠在前列腺上皮中有條件地缺失PTEN。這些小鼠在12周后發(fā)生高級(jí)別癌前病變，在5個(gè)月大后發(fā)展為浸潤(rùn)性腺癌。我們觀察到Pten缺失后Mettl1的表達(dá)逐漸增加(圖2E-G)。有趣的是，來(lái)自小鼠前列腺的trna腫瘤組織和尿液中提取的tRNA中m7g的沉積明顯增加(圖2H-K)。免疫組織化學(xué)分析進(jìn)一步顯示，Mettl1在小鼠PCa中的表達(dá)更高，在最常見(jiàn)的上皮細(xì)胞類型管腔細(xì)胞中也有高表達(dá)，被普遍認(rèn)為是人類前列腺癌的首選起源細(xì)胞(圖2L)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明METTL1是mTORC1通路的下游效應(yīng)物，其激活可誘導(dǎo)METTL1在PCa中的表達(dá)增加。

圖2. METTL1 表達(dá)受 AKT-mTOR 下游信號(hào)通路調(diào)控

3.METTL1 介導(dǎo)tRNA甲基化 

為了了解METTL1在PCa腫瘤發(fā)生中的作用，我們通過(guò)結(jié)合兩種轉(zhuǎn)錄組范圍的方法確定了METTL1 RNA底物。為了鑒定PCa細(xì)胞中mettl1特異性RNA靶點(diǎn)，我們使用了光活化核糖核苷增強(qiáng)交聯(lián)免疫沉淀(PAR-CLIP)，這是一種嚴(yán)格的技術(shù)，將光反應(yīng)性核糖核苷類似物納入新生RNA中，通過(guò)紫外線交聯(lián)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和RNA之間的共價(jià)鍵，然后進(jìn)行下一代測(cè)序。以空載體感染多西環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞為對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照樣本結(jié)合的RNA相比，t與對(duì)照樣品相比，我們沒(méi)有觀察到HA-METTL1樣品上結(jié)合的其他RNA物種的富集(圖3A)。接下來(lái)，為了精確定位trna中的m7g，我們使用CRISPR/Cas9敲除PCa細(xì)胞系PC3中的METTL1(圖3B)。使用抗m7g抗體的North-dot blot分析和質(zhì)譜分析證實(shí)了METTL1 KO細(xì)胞trna中m7g的缺失(圖3B-C)。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了先前報(bào)道的鳥(niǎo)苷46可變環(huán)的強(qiáng)大甲基化(圖3D)。我們鑒定出大約50%的同型受體為METTL1底物(圖3E, G)。綜上所述，我們的分析證實(shí)了METTL1優(yōu)先甲基化PCa細(xì)胞中可變環(huán)上的trna。

圖3. METTL1 介導(dǎo)tRNA甲基化 

4.METTL1介導(dǎo)的甲基化可保護(hù)tRNA免于裂解成小的非編碼RNA

在酵母和人類中，當(dāng)m7g甲基化降低時(shí)，trna的穩(wěn)定性會(huì)降低。為了確定METTL1缺失可能會(huì)擾亂PCa細(xì)胞中單個(gè)METTL1靶向trna的水平，我們對(duì)從PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞中分離的trna進(jìn)行了高通量測(cè)序。與之前的研究結(jié)果相反，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明mettl1特異性甲基化的缺失會(huì)降低特異性成熟tRNA同受體的豐度(圖4A)。最近的報(bào)道表明，tRNA修飾保護(hù)或誘導(dǎo)tRNA切割成抑制性小ncrna。我們分析了來(lái)自PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞的小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，以尋找tRNA片段(trf)的主要類別的差異，包括5 ' /3 '衍生的trf (5 ' trf和3 ' trf)、5 ' tRNA一半和內(nèi)部trf (int-tRF)。有趣的是，我們?cè)赑C3 METTL1 KO細(xì)胞中檢測(cè)到一致的5’trna片段富集(圖4B)。然而，與WT細(xì)胞相比，大多數(shù)METTL1 KO細(xì)胞的富集程度適度增加(圖4C)。我們的分析顯示，與WT細(xì)胞相比，在所有5'tRNA片段中，一個(gè)特定的類別，即5 '末端低鳥(niǎo)嘌呤tRNA片段(5'TOGs)，在KO細(xì)胞中顯著過(guò)度代表(log2 FC>2, p值<0.05)(圖4B和C)。5 ' togs長(zhǎng)約20或30個(gè)核苷酸，主要來(lái)源于mettl1靶tRNA Cys(產(chǎn)生含有5 ' togs的5個(gè)末端鳥(niǎo)嘌呤(5G))和Ala(產(chǎn)生含有5 ' togs的4G)的裂解(圖4D和E)。Northern blotting證實(shí)，與WT細(xì)胞相比，PC3 METTL1 KO細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)立克隆中cys衍生的5 ' trf的積累較弱，但明顯較高(圖4F)。在PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞中，METTL1下調(diào)時(shí)觀察到5'tRFs，表明5'tRFs的形成與PTEN、p53和AR狀態(tài)無(wú)關(guān)(圖4F)。證據(jù)表明，一小部分tRNA切割成tRNA衍生的ncrna是對(duì)應(yīng)激的保守反應(yīng)，tRNA修飾保護(hù)它們免受應(yīng)激誘導(dǎo)的切割。在應(yīng)激反應(yīng)中，tRNA切割在METTL1 KO細(xì)胞中比在WT細(xì)胞中更為突出，早在氧化應(yīng)激暴露2小時(shí)達(dá)到峰值，在應(yīng)激刺激8小時(shí)后下降，可能是因?yàn)闊o(wú)法解決應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加(圖4G, H)。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，mettl1介導(dǎo)的甲基化是一種保守的機(jī)制，它調(diào)節(jié)了PCa細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中源自5’trna片段的一類新型小ncrna的生物發(fā)生，而不管它們的遺傳狀態(tài)如何。

