Deciphering the nucleotide metabolomics in patients with post-COVID-19 condition and type 2 diabetes mellitus

肝細(xì)胞癌（HCC）起源于慢性炎癥，肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活通過形成促腫瘤微環(huán)境起作用。這個(gè)過程的關(guān)鍵是p62，它的失活導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。在這里，作者發(fā)現(xiàn)p62通過促進(jìn)HSC中STING泛素化（TRIM32）激活干擾素（IFN）級(jí)聯(lián)。p62是BRCA1基因1（NBR1）和STING的結(jié)合鄰居，通過取代NBR1觸發(fā)IFN級(jí)聯(lián)，而NBR1通常會(huì)阻止TRIM32與STING的相互作用及其隨后的激活。此外，NBR1還通過促進(jìn)STING轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)溶酶體室進(jìn)行獨(dú)立于自噬的降解來拮抗STING。與功能相關(guān)的是，NBR1缺失通過挽救被抑制的STING-IFN通路，完全恢復(fù)p62缺陷HSC的促瘤功能，從而增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。因此，通過促進(jìn)STING/IFN通路，NBR1作為HSC中p62缺乏的合成易感性出現(xiàn)，該通路可增強(qiáng)抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)，從而抑制HCC進(jìn)展。該文章于2024年10月發(fā)表在《Molecular cell》，IF：14.5。

摘要圖：

主要研究結(jié)果：

1. NBR1失活損害p62缺乏驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)的肝臟腫瘤發(fā)生

由于p62的全身消融促進(jìn)小鼠的肝癌發(fā)生，并且NBR1與p62相互作用，作者假設(shè)NBR1可能在p62缺乏增強(qiáng)體內(nèi)肝臟腫瘤發(fā)生的能力中發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，在2周齡時(shí)給NBR1 （NBR1 -/-）、p62 （Sqstm1-/-）或雙p62/NBR1 （Sqstm1-/- NBR1 -/-）的野生型（WT）和全身敲除型（KO）小鼠注射肝臟致癌物二乙基亞硝胺（DEN），并喂食高脂肪飲食（HFD）（圖1A），遵循有充分記錄的方案，在小鼠中誘導(dǎo)肝臟和腺瘤和HCC 與作者之前的觀察結(jié)果一致，通過肝體重比、腫瘤總數(shù)、大腫瘤數(shù)量（> 3mm）或Afp mRNA水平以及具有HCC組織學(xué)的腫瘤比例（圖1B-1G）來確定，16只p62缺陷小鼠與WT相比，腫瘤發(fā)生增加。雖然Nbr1-/-小鼠沒有表現(xiàn)出顯著的表型（圖1B-1G），但Sqstm1 -/-Nbr1-/-小鼠恢復(fù)了由p62缺失驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)展增加（圖1B-1G和S1A）。這些發(fā)現(xiàn)表明，NBR1在由全身p62缺乏驅(qū)動(dòng)的肝腫瘤惡性增強(qiáng)中起關(guān)鍵作用。由于Sqstm1-/-肝臟的致瘤前表型是由于產(chǎn)生了有利于HCC的TME，因此通過肝內(nèi)注射將來自DEN + HFD處理小鼠的腫瘤的侵襲性同基因HCC細(xì)胞系（DihXD3）移植到WT、Sqstm1-/-、Nbr1-/-和Sqstm1-/-Nbr1-/-小鼠中（圖1H）。四周后，與Sqstm1-/-小鼠相比，DihXD3細(xì)胞在Sqstm1-/-小鼠肝臟中產(chǎn)生的原發(fā)性腫瘤更少（圖1I、1J和S1B），這表明NBR1的缺失逆轉(zhuǎn)了p62全身消融產(chǎn)生的致瘤性肝臟TME。基于作者之前的觀察，證實(shí)了HSC間室p62缺失是TME的一個(gè)重要因素，16作者假設(shè)NBR1缺失的影響也可能歸因于NBR1在HSC中以前未被認(rèn)識(shí)到的作用。為了驗(yàn)證這種可能性，將從WT、Sqstm1-/-、Nbr1-/-或Sqstm1-/- -Nbr1-/-小鼠中分離的造血干細(xì)胞與DihXD3細(xì)胞一起植入先前喂食HFD 2個(gè)月的WT小鼠肝臟中（圖1K）。與作者的假設(shè)一致，植入DihXD3 + Sqstm1-/- HSC的肝臟腫瘤比植入DihXD3 + WT HSC的肝臟腫瘤大，而植入DihXD3 + Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的肝臟腫瘤發(fā)生減少（圖1L、1M）。與植入DihXD3 + WT HSC的肝臟相比，植入DihXD3 + Nbr1-/- HSC的肝臟腫瘤發(fā)生減少（圖1L、1M）。將DiHXD3細(xì)胞植入HSC中選擇性缺失NBR1的小鼠肝臟（Nbr1f/f; gmap - cre），與對(duì)照組（Nbr1f/f）小鼠相比，腫瘤負(fù)荷顯著降低（圖1N-1P）。這些結(jié)果表明，與p62相反，HSC中NBR1的缺乏會(huì)損害HCC的發(fā)展，并逆轉(zhuǎn)p62消融在HSC中的促瘤作用。

