lncRNA RGMB-AS1通過抑制HMOX1泛素化和NAA10激活來誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌中的鐵死亡

鐵死亡是一種由過量脂質(zhì)過氧化積累引起的鐵依賴性調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡方式，已逐漸成為包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）在內(nèi)的多種癌癥的有希望的治療靶點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中，我們確定了lncRNA RGMB-AS1作為NSCLC中鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。機(jī)制上，RGMB-AS1與HMOX1相互作用，防止其被E3連接酶TRC8泛素化，導(dǎo)致HMOX1穩(wěn)定性增加和鐵死亡增強(qiáng)。此外，RGMB-AS1結(jié)合到NAA10的82-87氨基酸區(qū)域，刺激其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，促進(jìn)乙酰-CoA向HMG-CoA的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步貢獻(xiàn)于鐵死亡。RGMBAS1-HMOX1和RGMB-AS1-NAA10軸協(xié)同抑制了NSCLC在體內(nèi)和體外的生長。臨床上，NSCLC患者中低RGMB-AS1表達(dá)與腫瘤分期晚和總體生存率差有關(guān)。此外，腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RGMB-AS1過表達(dá)顯著抑制了小鼠異種移植模型中的腫瘤生長。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了鐵死亡的一種新的lncRNA介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了RGMB-AS1作為NSCLC預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。本文于2024年4月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF=9.7）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）低水平的RGMB-AS1與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后不良和體內(nèi)外的腫瘤進(jìn)展有關(guān)

為了探討RGMB-AS1與非小細(xì)胞肺癌臨床結(jié)果的相關(guān)性，我們收集了58名患者的非小細(xì)胞肺癌組織樣本和匹配的正常肺組織樣本。我們發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，腫瘤中RGMB-AS1的表達(dá)顯著降低（圖1A）。死于非小細(xì)胞肺癌的患者RGMB-AS1的水平顯著低于存活的患者（圖1B），且RGMB-AS1的低水平與晚期TNM分期（III-IV期）顯著相關(guān)（圖1C）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，低水平的RGMB-AS1預(yù)示著非小細(xì)胞肺癌患者總生存期（OS）不良（圖1D）。H1299細(xì)胞中的熒光原位雜交（FISH）結(jié)果顯示，RGMB-AS1主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1E）。RGMB-AS1的過表達(dá)導(dǎo)致克隆形成能力降低和細(xì)胞活力減少（圖1F-G）。為了進(jìn)一步評估RGMB-AS1與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)聯(lián)性，我們在裸鼠皮下注射RGMB-AS1過表達(dá)的H1299穩(wěn)定細(xì)胞來評估腫瘤生長。RGMB-AS1的過表達(dá)顯著抑制了腫瘤生長（圖1H-J）。兩組腫瘤的免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)，過表達(dá)RGMB-AS1的腫瘤顯示Ki-67的水平降低（圖1K）。

2）RGMB-AS1與HMOX1相互作用，抑制HMOX1泛素化

為了探討RGMB-AS1抑制非小細(xì)胞肺癌增殖的潛在機(jī)制，我們進(jìn)行了基于DIA（數(shù)據(jù)獨(dú)立采集）的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以比較RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)變化。在RGMB-AS1過表達(dá)引起的321個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs）中，HMOX1受到的影響最為顯著。RGMB-AS1的過表達(dá)導(dǎo)致HMOX1蛋白水平增加（圖2C）。一致地，RGMB-AS1過表達(dá)組小鼠腫瘤中HMOX1的蛋白水平增加（圖2D）。使用shRNA在RGMB-AS1過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞中敲低HMOX1，導(dǎo)致細(xì)胞活力和克隆形成能力增加（圖2E和F）。與細(xì)胞結(jié)果一致，裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示，使用shRNA敲低HMOX1削弱了RGMB-AS1過表達(dá)對腫瘤進(jìn)展的影響（圖2G-I）。然后我們調(diào)查RGMB-AS1如何調(diào)節(jié)HMOX1蛋白水平。CHX追蹤實(shí)驗(yàn)的證據(jù)顯示，RGMB-AS1顯著增加了HMOX1的蛋白穩(wěn)定性（圖2J和K）。我們進(jìn)一步評估了HMOX1的泛素化，并發(fā)現(xiàn)RGMB-AS1過表達(dá)導(dǎo)致HMOX1泛素化水平降低（圖2L）。TRC8，一種E3泛素連接酶，被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)HMOX1的泛素化并抑制癌細(xì)胞生長。RGMB-AS1拉下實(shí)驗(yàn)?zāi)芄餐?span>HMOX1（圖2M），HMOX1 RNA免疫沉淀（RIP）也富集了RGMB-AS1（圖2N），進(jìn)一步證實(shí)了這種相互作用。值得注意的是，RGMB-AS1過表達(dá)破壞了HMOX1與TRC8的相互作用，表明RGMB-AS1通過減輕TRC8介導(dǎo)的泛素化來促進(jìn)HMOX1的穩(wěn)定性（圖2O）。綜上所述，RGMB-AS1與HMOX1相互作用，并競爭性抑制TRC8與HMOX1的結(jié)合，從而抑制其泛素化。