圖4. METTL1介導(dǎo)的甲基化可保護(hù)tRNA免于裂解成小的非編碼RNA

5.METTL1 的缺失通過(guò) tRNA 片段生物發(fā)生抑制翻譯起始

由于已知5'TOGs抑制全局翻譯，我們接下來(lái)研究了5'TOGs的積累是否導(dǎo)致了PC3 mettl1缺失細(xì)胞的翻譯改變。我們證實(shí)，與WT細(xì)胞相比，METTL1 KO細(xì)胞中通過(guò)o -丙基嘌呤霉素(OP-puro)摻入測(cè)量的蛋白質(zhì)翻譯減少(圖5A)。蛋白質(zhì)合成速率的變化與翻譯起始復(fù)合物組分的表達(dá)變化或eIF2α的磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中5’trna片段的產(chǎn)生在應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這一過(guò)程有助于抑制整體蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞能夠恢復(fù)并在應(yīng)激條件下存活[66]。為了確定METTL1的去除是否會(huì)影響應(yīng)激反應(yīng)，我們測(cè)量了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)合成速率。我們的分析表明，與WT細(xì)胞相比，METTL1缺陷細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成回收率降低，這表明METTL1 KO細(xì)胞對(duì)應(yīng)激更敏感(Supplementary Fig. S5B)。這一發(fā)現(xiàn)表明m7g的缺失顯著抑制了蛋白合成，并且這一過(guò)程與eIF2α磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。接下來(lái)，我們?cè)噲D確定METTL1 KO細(xì)胞獨(dú)特的翻譯抑制及其對(duì)5'TOGs的依賴的分子基礎(chǔ)。先前的證據(jù)表明，5'TOGs通過(guò)取代mrna帽上的翻譯起始復(fù)合物eIF4A/G/E和調(diào)控因子YB1和PABP1的組分而損害翻譯起始。為了確定翻譯起始因子是否從PC3 METTL1 KO細(xì)胞中7-甲基-鳥(niǎo)苷化(m7g)覆蓋的mrna中轉(zhuǎn)移，我們分析了翻譯起始因子對(duì)m7g -帽包被的sepharose beads的親和力。我們發(fā)現(xiàn)，與WT細(xì)胞相比，METTL1 KO細(xì)胞中eIF4G和PABP1的m7 g -cap親和力顯著降低(圖5B)。這表明，5'TOGs積累的增加破壞了翻譯起始復(fù)合物某些因子的組裝和結(jié)合的穩(wěn)定性，導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中的翻譯受到抑制。我們進(jìn)一步評(píng)估了在WT細(xì)胞中表達(dá)的合成5'TOG是否能夠結(jié)合翻譯起始因子和調(diào)節(jié)因子，以及它們對(duì)這些因子的親和力是否可以通過(guò)合成的逆補(bǔ)體5'TOG rna(或抗tog)來(lái)阻斷。為此，我們用5 '生物素化的5'TOG rna(包含PC3 METTL1 KO細(xì)胞中最豐富的5'TOG序列)轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞，并添加或不添加抗tog。在去除5 '生物素化-5 ' togs后，我們發(fā)現(xiàn)在抗togs存在下，PABP1和YB1對(duì)5'TOG的親和力顯著降低(圖5C)。接下來(lái)，我們研究了人工合成的5'TOGs是否可以在WT細(xì)胞中表型化翻譯起始復(fù)合物的位移，以及抗tog rna是否可以在METTL1 KO細(xì)胞中挽救這種觀察到的效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染5'TOGS的WT細(xì)胞中，PAPB1與m7 g -cap的結(jié)合被取代，但在轉(zhuǎn)染抗tog rna的METTL1 KO細(xì)胞中，PAPB1與m7 g -cap的親和力顯著增加(圖5D)。總的來(lái)說(shuō)，這表明5'TOGs的形成通過(guò)取代PAPB1來(lái)抑制蛋白質(zhì)翻譯。有趣的是，PAPB1先前已被證明對(duì)其他細(xì)胞類型中的5'TOGs具有很強(qiáng)的親和力。因此，我們的研究結(jié)果證實(shí)，METTL1 KO細(xì)胞中表達(dá)的5'TOGs可以取代mRNA帽上的翻譯調(diào)節(jié)因子，并為METTL1介導(dǎo)的翻譯抑制的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵見(jiàn)解。