圖1 NBR1失活損害p62缺乏驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)的肝臟腫瘤發(fā)生

2. NBR1和p62在造血干細(xì)胞中拮抗調(diào)節(jié)IFN通路

為了闡明NBR1和p62調(diào)控的信號(hào)通路，解釋它們?cè)贖CC中的不同作用，作者進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）和基因集變異分析（GSVA），比較了WT、NBR1 -/-、Sqstm1-/-和Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的轉(zhuǎn)錄組。作者發(fā)現(xiàn)，與WT型HSC相比，Nbr1-/-中與IFN通路激活相關(guān)的信號(hào)顯著上調(diào)，這些信號(hào)在Sqstm1-/- HSC中被抑制，在Sqstm1-/-Nbr1-/- HSC中恢復(fù)（圖2A-2C）。這些觀察結(jié)果通過幾個(gè)IFN刺激基因的qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證（圖2D）。免疫組織化學(xué)分析顯示，在同時(shí)缺失Nbr1的Sqstm1-/- HSC的肝臟中，pSTAT1 （IFN激活的一個(gè)指標(biāo)）減少（圖2E-2G）。在共移植或內(nèi)源性HSC特異性小鼠模型中，Nbr1的缺失足以釋放IFN的高pSTAT1染色（圖2E-2J）。與HSC中p62或NBR1缺失導(dǎo)致的IFN通路的相反調(diào)控一致，作者發(fā)現(xiàn)Sqstm1-/- HSC模型的肝腫瘤中CD8+ T細(xì)胞缺失，NBR1缺失能夠通過促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)增加來挽救這種表型（圖2E-2J）。

圖2 NBR1和p62在造血干細(xì)胞中拮抗調(diào)節(jié)干擾素通路

3. HSCs中NBR1缺失產(chǎn)生的腫瘤保護(hù)反應(yīng)是由CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的

與CD8+ T細(xì)胞和IFN反應(yīng)是TME中關(guān)鍵的抗癌元件一致，中和了抗CD8抗體，有效地消耗了大約90%的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞，恢復(fù)了由Sqstm1-/- NBR1 -/- HSCs存在引起的腫瘤發(fā)展抑制（圖2K和2L）。腫瘤體積明顯增大（圖2M），抗cd8處理小鼠均出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移（圖2N、圖2O）。流式細(xì)胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄分析顯示，CD8+ T細(xì)胞的缺失完全恢復(fù)了Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC產(chǎn)生的IFN相關(guān)免疫反應(yīng)（圖2P和2Q）。這種反應(yīng)與免疫抑制細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞群的募集無關(guān)。這些結(jié)果表明，p62缺陷造血干細(xì)胞中NBR1的缺失誘導(dǎo)了依賴于IFN級(jí)聯(lián)的CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。