3）RGMB-AS1-HMOX1促進(jìn)肺癌鐵死亡

為了探討RGMB-AS1-HMOX1參與的關(guān)聯(lián)途徑，我們進(jìn)行了KEGG分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在脂肪酸生物合成、鐵死亡和GSH代謝等途徑中富集（圖3A），在鐵死亡途徑中，與RGMB-AS1相互作用的HMOX1是五個(gè)富集基因中差異表達(dá)最顯著的（圖3B）。為了確定RGMB-AS1-HMOX1相互作用是否參與鐵死亡，我們首先使用Mito-Tracker Red觀察了線粒體完整性。與對照細(xì)胞相比，RGMB-AS1過表達(dá)顯示出異常的線粒體分布（圖3C）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，RGMB-AS1過表達(dá)導(dǎo)致線粒體膜密度增加和線粒體脊減少（圖3D）。GPX4水平在RGMB-AS1過表達(dá)時(shí)降低，而進(jìn)一步敲低HMOX1的shRNA則逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖3E）。RGMB-AS1過表達(dá)導(dǎo)致脂質(zhì)ROS水平增加（圖3F）。我們檢測了MDA的水平，它是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，以及總GSH的水平，它是抵抗鐵死亡的關(guān)鍵抗氧化劑。結(jié)果顯示，RGMB-AS1過表達(dá)導(dǎo)致MDA水平增加和總GSH水平降低，進(jìn)一步敲低HMOX1則逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖3G和H）。同時(shí)，我們還檢測了小鼠異種移植組織中的Fe2+水平。Fe2+水平在RGMB-AS1過表達(dá)組增加，但在HMOX1敲除后可以逆轉(zhuǎn)（圖3I）。一致地，RGMB-AS1敲除細(xì)胞中的脂質(zhì)ROS水平顯著降低，在此基礎(chǔ)上過表達(dá)HMOX1可以恢復(fù)脂質(zhì)ROS水平（圖3J）。綜上所述，這些結(jié)果表明RGMB-AS1通過與HMOX1共同作用來促進(jìn)鐵死亡。

4）RGMB-AS1與NAA10結(jié)合促進(jìn)NAA10活性

為了進(jìn)一步探討RGMB-AS1在促進(jìn)肺癌細(xì)胞鐵死亡中的作用，我們在非交聯(lián)條件下進(jìn)行了RGMB-AS1拉下實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行質(zhì)譜分析以直接鑒定蛋白質(zhì)（圖4A）。在H1299和A549細(xì)胞中，通過體外轉(zhuǎn)錄的RGMB-AS1 RPD-MS結(jié)果，NAA10是肽段數(shù)量和序列覆蓋率（11%）最高的前五個(gè)蛋白質(zhì)之一。RGMB-AS1拉下實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚬餐?span>NAA10（圖4B），NAA10 RNA免疫沉淀（RIP）也富集了RGMB-AS1（圖4C），進(jìn)一步證實(shí)了這種相互作用。通過RGMB-AS1的熒光原位雜交（FISH）和針對NAA10蛋白的免疫熒光（IF）染色，顯示它們可能有一些機(jī)會相互作用（圖4D）。為了進(jìn)一步研究RGMB-AS1-NAA10相互作用，我們檢查了NAA10與RGMB-AS1結(jié)合時(shí)的相互作用區(qū)域。通過刪除NAA10的乙酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)（RRLGLA），這是其乙酰轉(zhuǎn)移酶酶活性至關(guān)重要的一步（圖4E），我們進(jìn)行了RGMB-AS1的體外轉(zhuǎn)錄和NAA10（NAA10突變體）的原核蛋白純化實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，在RGMB-AS1拉下實(shí)驗(yàn)中，NAA10乙酰輔酶A結(jié)合位的刪除（NAA10突變體）削弱了RGMB-AS1與NAA10的結(jié)合（圖4F）。一致地，針對FLAG標(biāo)簽的RGMB-AS1 FISH和IF染色顯示，RGMB-AS1與NAA10的共定位減少（圖4G-I）。針對FLAG標(biāo)簽的NAA10 RIP和NAA10突變體過表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，乙酰輔酶A結(jié)合位的刪除削弱了NAA10與RGMB-AS1的結(jié)合（圖4J）。在RGMB-AS1過表達(dá)的腫瘤攜帶小鼠中觀察到HMG-CoA水平增加，基于此敲低HMOX1可以恢復(fù)HMG-CoA水平（圖4K）。綜合這些結(jié)果表明，RGMB-AS1可以通過關(guān)鍵的乙酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)（RRLGLA）與NAA10結(jié)合，并通過促進(jìn)乙酰輔酶A到HMG-CoA的轉(zhuǎn)換來增加NAA10的活性。

