Hedgehog-Gli1誘導(dǎo)的外泌體circ0011536介導(dǎo)胰腺癌周圍神經(jīng)重構(gòu)

         Hedgehog-Gli1信號(hào)誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中兩種常見神經(jīng)特征的發(fā)展：外周神經(jīng)侵襲(PNI)和外周神經(jīng)重塑(PNR)。然而，Gli1衍生的背根神經(jīng)節(jié)（PNR）在癌細(xì)胞和神經(jīng)中的潛在分子機(jī)制尚未得到全面分析。我們首先通過外泌體circ-0011536和DRG之間的串?dāng)_確認(rèn)了PNR發(fā)生的分子機(jī)制。在Gli1過表達(dá)的PDAC中，circ-0011536主要由外泌體分泌。被DRG攝入后，通過降解miR-451a，上調(diào)VGF的表達(dá)，促進(jìn)DRG的活性。Gli1過表達(dá)可加速小鼠皮下腫瘤的增殖，與神經(jīng)叢密度密切相關(guān)，而circ-RNA下調(diào)可抑制腫瘤增殖，降低神經(jīng)叢密度。此外，TMA結(jié)果證實(shí)Gli1過表達(dá)可顯著增加VGF的表達(dá)，并與神經(jīng)叢密度增加密切相關(guān)。Hedgehog-Gli1誘導(dǎo)的外泌體circ-0011536通過miR-451a/VGF軸促進(jìn)PNR，從而確定它可能通過激活Hedgehog信號(hào)通路促進(jìn)PDAC相關(guān)的神經(jīng)變化。本文于2023年12月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）Gli1促進(jìn)PDAC細(xì)胞的增殖和侵襲

         為了研究Gli1上調(diào)是否促進(jìn)PDAC細(xì)胞系的腫瘤進(jìn)展，我們首先通過qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)了5種PDAC細(xì)胞系中Gli1的表達(dá)。與HPDE相比，至少有4個(gè)PDAC細(xì)胞系中Gli1表達(dá)上調(diào)，而Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)在CFPAC和PANC-1細(xì)胞中相對(duì)較低(補(bǔ)充圖)。為了進(jìn)一步研究Gli1在PDAC細(xì)胞進(jìn)展中的功能作用，我們?cè)?span>CFPAC和PANC-1細(xì)胞中構(gòu)建了Gli1慢病毒(lentii-Gli1)，并使用空病毒(EV-Gli1)作為對(duì)照。通過qPCR和Western blotting驗(yàn)證了Gli1在RNA和蛋白質(zhì)水平上過表達(dá)的影響(圖1A-C)。此外，我們使用CCK-8方法檢測(cè)Gli1表達(dá)上調(diào)對(duì)PDAC細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)Gli1組的細(xì)胞增殖率明顯高于空白對(duì)照組(圖1D)。Transwell法檢測(cè)Gli1在PDAC細(xì)胞侵襲能力中的作用。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，lenti-Gli1組通過底部聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量明顯高于EV-Gli1組，細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1E)。同樣，Western blot結(jié)果證實(shí)，與增殖和侵襲相關(guān)的基因Ki-67和E-cadherin也表現(xiàn)出與功能一致的趨勢(shì) (圖1F)。

2）Gli1誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞介導(dǎo)的DRG趨化

         為了進(jìn)一步表征觀察到的神經(jīng)元變化的潛在分子基礎(chǔ)，我們構(gòu)建了一個(gè)體外共培養(yǎng)模型，使用DRG細(xì)胞作為神經(jīng)元元件。提取小鼠DRG，構(gòu)建PDAC-DRG共培養(yǎng)模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與EV-Gli1對(duì)照組相比，lenti-Gli1組通過Transwell細(xì)胞的DRG細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖2A、B)。為了進(jìn)一步研究Gli1信號(hào)在神經(jīng)元可塑性中的功能作用，我們以NGF為對(duì)照，觀察DRG軸突延伸長(zhǎng)度。結(jié)果表明，lenti-Gli1組促進(jìn)PDAC細(xì)胞DRG軸突延伸，其作用類似于NGF的產(chǎn)生。以不含NGF的空血清(SF組)為對(duì)照(圖2C)。此外，Gli1過表達(dá)還能保護(hù)DRG免受血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。通過Annexin V/PI檢測(cè)，當(dāng)Gli1過表達(dá)的PDAC細(xì)胞與DRG共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)顯著降低(圖2D-F)。上述研究表明，在PDAC細(xì)胞中激活Gli1可以促進(jìn)DRG細(xì)胞趨化和軸突神經(jīng)伸展，同時(shí)避免饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3）Gli1通過PDAC誘導(dǎo)的外泌體作用于DRG

