LINC01559通過(guò)干擾波形蛋白的泛素化促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移

         肺癌是全球最常見的癌癥之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是最常見的肺癌亞型。早期LUAD可通過(guò)根治性切除治愈，但晚期LUAD目前尚無(wú)根治性治療方法，盡管近年來(lái)分子靶向治療、免疫治療和聯(lián)合治療取得了進(jìn)展。這與疾病轉(zhuǎn)移到原發(fā)部位以外密切相關(guān)。然而，參與肺腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚，雖然已知上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移過(guò)程中至關(guān)重要，而波形蛋白作為一種中間絲蛋白，在EMT過(guò)程中發(fā)揮著減少細(xì)胞間黏附和重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用，使細(xì)胞變得更具有遷移和侵襲性。目前幾乎所有的癌癥生物標(biāo)志物和治療方法都以蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的基因?yàn)榘悬c(diǎn)。然而，越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到非編碼RNA在多種病理生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。特別是lncRNA的失調(diào)與癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。lncRNA常與其他生物分子建立分子間相互作用。這使得lncRNA可以作為拴系、導(dǎo)向、誘餌或支架來(lái)承擔(dān)各種生物學(xué)功能，包括癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗。值得注意的是，參與肺腺癌發(fā)病機(jī)制的失調(diào)lncRNA列表也在迅速擴(kuò)展。然而，lncRNA在肺腺癌轉(zhuǎn)移中的作用仍有待完全闡明。該研究發(fā)表在《Biomarker Research》，IF：11.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、LINC01559高表達(dá)與肺腺癌轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后相關(guān)

         為了更好地了解lncRNA在肺腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，作者研究了先前發(fā)表的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集treatment-na?ve非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），該數(shù)據(jù)集包含不同病理分期的肺腺癌病例。該分析顯示，與無(wú)轉(zhuǎn)移病灶的肺腺癌患者相比，5個(gè)注釋的lncRNA（HAND2-AS1、GLIS3-AS1、MRVI1-AS1、LINC00612和LINC01559）在有轉(zhuǎn)移病灶的肺腺癌患者的支氣管鏡活檢組織中表達(dá)水平較高（圖1A）。有趣的是，癌癥基因組圖譜（TCGA）中LUAD數(shù)據(jù)集的分析顯示，LINC01559的高表達(dá)與LUAD患者的總生存（OS）相關(guān)（圖1B），而其他lncRNA的高表達(dá)與LUAD患者的OS無(wú)關(guān)（圖1B）。事實(shí)上，在TCGA LUAD數(shù)據(jù)集中，與配對(duì)的非癌肺組織相比，LINC01559在LUAD中表達(dá)水平升高（圖1C）。

         通過(guò)原位雜交分析，作者證實(shí)了LINC01559在90例福爾馬林固定石蠟包埋的肺腺癌樣本中表達(dá)上調(diào)（圖1D，E）。根據(jù)患者性別和診斷時(shí)的中位年齡分層的不同組的肺腺癌中，LINC01559的表達(dá)沒有顯著差異。LINC01559高表達(dá)與肺腺癌較高的組織學(xué)分級(jí)（III-IV級(jí)）和晚期（美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì) III-IV期）相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，LINC01559高表達(dá)與患者較差的OS相關(guān)（圖1F）。此外，多變量Cox回歸分析顯示，LINC01559的高表達(dá)與OS獨(dú)立于分期和診斷時(shí)的年齡（肺腺癌患者的明確預(yù)后標(biāo)志物）相關(guān)。同樣，LINC01559在4個(gè)肺腺癌細(xì)胞系中的3個(gè)中的表達(dá)水平高于人成纖維細(xì)胞系HSF（圖1G）。綜上所示，LINC01559在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，尤其是在伴有轉(zhuǎn)移的肺腺癌中，其高表達(dá)與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。因此，作者著重研究LINC01559在肺腺癌轉(zhuǎn)移中的潛在作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。

圖1 LINC01559在有轉(zhuǎn)移的肺腺癌中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后相關(guān)

2、LINC01559促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移

         為了功能性地檢測(cè)LINC01559在肺腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，作者使用兩個(gè)獨(dú)立的siRNA在A549和H1299細(xì)胞中敲低LINC01559（圖2A）。事實(shí)上，在劃痕實(shí)驗(yàn)中，siRNA敲低顯著延遲了LUAD細(xì)胞的傷口愈合，在transwell實(shí)驗(yàn)中降低了它們對(duì)Matrigel基質(zhì)膠的遷移和侵襲（圖2B-E）。

         為了進(jìn)一步研究，作者建立了A549亞系A549。shRNA穩(wěn)定敲低LINC01559的shLINC01559（圖2F）。此外，NOD/SCID小鼠尾靜脈注射A549。與注射攜帶對(duì)照shRNA的A549的細(xì)胞相比，shLINC01559細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移病灶形成顯著減少（圖2G，H）。對(duì)隨機(jī)選取的肺結(jié)節(jié)進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，病理證實(shí)肺轉(zhuǎn)移（圖2I）。綜上所述，這些結(jié)果表明LINC01559促進(jìn)肺腺癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖2 LINC01559促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移