5）RGMB-AS1通過調(diào)節(jié)NAA10活性促進(jìn)鐵死亡

我們探討了RGMB-AS1-NAA10軸在腫瘤進(jìn)展中的作用。使用CRISPR/Cas9技術(shù)在H1299 RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞中生成NAA10。NAA10敲除促進(jìn)了RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞中的細(xì)胞活力和集落形成，而額外的FLAG標(biāo)簽野生型NAA10過表達(dá)，而不是其突變體，恢復(fù)了這種效果（圖5A和B）。同樣，裸鼠皮下注射實(shí)驗(yàn)顯示，RGMB-AS1過表達(dá)時(shí)的NAA10敲除促進(jìn)了腫瘤生長，增加了腫瘤重量和Ki-67水平，而野生型NAA10過表達(dá)，但不是其突變體，恢復(fù)了這些效果（圖5C-E）。在RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞中敲除NAA10逆轉(zhuǎn)了RGMB-AS1過表達(dá)引起的HMG-CoA水平增加。另一方面，野生型NAA10過表達(dá)，但不是其突變體，再次增加了總血清NAA10和HMG-CoA水平（圖5F）。我們探討了RGMB-AS1-NAA10軸是否調(diào)節(jié)鐵死亡。在RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞中敲除NAA10后，GPX4水平增加，Fe2+水平降低，表明RGMB-AS1-NAA10也參與調(diào)節(jié)鐵死亡（圖5G和H）。綜合來看，RGMB-AS1與NAA10的相互作用對于體外和體內(nèi)腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要，RGMB-AS1-NAA10可能通過與HMG-CoA相關(guān)的鐵死亡發(fā)揮作用。

6）RGMB-AS1 通過依賴于HMOX1和NAA10的促進(jìn)鐵死亡機(jī)制抑制腫瘤進(jìn)展

為了進(jìn)一步深入了解RGMB-AS1調(diào)控HMOX1和NAA10以增強(qiáng)肺癌鐵死亡分子機(jī)制，我們分別通過敲除NAA10、shRNA敲低HMOX1以及將兩者結(jié)合的方式，在RGMB-AS1過表達(dá)細(xì)胞中評估了細(xì)胞活力和集落形成。結(jié)果顯示，NAA10敲除和HMOX1敲低均部分逆轉(zhuǎn)了RGMB-AS1過表達(dá)的效果，而它們的組合具有最顯著的逆轉(zhuǎn)效果（圖6A和B）。在RGMB-AS1調(diào)節(jié)鐵死亡的過程中，我們也觀察到NAA10敲除和HMOX1敲低均部分削弱了鐵死亡，它們的組合具有最顯著的效果，恢復(fù)了GPX4、MDA和總GSH水平（圖6C-E）。為了評估RGMB-AS1介導(dǎo)的鐵死亡在體內(nèi)的效果，我們向4周齡的裸鼠體內(nèi)注射了表達(dá)RGMB-AS1的AAV8（AAV8-RGMB-AS1）或相應(yīng)的對照（AAV8-Ctrl）。在感染5周后進(jìn)行檢查，AAV8-RGMB-AS1導(dǎo)致腫瘤生長受到抑制。使用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin進(jìn)一步評估RGMB-AS1在鐵死亡中的功能。用Erastin（30 mg/kg）每隔三天治療腫瘤攜帶小鼠5周，也導(dǎo)致腫瘤生長顯著抑制，與AAV8-RGMB-AS1治療結(jié)果相當(dāng)（圖6F-I）。AAV-RGMB-AS1和Erastin處理后HMG-CoA顯著增加（圖6J）。同時(shí)，通過鐵測定評估腫瘤異種移植物中Fe2+水平，結(jié)果顯示AAV-RGMB-AS1和Erastin處理均顯著增加了Fe2+水平（圖6K）。這些結(jié)果表明RGMB-AS1是抑制肺癌腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，通過HMOX1和NAA10分別介導(dǎo)的兩種途徑誘導(dǎo)鐵死亡。

結(jié)論：

我們揭示了RGMB-AS1介導(dǎo)的RGMB-AS1-HMOX1和RGMB-AS1-NAA10軸在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展中誘導(dǎo)鐵死亡的作用。更好地理解RGMB-AS1在生物學(xué)過程中的關(guān)鍵角色可能會導(dǎo)致新的癌癥治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

CCK8、克隆形成實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜、WB、pull down、qRT-PCR、Co-IP、FISH、RIP、脂質(zhì)過氧化測定、腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)、ELISA、免疫組化、TEM。

參考文獻(xiàn)：

Gao GB, Chen L, Pan JF, Lei T, Cai X, Hao Z, Wang Q, Shan G, Li J. LncRNA RGMB-AS1 inhibits HMOX1 ubiquitination and NAA10 activation to induce ferroptosis in non-small cell lung cancer. Cancer Lett. 2024 Apr 2;590:216826. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216826.