圖3 STING對(duì)造血干細(xì)胞中NBR1缺失的抗腫瘤活性至關(guān)重要

4. NBR1和p62對(duì)STING介導(dǎo)的IFN通路具有相反的調(diào)控作用

激活I(lǐng)FN通路的兩種主要機(jī)制包括cGAS/STING和RIG-I/MAVS級(jí)聯(lián)，它們分別是由細(xì)胞質(zhì)中雙鏈DNA （dsDNA）或雙鏈RNA （dsRNA）的存在誘導(dǎo)的為了研究這兩種信號(hào)通路對(duì)NBR1缺失驅(qū)動(dòng)的表型的貢獻(xiàn)，作者分別通過敲除Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中的STING （Tmem173基因）或MAVS來靶向這兩種機(jī)制。敲低STING可降低Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中pSTAT1和STAT1水平，并降低ifn相關(guān)基因的表達(dá)，而敲低MAVS則無影響（圖3A和3B）。通過干擾素調(diào)節(jié)因子3 （IRF3）的磷酸化確定，用dsDNA處理不同基因型的HSC導(dǎo)致STING信號(hào)級(jí)聯(lián)的更強(qiáng)激活，與WT HSC相比，Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC中干擾素調(diào)節(jié)因子3 （IRF3）的磷酸化在Sqstm1-/- HSC中顯著降低（圖3C和3D）。代表性ifn應(yīng)答基因在Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC中表達(dá)增強(qiáng)，但在Sqstm1-/- HSC中表達(dá)受損（圖3E）。用環(huán)GMP-AMP （cGAMP）刺激，一種直接的STING激動(dòng)劑，復(fù)制了Nbr1-/- HSC中IFN激活的增強(qiáng)和Sqstm1-/- HSC中IFN信號(hào)的受損（圖S3A和S3B），證明了Nbr1和p62對(duì)STING的直接作用獨(dú)立于cGAS。與WT型HSC相比，Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC顯示未磷酸化和磷酸化的STING水平升高，而Sqstm1-/- HSC則沒有（圖3C和3F）。體內(nèi)內(nèi)源性Nbr1缺失后，造血干細(xì)胞中STING水平也升高（圖3G-3I）。這些結(jié)果表明，盡管NBR1和p62通過STING拮抗IFN通路，但它們可能利用不同的機(jī)制。與此一致的是，NBR1過表達(dá)（NBR1 OV細(xì)胞）導(dǎo)致STING水平降低和IFN激活降低，而p62過表達(dá)（p62 OV細(xì)胞）增強(qiáng)了IFN通路的激活，但不改變STING含量。這表明雖然NBR1通過調(diào)節(jié)STING水平影響IFN通路，但p62使用不同的機(jī)制。

5. STING對(duì)造血干細(xì)胞中NBR1缺失的抗腫瘤活性至關(guān)重要

基于這些結(jié)果，作者假設(shè)Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的致瘤活性降低可能與STING介導(dǎo)的IFN級(jí)聯(lián)上調(diào)有關(guān)。在Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中，STING的敲低會(huì)損害pSTAT1的激活和Ifnb的表達(dá)。將STING缺陷HSC與DihXD3細(xì)胞共植入hfd喂養(yǎng)的WT小鼠的肝臟，在p62失活的情況下，NBR1缺陷的腫瘤抑制活性得以恢復(fù)（圖3J – 3O）。這種被拯救的表型包括肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率的增加，其程度與Sqstm1-/- shNT細(xì)胞相當(dāng)（圖3N和3O）。流式細(xì)胞術(shù)分析CD45+浸潤(rùn)細(xì)胞的結(jié)果顯示，DihXD3與Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT共植入造血干細(xì)胞時(shí)，IFNg的產(chǎn)生比與Sqstm1-/- shNT共植入造血干細(xì)胞時(shí)更多，以CD8+ T細(xì)胞為主，CD4+ T細(xì)胞較少（圖3P）。與這種增強(qiáng)的IFN反應(yīng)一致，與Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT細(xì)胞相比，Sqstm1-/- shNT造血干細(xì)胞顯著增加了巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性鏈II （MHCII）的表達(dá)，以及表達(dá)程序性死亡配體1（PD-L1）的非免疫細(xì)胞的百分比（圖3Q）。在Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT造血干細(xì)胞形成的腫瘤中，幾個(gè)IFN相關(guān)基因也有所增加（圖3R）。這些結(jié)果表明，p62缺陷造血干細(xì)胞中NBR1的缺失通過STING/ IFN依賴機(jī)制促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖4 NBR1而非p62通過控制其從高爾基體到溶酶體的運(yùn)輸來調(diào)節(jié)STING蛋白水平