3、LINC01559與波形蛋白相互作用

         為了了解LINC01559促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，作者使用qPCR分析A549和H1299細(xì)胞的亞細(xì)胞部分來(lái)檢測(cè)其亞細(xì)胞定位。該分析表明LINC01559主要定位于LUAD細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖3A）。值得注意的是，當(dāng)作者使用RNA pulldown（RPD）和質(zhì)譜分析與LINC01559相互作用的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)與LINC01559共沉淀的蛋白中含量最多的是波形蛋白（圖3B），這是一種主要位于細(xì)胞質(zhì)的中間絲蛋白，與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。作者隨后在A549和H1299細(xì)胞中使用RPD和RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LINC01559和波形蛋白的關(guān)聯(lián)（圖3C，D）?？傊@些結(jié)果表明，LINC01559和波形蛋白之間的相互作用可能在LINC01559介導(dǎo)的促肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

圖3 LINC01559與波形蛋白結(jié)合

4、波形蛋白在LINC01559介導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用

         作者接下來(lái)研究了波形蛋白在LINC01559介導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲中的功能重要性。transwell實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA敲低波形蛋白降低了A549和H1299細(xì)胞的侵襲和遷移（圖4A-C）。重要的是，進(jìn)一步的分析表明，波形蛋白過(guò)表達(dá)阻止了siRNA敲低LINC01559引起的遷移和侵襲的減少，而敲低波形蛋白抑制了LINC01559過(guò)表達(dá)引起的遷移和侵襲的促進(jìn)（圖4D-F）。因此，波形蛋白是LINC01559促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲所必需的。

圖4 波形蛋白在LINC01559介導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用

5、LINC01559促進(jìn)波形蛋白表達(dá)

         為了進(jìn)一步了解LINC01559與波形蛋白相互作用的意義，作者檢測(cè)了敲低和未敲低LINC01559的A549和H1299細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)。有趣的是，雖然siRNA敲低LINC01559并沒有引起波形蛋白 mRNA水平的任何顯著變化（圖5A），但它顯著降低了A549和H1299細(xì)胞中波形蛋白蛋白的表達(dá)（圖5B）。相比之下，過(guò)表達(dá)LINC01559導(dǎo)致波形蛋白蛋白水平的上調(diào)（圖5C），而波形蛋白 mRNA的表達(dá)沒有明顯變化（圖5D）。另一方面，在A549和H1299細(xì)胞中，波形蛋白的敲低和過(guò)表達(dá)都沒有觸發(fā)LINC01559的表達(dá)變化（圖5E，F）。因此，LINC01559通過(guò)轉(zhuǎn)錄后增加促進(jìn)波形蛋白的表達(dá)。從A549分離的LUAD細(xì)胞具有指導(dǎo)意義。與攜帶對(duì)照shRNA的A549細(xì)胞相比，shLINC01559肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)水平同樣較低（圖5G），表明LINC01559在體內(nèi)調(diào)節(jié)LUAD細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)。

圖5 LINC01559促進(jìn)波形蛋白表達(dá)

6、LINC01559通過(guò)抑制波形蛋白的泛素化而穩(wěn)定波形蛋白

         在發(fā)現(xiàn)LINC01559通過(guò)轉(zhuǎn)錄后上調(diào)促進(jìn)波形蛋白表達(dá)后，作者在敲低或未敲低LINC01559的A549和H1299細(xì)胞中進(jìn)行了放線菌酮追逐實(shí)驗(yàn)。事實(shí)上，siRNA敲低LINC01559加速了波形蛋白的轉(zhuǎn)換（圖6A），表明LINC01559調(diào)節(jié)了波形蛋白的穩(wěn)定性。與此同時(shí)，蛋白酶體抑制劑MG132的處理減少了siRNA敲低LINC01559引起的波形蛋白的減少（圖6B）。由于多聚泛素化是蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解所必需的，作者測(cè)試了LINC01559是否影響波形蛋白的多聚泛素化。事實(shí)上，siRNA敲低LINC01559導(dǎo)致A549和H1299細(xì)胞中波形蛋白多泛素化增加（圖6C）。相比之下，過(guò)表達(dá)LINC01559導(dǎo)致細(xì)胞中波形蛋白的多泛素化降低（圖6D）。重要的是，A549來(lái)源的LUAD細(xì)胞中波形蛋白的多泛素化更強(qiáng)。與來(lái)自A549.sh-ctrl肺轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤進(jìn)行比較（圖6E）。綜上所述，這些結(jié)果表明LINC01559通過(guò)抑制波形蛋白的多泛素化來(lái)促進(jìn)LUAD細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)。

圖6 LINC01559穩(wěn)定波形蛋白

結(jié)論：

         lncRNA LINC01559與波形蛋白結(jié)合并阻止其泛素化和蛋白酶體降解，從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。LINC01559在轉(zhuǎn)移性肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，LINC01559高表達(dá)與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果揭示了一個(gè)新的lncRNA介導(dǎo)的促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展的機(jī)制，并提示LINC01559的表達(dá)可能是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，靶向LINC01559可能是治療晚期肺腺癌的潛在方法。

實(shí)驗(yàn)方法

         細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)，傷口愈合試驗(yàn)，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，原位雜交(ISH)，RNA pull-down，RNA免疫沉淀(RIP)，質(zhì)譜分析，泛素化分析，小鼠肺腺癌轉(zhuǎn)移模型

參考文獻(xiàn)：

         Feng H, Xu D, Jiang C, Chen Y, Wang J, Ren Z, Li X, Zhang XD, Cang S. LINC01559 promotes lung adenocarcinoma metastasis by disrupting the ubiquitination of vimentin. Biomark Res. 2024 Feb 5;12(1):19. doi: 10.1186/s40364-024-00571-3. PMID: 38311781; PMCID: PMC10840222.