圖5. METTL1 的缺失通過(guò) tRNA 片段生物發(fā)生抑制翻譯起始

5.METTL1下調(diào)可抑制前列腺腫瘤在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)

鑒于METTL1 KO細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)較少，我們假設(shè)METTL1抑制可以降低細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)。事實(shí)上，我們觀察到METTL1的敲低會(huì)損害PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5E)。METTL1下調(diào)還會(huì)減少細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，增加細(xì)胞凋亡，損害球體形成能力，并顯著降低腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)和增殖(圖5f - I)。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，下調(diào)METTL1可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，有力地支持METTL1在調(diào)節(jié)PCa進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。接下來(lái)，我們研究了METTL1甲基化酶活性是否足以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。我們?cè)赑C3 METTL1 KO細(xì)胞中重新表達(dá)了野生型METTL1 (WT)和催化死亡突變體(AFPA)(圖5J-L)。與用空載體(eV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的KO細(xì)胞相比，重新表達(dá)WT METTL1的KO細(xì)胞的增殖和球體形成能力增強(qiáng)。相比之下，無(wú)催化活性突變體的表達(dá)未能促進(jìn)METTL1 KO細(xì)胞生長(zhǎng)和球體形成能力(圖5M-N)。由于METTL1的催化活性得到了與調(diào)控亞基WDR4形成復(fù)合物的支持，并且WDR4在PCa中過(guò)表達(dá)(圖1C, E)，綜上所述，這些結(jié)果表明METTL1以酶活性依賴的方式促進(jìn)PCa細(xì)胞的生長(zhǎng)，但不依賴于WDR4。為了進(jìn)一步確定5'TOG是否足以誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯和凋亡，我們用5'TOG轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞，用抗tog轉(zhuǎn)染METTL1 KO細(xì)胞，并測(cè)量細(xì)胞凋亡和增殖。我們檢測(cè)到WT細(xì)胞轉(zhuǎn)染5’tog rna后，凋亡顯著增加，增殖顯著減少，而METTL1 KO細(xì)胞轉(zhuǎn)染antiTOGs后，凋亡雖不顯著減少，但增殖顯著增加(圖5O,P)?？傊覀兊臄?shù)據(jù)表明，METTL1失活和5'TOGs是誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯所必需的，重新表達(dá)催化活性版本的METTL1和抗togs可以部分修復(fù)METTL1 KO細(xì)胞中觀察到的缺陷。

