單細胞RNA測序解析子宮肌腺病的病理機制

本研究旨在利用scRNA-seq評估子宮腺肌癥的細胞和分子狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮腺肌癥組織中的成纖維細胞具有高度異質(zhì)性。在子宮腺肌癥成纖維細胞中，WNT 信號涉及作為 WNTs 誘餌受體的分泌型相關(guān)蛋白的不同表達，這可能在該疾病的病理生理學中起著關(guān)鍵作用。本文于2023年5月發(fā)表在《Fertility and Sterility》IF:6.7雜志上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、子宮內(nèi)膜：一個包含成纖維細胞和免疫細胞群的豐富復雜細胞景觀

從患有子宮肌腺病需行子宮切除術(shù)的子宮中收集子宮肌腺癥病理組織（AD）和臨近的正常子宮內(nèi)膜組織（EE），以及正常的子宮肌層組織（NM）（圖1A）。scRNA測序在EE共鑒定到21個細胞簇注釋為12種細胞類型：纖毛上皮細胞和纖毛上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞樣細胞、活化成纖維細胞、周細胞、血管平滑肌細胞、NK細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、單核細胞和潛在祖細胞（圖1B）。每種細胞類型的前幾個標記物的表達見圖1C。無纖毛上皮細胞分為三組（E2、E17、E19），占子宮內(nèi)膜的11%。上皮細胞的典型標記包括EPCAM、PAEP、MMP7和KRT18。還發(fā)現(xiàn)了一個纖毛上皮細胞集群，它表達纖毛相關(guān)基因（C14），如RSPH1、AGR3 和PIFO；最近一項對正常子宮內(nèi)膜進行 scRNA-seq 的研究描述了這種細胞類型（圖 1B-D）。免疫細胞占子宮內(nèi)膜的 24%。主要的免疫細胞是表達NKG7和GNLY 的NK細胞（7%）和表達CD3D和CD69 的 T 細胞（12%）（圖 1B-D）。成纖維樣細胞占子宮內(nèi)膜的絕大部分（36%），它們表達膠原和基質(zhì)相關(guān)基因（圖 1B-D）。在比較 3 位患者的子宮內(nèi)膜組織時，發(fā)現(xiàn)所有 3 種組織都含有大多數(shù)細胞群，但含量各不相同（圖 1E）。成纖維細胞群 E0 和 E1 具有相似的基因表達譜，都表達SFRP4、COL1A1、LUM、MMP11、SFRP1、ECM1 和IGF1（圖 1F）。特征圖還顯示，這兩個群還表達子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細胞表達的MME、ESR1 和PGR（圖 1G）。

一個與成纖維細胞密切相關(guān)的獨特細胞群（E7）顯示了周細胞標志物COX4I2、MCAM、NOTCH3 和PDGFRB 的獨特表達。與E7相連的是表達MYL9、TINAGL、BCAM、MYH11、MYLK和ACTA2等標記的血管平滑肌細胞群（E6）（圖1F）。由于在周細胞中持續(xù)檢測到干/祖細胞類型，所以作者從E7群開始進行了擬時序分析（圖1F）。耐人尋味的是，從周細胞開始的分化軌跡經(jīng)過E0和E1的成纖維細胞樣細胞，然后經(jīng)過活躍分化的成纖維細胞樣細胞（E13），最后到達纖毛上皮（E14；圖1H）。因此，結(jié)果表明，成纖維細胞樣細胞可能起源于具有間充質(zhì)干細胞特征的周細胞。

數(shù)據(jù)還表明纖毛上皮細胞可能通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）從周細胞衍生而來。對這一MET軌跡的PROGENy分析表明，在分化的成纖維細胞樣細胞（E13）和纖毛上皮細胞群（E14）中，PI3K和P53這兩種不同的信號通路分別上調(diào)（圖1I）。