         提取上清液進(jìn)行外泌體分離，并通過透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析(NTA)分析和Western blotting對(duì)所得物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。電鏡觀察結(jié)果顯示，提取物呈碟狀透明，具有完整的囊泡膜結(jié)構(gòu)。NTA結(jié)果表明，提取的外泌體的體積主要為130 nm，與以往文獻(xiàn)一致，驗(yàn)證了胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1中外泌體的存在。Western blotting結(jié)果顯示外泌體標(biāo)記蛋白CD63和TSG101陽性 (圖3A-C)。為了確認(rèn)PDAC細(xì)胞衍生的外泌體是否可以轉(zhuǎn)移到DRG受體上，我們提取lenti-Gli1組和EV-Gli1組的外泌體，用PKH26染料標(biāo)記，過濾后加入到DRG，與DRG共培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示外泌體被聚焦在細(xì)胞周圍并被細(xì)胞吸收(圖3D)。同時(shí)，lenti-Gli1組的外泌體延長(zhǎng)了DRG的軸突延伸(圖3E, F)。這表明，對(duì)DRG的影響可能是由源自PDAC細(xì)胞的外泌體實(shí)現(xiàn)的。

4）攜帶傳輸信號(hào)的外泌體中circRNA的篩選和驗(yàn)證

         我們提取RNA并對(duì)過表達(dá)Gli1的CFPAC-1細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序。在鑒定的lncRNA、circRNA和microRNA中，circRNA存在顯著差異。我們鑒定出2621個(gè)差異表達(dá)基因，其中1530個(gè)表達(dá)上調(diào)，1091個(gè)表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，共篩選出18個(gè)與Neurotropin信號(hào)通路相關(guān)的circRNA，包括9個(gè)上調(diào)基因和9個(gè)下調(diào)基因(圖4A)。為了闡明潛在的機(jī)制，我們?cè)u(píng)估了9個(gè)上調(diào)基因的表達(dá)水平。hsa-circ-0011536的表達(dá)同步升高，差異顯著(圖4B-D)。同樣，我們用從Gli1過表達(dá)的細(xì)胞中提取的外泌體處理DRG并進(jìn)行測(cè)序。共鑒定出6718個(gè)上調(diào)基因和5578個(gè)下調(diào)基因。聚類后，發(fā)現(xiàn)59個(gè)基因參與了神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑(圖4E)。選擇前7個(gè)差異顯著的基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)。在lenti-Gli1處理的DRG細(xì)胞中，VGF被發(fā)現(xiàn)上調(diào)(圖4F)。這些發(fā)現(xiàn)表明外泌體可能攜帶circ-0011536并將其傳遞給DRG細(xì)胞，從而改變VGF并導(dǎo)致下游效應(yīng)。

5）攜帶circ-0011536的外泌體通過miR-451a作用于DRG細(xì)胞

         我們分別構(gòu)建了在EV-Gli1和lenti-Gli1 PDAC細(xì)胞中過表達(dá)和敲低hsa-circ-0011536的載體。在驗(yàn)證circRNA表達(dá)后，我們初步評(píng)估了VGF在DRG細(xì)胞中的表達(dá)，顯示出外分泌效應(yīng)。VGF的表達(dá)與circRNA的變化一致(圖5A)。此外，lenti-has-circ-0011536和lenti-Gli1 CFPAC-1細(xì)胞分泌的外泌體同樣促進(jìn)軸突伸長(zhǎng)(圖5B)。由于DRG和PDAC細(xì)胞來自不同的物種和屬，因此在DRG細(xì)胞中將has-circ-0011536轉(zhuǎn)化為同源基因mum -circ-0001261進(jìn)行檢測(cè)。序列比較分析表明，這兩個(gè)基因具有高度保守性。我們隨后在外泌體處理的DRG細(xì)胞中檢測(cè)了VGF mRNA和蛋白。Gli1和has-circ-0011536過表達(dá)的CFPAC-1細(xì)胞的分泌物顯示，mmu-circ-0001261和VGF的表達(dá)升高(圖5C, D)。我們使用熒光素酶測(cè)定mmu-circ-0001261與VGF的結(jié)合；結(jié)果未顯示直接結(jié)合，因此表明mmu-circ-0001261可能參與內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA的調(diào)控。ENCORI和Circineracoome數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了15個(gè)miRNA可能與mmucic-0001261互補(bǔ)，并且通過ENCORI、TargetScan、miRTarBase和miRDB預(yù)測(cè)了VGF上游的33個(gè)miRNA，經(jīng)過DRG驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者交集的3個(gè)常見miRNA (mmu-miR-423-5p、mmu-miR-451a、mmu-miR-6921-5P)高度保守且差異顯著(圖5E)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA的作用，我們構(gòu)建了過表達(dá)mmu-circ-0001261的DRG細(xì)胞模型來模擬lenti-Gli1外泌體的作用。添加miR-451a模擬物后，VGF mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(圖5F、G)。根據(jù)上述結(jié)果，我們初步確定PDAC細(xì)胞通過Gli1-circ-0011536-miR-451a-VGF通路作用并介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞變化。