6.METTL1 缺失激活 IFN 信號(hào)通路

鑒于翻譯受到METTL1抑制的影響，我們探討了METTL1缺失對(duì)翻譯體即刻變化的影響。為此，我們利用OP-puro特性來(lái)標(biāo)記新生蛋白，隨后將其偶聯(lián)到生物素包被的微球上，然后進(jìn)行微球上的消化和LC-MS /MS(圖6A)。基因本體(GO)術(shù)語(yǔ)富集分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞分裂和有絲分裂相關(guān)的基因翻譯減少，證實(shí)了觀察到的METTL1 KO細(xì)胞增殖缺陷(圖6)。出乎意料的是，我們還發(fā)現(xiàn)METTL1 KO細(xì)胞中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本翻譯增加，包括I型和II型干擾素(IFN)信號(hào)通路、免疫效應(yīng)過(guò)程和分解代謝過(guò)程(圖6B)。翻譯的差異反映在PC3 METTL1 KO細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)組組成中，但與RNA表達(dá)水平無(wú)關(guān)，這表明轉(zhuǎn)錄后或翻譯調(diào)控是導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中不相關(guān)的RNA -蛋白表達(dá)水平的原因(圖6C)。為了進(jìn)一步測(cè)試METTL1 KO細(xì)胞中某些轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率是否存在差異，我們進(jìn)行了多體分析。這種方法使我們能夠確認(rèn)METTL1 KO細(xì)胞中活性多體的形成減少，同時(shí)整體蛋白合成減少(圖6D)。對(duì)METTL1 KO細(xì)胞多體部分mRNA富集的分析顯示，與干擾素信號(hào)相關(guān)的特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯增加，如干擾素調(diào)節(jié)因子9 (IRF9)和干擾素刺激基因15 (ISG15)(圖6D)。作為翻譯變化特異性的對(duì)照，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在METTL1 KO細(xì)胞的多體部分中富集GAPDH、Catenin β、KIF20A或STAT1等轉(zhuǎn)錄本(圖6D)。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，mettl1介導(dǎo)的tRNA甲基化引導(dǎo)著一個(gè)獨(dú)特的翻譯程序。由于5'TOGs可以重新編程翻譯機(jī)制，以支持癌細(xì)胞所需的翻譯程序，我們接下來(lái)研究了METTL1 KO細(xì)胞中的翻譯變化是否由5'TOGs的生物發(fā)生增加介導(dǎo)。為此，我們用5'TOG和抗tog rna轉(zhuǎn)導(dǎo)PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞，并評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。我們發(fā)現(xiàn)，WT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染5'TOGs增加了IRF9和ISG15蛋白的表達(dá)，而在METTL1 KO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染抗tog rna輕微但顯著地降低了這兩種蛋白的表達(dá)(圖6E)。我們還觀察到METTL1 KO細(xì)胞和異種移植物中STAT1的蛋白表達(dá)和磷酸化增加(圖6E)，但其表達(dá)的增加與翻譯的增加無(wú)關(guān)(圖6D)，而是轉(zhuǎn)錄依賴的，這表明STAT1表達(dá)的增加是由METTL1 KO細(xì)胞中IFN信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)的。事實(shí)上，其他干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄也在METTL1敲除細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄激活。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，mettl1介導(dǎo)的tRNA甲基化和tRNA片段生物發(fā)生誘導(dǎo)了激活I(lǐng)FN信號(hào)通路的翻譯程序。為了證實(shí)METTL1的高表達(dá)與人類PCa樣本中IFN通路活性的降低相關(guān)。

圖6.METTL1 缺失激活 IFN 信號(hào)通路

7.PCa 中 METTL1 表達(dá)低與促炎免疫細(xì)胞極化增加相關(guān)