6. NBR1而非p62通過溶酶體運(yùn)輸調(diào)節(jié)基礎(chǔ)STING水平

作者的研究結(jié)果表明，Nbr1-/- HSC，而不是Sqstm1-/- HSC，具有更高的基礎(chǔ)STING水平，并且Nbr1的過表達(dá)，而不是p62，誘導(dǎo)STING蛋白量的減少，獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄（圖4A和4B）。因此，作者假設(shè)NBR1在介導(dǎo)STING蛋白水解中具有潛在的選擇性作用。為了確定NBR1誘導(dǎo)STING降解的主要途徑，作者用蛋白酶體（MG132）或溶酶體（巴菲霉素A1 [BafA1]）抑制劑處理NBR1過表達(dá)（OV）和對(duì)照空載體（EV）造血干細(xì)胞。BafA1而不是MG132可以抑制NBR1誘導(dǎo)的STING降解（圖4C）。BafA1處理不僅阻斷了STING降解，還恢復(fù)了NBR1 OV細(xì)胞中pIRF3的激活（圖4D），支持STING溶酶體降解在NBR1控制IFN通路中的重要性。

圖5 NBR1和p62的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合調(diào)控STING信號(hào)傳導(dǎo)

貨物可以通過三種主要的降解途徑遞送到溶酶體：巨噬、內(nèi)體微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）。為了確定這些機(jī)制對(duì)NBR1誘導(dǎo)的溶酶體介導(dǎo)的STING降解的貢獻(xiàn)，作者使用特定的小干擾RNA （siRNA）選擇性地靶向每個(gè)途徑的關(guān)鍵組分：Atg5（大自噬）、Lamp2a （CMA）、Tsg101（運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合體[ESCRT]/內(nèi)體微自噬）和Rab7（參與從內(nèi)體到溶酶體運(yùn)輸?shù)腉TPase）。雖然Atg5或Lamp2a的敲低并不影響NBR1誘導(dǎo)的STING降解，但Tsg101或Rab7的敲低顯著消除了這種影響（圖4E和4F），這表明NBR1促進(jìn)STING降解的機(jī)制主要涉及escrt依賴性溶酶體途徑。這些結(jié)果與先前的報(bào)告一致，表明STING水平主要由escrt驅(qū)動(dòng)的微自噬途徑控制。

根據(jù)該模型，cGAMP與STING結(jié)合觸發(fā)其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）向順高爾基體、反式高爾基網(wǎng)絡(luò)和核內(nèi)體的易位。一旦STING到達(dá)核內(nèi)體，它通過ESCRT內(nèi)化成多泡體（MVBs）。rab7介導(dǎo)的MVBs與溶酶體融合后，STING在酸化的溶酶體環(huán)境中被降解（圖4G）。接下來，作者確定了NBR1是否在IFN通路激活期間調(diào)節(jié)STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到內(nèi)溶酶體的運(yùn)輸。NBR1或p62基因失活不影響cgamp觸發(fā)的STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖4H）。然而，NBR1缺乏癥阻礙了STING從高爾基體的出口，導(dǎo)致其長(zhǎng)時(shí)間滯留在這個(gè)細(xì)胞隔室中（圖4H）。STING在高爾基體停留時(shí)間的延長(zhǎng)可能促進(jìn)了TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IRF3的募集和磷酸化，從而促進(jìn)了NBR1缺陷造血干細(xì)胞中IFN信號(hào)的增強(qiáng)。一致地，作者發(fā)現(xiàn)STING向反式高爾基網(wǎng)絡(luò)（圖4I）以及其他后高爾基區(qū)室（如晚期核內(nèi)體（圖4J）和rab7陽性區(qū)室（圖4K）的進(jìn)展延遲，這也解釋了NBR1缺失的HSC中STING降解的減少。相比之下，p62缺失并不影響STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向不同細(xì)胞區(qū)室的運(yùn)輸（圖4H-4K），這與p62缺失不改變STING水平的事實(shí)是一致的（圖4A和4B）。因此，這些結(jié)果表明，NBR1驅(qū)動(dòng)STING及時(shí)從高爾基體中退出，確保了基礎(chǔ)STING的適當(dāng)穩(wěn)態(tài)降解（圖4L）。