6）Gli1衍生的外泌體circ-0011536通過miR-451a/VGF軸介導(dǎo)PNR

         我們構(gòu)建了VGF siRNA，并在DRG細(xì)胞中進(jìn)行了沉默驗(yàn)證，以確定最有效的siRNA(圖6A, B)。隨后，我們進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，miR-451a的過表達(dá)或VGF的沉默降低了VGF的mRNA和蛋白表達(dá)，也影響了DRGs的軸突延伸(圖6C-F)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明，mmic-0001261和miR-451a模擬治療抑制WT信號(hào)，而mmucic-0001261突變消除了miR-451a模擬的抑制作用。此外，miR-451a模擬物降低了DRG細(xì)胞中的VGF-WT熒光素酶報(bào)告信號(hào)，但對(duì)VGF-MUT載體沒有影響(圖6G)。我們的數(shù)據(jù)表明，在體外，在Gli1過表達(dá)的PDAC細(xì)胞中，外泌體攜帶的has-circ-0011536通過miR-451a/VGF軸調(diào)節(jié)DRG細(xì)胞的神經(jīng)元變化。

7）血漿外泌體中circ-0011536的水平是與PNR相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物

         為了確定circ-0011536在體內(nèi)的作用，我們使用EV-Gli1和lenti-Gli1 CFPAC-1建立小鼠皮下致瘤模型。然后，我們對(duì)lenti-Gli1小鼠進(jìn)行了circ-siRNA處理。首先，我們用蘇木精-伊紅染色和Ki-67染色來評(píng)估增殖水平，Ki-67核染色在lenti-Gli1組和陽性對(duì)照中較高。然而，在circ-siRNA處理后，在lenti-Gli1組織中觀察到Ki-67的表達(dá)顯著降低，從而表明在lenti-Gli1小鼠中具有抗增殖作用(圖7D, E)。此外，Gli1過表達(dá)的腫瘤生長(zhǎng)更快，而circ-siRNA處理后腫瘤生長(zhǎng)受到抑制(圖7A, B)。我們隨后通過PCR檢測(cè)腫瘤中Gli1和has-circ-0011536的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Gli1和circ-0011536的表達(dá)符合調(diào)控預(yù)期(圖7C)。腫瘤組織中mmu-circ-0001261的表達(dá)與神經(jīng)密度呈正相關(guān)。用siRNA處理的小鼠在腫瘤中顯示出明顯的神經(jīng)衰減(圖7F)。此外，在陽性對(duì)照組(PNST標(biāo)本)和lenti-Gli1組中，Gli1和PGP9.5的細(xì)胞質(zhì)染色均升高，而在circ-siRNA處理后，lenti-Gli1組織中幾乎沒有染色(圖7G)。雙免疫熒光染色結(jié)果顯示，Gli1過表達(dá)后神經(jīng)叢密度增加，但隨著circ-siRNA的下調(diào)而降低(圖7G, H)。PNR患者血漿外泌體中has-circ-0011536的表達(dá)顯著升高(圖7I)。最后，我們通過熒光三重染色TMA驗(yàn)證了Gli1與PNR之間的關(guān)系(圖7J)。結(jié)果證實(shí)Gli1表達(dá)與PNR密切相關(guān)，顯著增加VGF表達(dá)。上述結(jié)果提示circ-0011536可能在腫瘤中被Gli1上調(diào)，從而直接促進(jìn)腫瘤內(nèi)神經(jīng)密度的增加，從而作為預(yù)測(cè)胰腺癌PNR的生物標(biāo)志物。

結(jié)論：

         我們的研究表明外泌體circ0011536通過激活hedgehog-Gli1信號(hào)調(diào)節(jié)PDAC中的神經(jīng)改變。此外，我們的研究結(jié)果表明circ-0011536通過海綿化miR-451a促進(jìn)VGF的表達(dá)。外泌體和circRNA抗核酸酶的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使它們成為研究新的生物標(biāo)志物和生物學(xué)機(jī)制的極好的潛在工具。未來，胰腺癌與神經(jīng)細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需進(jìn)一步研究，為最終找到阻斷神經(jīng)侵襲通路的治療策略奠定理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         Western blotting，PCR，CCK-8，Transwell，Annexin?V/PI染色，外泌體分離，RNA測(cè)序，熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，免疫組化，免疫熒光。

參考文獻(xiàn)：

         Dai W, Wu X, Li J, Tang W, Wang Y, Xu W, Han D, Xu X, Xu X. Hedgehog-Gli1-derived exosomal circ-0011536 mediates peripheral neural remodeling in pancreatic cancer by modulating the miR-451a/VGF axis. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Dec 2;42(1):329. doi: 10.1186/s13046-023-02894-9.