最近，表觀遺傳靶向治療已被證明可以在幾種癌癥類型中觸發(fā)IFN抗病毒反應(yīng)，包括PCa，引發(fā)先天免疫反應(yīng)并導(dǎo)致許多細(xì)胞因子的產(chǎn)生[74-77]。為了闡明METTL1抑制是否可以通過(guò)激活I(lǐng)FN信號(hào)通路引發(fā)先天免疫反應(yīng)，我們研究了METTL1下調(diào)是否會(huì)改變PCa細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。總體而言，在METTL1 KO細(xì)胞中，細(xì)胞因子組成分析顯示，參與促炎活性的細(xì)胞因子分泌增加，并使巨噬細(xì)胞極化為m1樣內(nèi)型[78]，包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子α (TNF-α)(圖7A)。METTL1的去除也誘導(dǎo)了抗炎細(xì)胞因子的下調(diào)，包括巨噬細(xì)胞或集落刺激因子(M-CSF)、IL10和IL13(圖7A)，可使巨噬細(xì)胞極化為m2樣內(nèi)型。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞中METTL1的抑制可以使腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞向細(xì)胞毒性殺瘤內(nèi)型分化。我們用PC3 WT或METTL1 KO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(cm)培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP1，并研究了m1樣和m2樣巨噬細(xì)胞內(nèi)源性標(biāo)記物的表達(dá)(圖7B)。此外，PC3 METTL1 KO細(xì)胞cm存在下培養(yǎng)的外周血巨噬細(xì)胞對(duì)CD3+T細(xì)胞的增殖和遷移具有更高的誘導(dǎo)作用(圖7C, D)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，METTL1在癌細(xì)胞中的抑制可能會(huì)刺激TME的細(xì)胞毒性和抗腫瘤炎癥反應(yīng)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)，我們使用免疫組織化學(xué)分析評(píng)估了人類前列腺腫瘤的腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞組成。分析表明，在PCa石蠟樣品中，m2樣巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與METTL1表達(dá)之間存在顯著的直接相關(guān)，但m1樣巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈相反趨勢(shì)。同樣，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與METTL1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7E)。Pten-KO小鼠前列腺上皮中Mettl1雜合缺失(Pten-KO/Mettl1+/-)和Mettl1條件缺失(Pten-KO/ mett1flox /flox)導(dǎo)致腹側(cè)和前葉腫瘤體積顯著減少，Pten-KO/Mettl1+/+小鼠的腫瘤體積始終較大(圖7F)?；谶@些觀察結(jié)果和mettl1缺陷細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)的能力，其特征是誘導(dǎo)m1樣巨噬細(xì)胞極化，以及體外CD8+T細(xì)胞的增殖和遷移增強(qiáng)(圖7AD)。為了闡明Mettl1抑制對(duì)免疫腫瘤組成重編程的影響，我們分析了免疫調(diào)節(jié)分子，包括細(xì)胞因子和趨化因子，作為腫瘤中存在的免疫細(xì)胞的替代標(biāo)記物。我們的研究結(jié)果揭示了細(xì)胞因子組成的顯著變化，其特征是促腫瘤細(xì)胞因子的分泌減少。此外，我們觀察到在Pten-KO/ mettt1fl /fl腫瘤中，已知與免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)治療有利應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子分泌增加(圖7H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，抑制Mettl1可能有助于改善ICB治療結(jié)果的免疫微環(huán)境，突出了靶向Mettl1作為增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的治療策略的潛力。為了確定mett1缺陷腫瘤的腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子組成是否可以增強(qiáng)ICB治療的療效，我們用抗pd1和抗ctl4a抗體治療小鼠。與未治療的小鼠相比，Pten-KO/Mettl1+/+小鼠在ICB治療后未顯示腫瘤體積減少，而Pten-KO/ mett1flox /flox小鼠在ICB治療后腫瘤體積顯著減少(圖7I)。我們還研究了METTL1表達(dá)水平是否可以預(yù)測(cè)患者ICB治療的療效。使用ROC繪圖儀平臺(tái)，我們分析了抗pd1治療的幾種腫瘤類型中METTL1的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，對(duì)ICB治療有反應(yīng)的METTL1表達(dá)低于無(wú)反應(yīng)的METTL1表達(dá)，這表明高M(jìn)ETTL1表達(dá)預(yù)示著對(duì)ICB治療的不良反應(yīng)(圖7J)?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，METTL1的表達(dá)水平可以決定腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性免疫浸潤(rùn)和ICB治療的成功。

圖7.PCa 中 METTL1 表達(dá)低與促炎免疫細(xì)胞極化增加相關(guān)

 結(jié)論：

本研究表明，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移RNA N7 -甲基鳥(niǎo)苷(m7g)轉(zhuǎn)移酶METTL1在原發(fā)性和晚期前列腺腫瘤中高度表達(dá)。從機(jī)制上講，我們發(fā)現(xiàn)METTL1缺失導(dǎo)致m7 G tRNA甲基化缺失，并促進(jìn)了一類來(lái)自5'tRNA片段的新型小非編碼rna的生物發(fā)生。5 ' trna衍生的小rna引導(dǎo)翻譯控制，有利于腫瘤生長(zhǎng)抑制、干擾素途徑和免疫效應(yīng)器的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的合成。在前列腺癌臨床前模型中，Mettl1的敲低增加了促炎免疫細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)，增強(qiáng)了對(duì)免疫治療的反應(yīng)?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究結(jié)果揭示了mettl1導(dǎo)向的m7g tRNA甲基化在癌細(xì)胞翻譯控制和腫瘤生物學(xué)中的治療作用。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系建立、WB、RT-qPCR、免疫組化、免疫熒光、mRNA-seq、PAR-CLIP、PAR-CLIP analysis、AlkAniline-seq、tRNA-seq、tRNA-seq analysis、Northern blotting、帽結(jié)合試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

METTL1 promotes tumorigenesis through tRNA-derived fragment biogenesis in prostate cancer. Mol Cancer. 2023;22(1):119. Published 2023 Jul 29.