7. NBR1和p62的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合調(diào)控STING信號(hào)傳導(dǎo)

考慮到p62和NBR1在STING介導(dǎo)的IFN通路中的拮抗作用，以及p62不會(huì)改變STING的基礎(chǔ)水平，作者接下來研究了它們?cè)谡{(diào)節(jié)STING信號(hào)傳導(dǎo)中的潛在作用。在過表達(dá)蛋白的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，NBR1和p62與STING相互作用。在基礎(chǔ)條件下，NBR1與STING的結(jié)合強(qiáng)于p62。然而，cGAMP刺激在p62募集的同時(shí)促進(jìn)了NBR1與STING的分離，其動(dòng)力學(xué)與IFN通路激活的動(dòng)力學(xué)一致。在造血干細(xì)胞中，內(nèi)源性蛋白的免疫沉淀（圖5A和5B）、免疫熒光實(shí)驗(yàn)中的共定位（圖5C和5D）以及鄰近結(jié)聯(lián)實(shí)驗(yàn)（圖5E和5F）也觀察到了NBR1和p62與STING在cGAMP刺激下的動(dòng)態(tài)相互作用。這些實(shí)驗(yàn)表明，NBR1在基礎(chǔ)條件下與STING結(jié)合，但在cGAMP刺激下釋放。相比之下，cGAMP促進(jìn)p62與STING的結(jié)合。與該模型一致，NBR1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與STING共定位，而cGAMP刺激后在ESCRT檢測(cè)到p62-STING共定位，分別用ER和ESCRT的標(biāo)志物Calnexin和HGS進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。這表明p62和NBR1與STING的相互作用可能是互斥的。事實(shí)上，共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，p62過表達(dá)破壞了基礎(chǔ)NBR1-STING復(fù)合物的形成（圖5G），這表明p62和NBR1在與STING相互作用方面存在競(jìng)爭(zhēng)。與該模型一致，p62缺陷導(dǎo)致NBR1與STING的組成性結(jié)合，這與IFN激活的損傷相關(guān)（圖5H）。通過共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和免疫熒光共定位檢測(cè)，cGAMP刺激觸發(fā)了時(shí)間依賴性的NBR1-p62相互作用（圖5I和5J）。由于它們各自的PB1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)p62和NBR1的相互作用，作者突變了p62的PB1結(jié)構(gòu)域（K7A）和NBR1的PB1結(jié)構(gòu)域（D50R），并證明它破壞了它們與STING的相互作用。然而，刪除泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域或其他結(jié)構(gòu)域并不影響這些相互作用。這些結(jié)果支持了一個(gè)模型，即NBR1與STING的結(jié)合被p62的誘導(dǎo)募集破壞，p62取代了NBR1（圖5K）。與此一致的是，順序共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，在cGAMP刺激下，p62、NBR1和STING沒有三聚體復(fù)合物，與STING結(jié)合的p62復(fù)合物不包括NBR1（圖5L）。