圖1 子宮內(nèi)膜單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析

2、子宮肌腺癥以纖維化和高度異質(zhì)性的成纖維細胞群為主

scRNA測序在AD共鑒定到24個細胞簇注釋為13種細胞類型（圖2A）。與EE比較，AD組織具有更高的成纖維細胞組分（50%）和更低的上皮細胞組分（圖2B）。圖 2C和2D顯示了每位患者每個細胞亞群的相對比例以及每種細胞類型的基因標記物。成纖維細胞樣群 A0、A6、A5、A1 和 A12 顯示出轉(zhuǎn)錄組的相似性，并代表了一個不同于 A2 和 A4 的群體，前者獨特地富集了平滑肌細胞標記物，而后者則具有細胞外基質(zhì)相關(guān)基因的強烈特征（圖 2E）。在 A0 中，PROGENy 顯示 MAPK 和表皮生長因子受體通路的激活，這兩種通路都與細胞增殖有關(guān)（圖 2H）。相鄰的 A6 簇高表達PDGFRA、COL6A3、MME、ESR1、RORB和HAND2，它們是間充質(zhì)祖細胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的經(jīng)典標記（圖 2E）。A6 中表達了PDGFRA和ESR1基因，表明間質(zhì)細胞在雌激素的驅(qū)動下增殖和分化活躍。有趣的是，A6 的ESR1表達量最高，表明其對雌激素具有高度敏感性，而 A12 和 A5 的PGR表達量最高（圖 2F）。這種ESR1/PGR表達的進展模式與擬時序分析顯示的分化方向一致，即 A0→A6→A12→A5（圖 2F、2G）。

圖2 子宮腺肌病組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析

3、子宮肌層：成纖維細胞集群形成了一個有別于平滑肌細胞集群的群體

在子宮肌層中鑒定到20個亞群包含10種細胞類型。與EE和AD一樣，子宮肌層中的主要細胞類型是成纖維細胞樣細胞團（40%），其次是 SMC（18%）。

4、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜和子宮肌層中成纖維細胞群的比較分析

接下來，作者評估了區(qū)分子宮腺肌病與子宮內(nèi)膜和子宮肌層的成纖維細胞群的不同基因表達模式（圖 3A、3B）。在子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜的成纖維細胞樣群中，最引人注目的觀察結(jié)果是 A0 與 E0 和 E1 子宮內(nèi)膜成纖維細胞非常相似（圖 3A）。這表明 A0 成纖維細胞代表了一個從子宮內(nèi)膜遷移到子宮肌層組織并導致子宮腺肌癥的群體（圖 1，圖 2A）。擬時序分析表明，A0、E0 和 E1 都具有類似祖細胞的特征，分化程度較高的成纖維細胞就來源于這些祖細胞（圖 1，圖 2G）。

當對AD和子宮肌層成纖維細胞群進行比較時（圖 3B），A4 與 M0 和 M11 顯示出驚人的相似性，它們都表達了最高水平的 MGP，似乎代表了每個組織中成纖維細胞樣群的終末分化群體（圖 2G）。MGP 是細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，這種發(fā)現(xiàn)與所觀察到的腺肌瘤組織中細胞外基質(zhì)的增加相吻合。

耐人尋味的是，作為 WNT 通路調(diào)節(jié)劑的 SFRP 基因家族在成纖維細胞樣集群中表達突出，顯示出子宮內(nèi)膜、子宮腺肌病和子宮肌層之間的跨組織相似性（圖 3A、3B）。因此，作者首先測定了該基因家族成員在這三種組織中的差異表達（圖 3C）。腺肌病中SFRP1和SFRP4的水平均高于子宮內(nèi)膜或子宮肌層（圖3C）?；?span>SFRP2僅在子宮腺肌病和子宮肌層中表達（A4，M11；圖 3A-C）。據(jù)報道，SFRP2 是一種 WNT 拮抗劑，能下調(diào)雌激素依賴的 β-catenin 活性，抑制細胞生長并促進肌生成。子宮內(nèi)膜中缺乏SFRP2的表達可能會導致上皮細胞的生長和侵襲。因此，SFRP2可能是預測子宮腺肌病上皮細胞生長潛力的關(guān)鍵標志物。有趣的是，SFRP1和SFRP4在子宮腺肌病的所有成纖維細胞樣團中都有表達，而SFRP2僅在 A4 中表達（圖 3D）。

圖3 3種組織類型成纖維細胞群體差異基因表達的比較分析

5、子宮內(nèi)膜和子宮腺肌病中的纖毛和無纖毛上皮細胞群分析

上皮是子宮腺肌癥的主要細胞類型，而子宮腺肌癥被認為起源于子宮內(nèi)膜。因此，作者進一步分析了匹配的AD組織和EE上皮細胞中的差異表達基因。首先，使用散點圖分析來確定組織中的纖毛上皮細胞和無纖毛上皮細胞（圖 4A）。不出所料，PAEP和MMP7 等經(jīng)典標志物在無纖毛上皮細胞中的表達量明顯較高，而更多的基因在纖毛上皮細胞中顯著表達（圖 4A）。然后，分別鑒定了子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜中無纖毛上皮細胞和纖毛上皮細胞的差異表達基因（圖 4B、4C）。一般來說，腺肌癥組織和子宮內(nèi)膜中的無纖毛上皮和纖毛上皮表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)錄組特征。然而，在子宮內(nèi)膜的無纖毛上皮中，一些基因的表達明顯高于子宮內(nèi)膜，包括分化標記物，如PAEP、PLCG2、HSPA1A 和HSP90AA1（圖 4B）。PAEP 標志物又稱糖度蛋白，是一種分泌性糖蛋白，受孕酮調(diào)控，與分化和健康植入有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能表明，子宮腺肌癥無纖毛上皮細胞中存在孕酮抗性。在無纖毛和纖毛上皮細胞中，腺肌病患者熱休克蛋白（HSPA1A、HSP90AA1）的表達明顯低于子宮內(nèi)膜（圖 4B、4C）。由于某些熱休克蛋白對雌激素的作用很重要，而雌激素在子宮腺肌病中似乎也有作用，因此這一發(fā)現(xiàn)需要進一步研究。

與子宮內(nèi)膜相比，子宮腺肌病無纖毛上皮細胞中與免疫功能相關(guān)的基因和通路上調(diào)（圖 4B、4D）。與免疫反應和巨噬細胞活化相關(guān)的基因，如HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74、NFKBIA 和S100A6，在子宮腺肌癥上皮細胞中的表達明顯升高（圖 4B）。這些基因也與細胞增殖、炎癥和細胞運動有關(guān)。在腺肌病的上調(diào)途徑中，免疫反應相關(guān)過程在腺肌病的纖毛上皮和無纖毛上皮中明顯上調(diào)（圖 4D）。此外，參與典型 WNT 信號通路和上皮細胞遷移調(diào)控通路的基因僅在腺肌病無纖毛上皮中上調(diào)。

在本研究中，WNT 信號轉(zhuǎn)導成為基質(zhì)、上皮和 SMC 中受到不同調(diào)控的一個重要生物過程；因此，進一步分析腺肌癥組織中所有細胞類型之間的旁分泌和內(nèi)分泌 WNT 相關(guān)相互作用（圖4E）。WNT信號網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)了多種信號，分別來自成纖維細胞群 A0、A1、A5 和 A12，以及上皮細胞和內(nèi)皮細胞群 A10、A13、A14 和 A18（圖 4E）。配體（WNT）及其受體（FZD和LRP）在各細胞簇中的表達分布支持了基質(zhì)細胞向內(nèi)皮細胞和上皮細胞發(fā)出信號的方向性（圖 4F）。特別是，WNT2和WNT4在腺肌病特異性成纖維細胞樣簇中表達突出，如 A0、A1、A5 和 A12（圖 4F；圖3）。在內(nèi)皮細胞或上皮細胞中表達的最主要的WNT受體是FZD6和LRP6?？傊?，scRNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)了子宮內(nèi)膜和子宮腺肌癥中各種成纖維細胞群的重要作用，它們似乎通過向內(nèi)皮細胞和上皮細胞傳遞 WNT 信號，在子宮腺肌癥的病理生理學中發(fā)揮著核心作用。

圖4 子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜上皮細胞譜分析

實驗方法：

患者信息和臨床樣本采集，scRNA測序及生物信息學分析

參考文獻：

Yildiz S, Kinali M, Wei JJ, Milad M, Yin P, Adli M, Bulun SE. Adenomyosis: single-cell transcriptomic analysis reveals a paracrine mesenchymal-epithelial interaction involving the WNT/SFRP pathway. Fertil Steril. 2023 May;119(5):869-882. doi: 10.1016/j.fertnstert.2023.01.041. Epub 2023 Feb 1. PMID: 36736810.