8. NBR1和p62在STING寡聚化中的相反作用

作圖實(shí)驗(yàn)表明，STING的二聚化結(jié)構(gòu)域都需要與NBR1和p62結(jié)合（圖5M）。在cGAMP刺激下，p62的缺失會(huì)破壞STING寡聚化，而Nbr1-/- HSC在基礎(chǔ)和刺激條件下顯示出增加的STING寡聚化（圖5N和5O）。由于STING的二聚化對(duì)其激活至關(guān)重要，31這些結(jié)果與Nbr1-/和Sqstm1-/- HSC在STING信號(hào)傳導(dǎo)上的相反表型一致。與此相一致的是，位于STING二聚體界面（人類STING中為N154S，小鼠STING中為N153S）的與嬰兒期起病的STING相關(guān)的血管病變（SAVI）患者相關(guān)的功能獲得突變降低了STING與NBR1的結(jié)合（圖5P）。這些結(jié)果支持NBR1在STING介導(dǎo)的IFN信號(hào)傳導(dǎo)中的負(fù)作用，通過控制STING基礎(chǔ)水平并阻止其在cGAMP刺激下的激活和寡聚化，而p62在cGAMP刺激下取代NBR1并促進(jìn)STING寡聚化及其激活。

圖6 NBR1和p62通過TRIM32調(diào)控STING泛素化

9. NBR1和p62通過TRIM32調(diào)控STING泛素化

鑒于泛素化在STING激活中的關(guān)鍵作用，作者接下來研究了NBR1和p62對(duì)其的潛在調(diào)控。與之前的報(bào)道一致，cGAMP刺激促進(jìn)了STING的泛素化，在Nbr1-/中增強(qiáng)，而在Sqstm1-/- HSC中降低，同時(shí)激活了pIRF3（圖6A）。一致地，NBR1的過表達(dá)抑制了STING泛素化，而p62的過表達(dá)促進(jìn)了STING泛素化（圖6B）。STING在k63鏈中泛素化。以NBR1為誘餌，通過鄰近依賴生物素化試驗(yàn)（BioID2）進(jìn)行無偏篩選，發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶三方基序蛋白（TRIM32）是NBR1的相互作用伙伴（圖6C）。這在異位表達(dá)HEK293細(xì)胞的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和造血干細(xì)胞的內(nèi)源性免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，表明TRIM32通過其UBA結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合NBR1而不是p62（圖6D）。Trim32敲低抑制了NBR1缺陷細(xì)胞中增強(qiáng)的STING泛素化和IFN信號(hào)傳導(dǎo)（圖6E和6F），證明了NBR1-TRIM32相互作用的功能相關(guān)性。TRIM32缺失嚴(yán)重?fù)p害了p62 OV細(xì)胞中增強(qiáng)的pIRF3誘導(dǎo)（圖6G）。TRIM32-缺陷細(xì)胞沒有顯示出STING含量的改變（圖6F和6G），表明TRIM32不控制STING降解，這與TRIM32促進(jìn)k63泛素化這一通常不是降解信號(hào)的事實(shí)一致。與此一致的是，TRIM32敲低后，STING的溶酶體運(yùn)輸沒有變化。TRIM32水平在NBR1缺陷細(xì)胞中上調(diào)，這表明，與STING的情況一樣，NBR1也控制著TRIM32的穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)水平（圖6E和6F）。這些發(fā)現(xiàn)確立了TRIM32在NBR1和p62拮抗調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的IFN信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

先前的數(shù)據(jù)表明，TRIM32介導(dǎo)的STING泛素化促進(jìn)了TBK1-STING相互作用，這是STING介導(dǎo)的IFN激活的關(guān)鍵步驟與NBR1和p62對(duì)STING泛素化的相反作用一致，NBR1的缺失增加，p62的缺失損害了TBK1與STING的結(jié)合（圖6H和6I）。通過繪制TRIM32誘導(dǎo)的STING泛素化位點(diǎn)，很明顯，STING泛素化缺陷突變體不與TBK1相互作用，但對(duì)其與NBR1或p62的相互作用沒有影響。另一方面，在Nbr1-/-細(xì)胞中觀察到的STING- tbk1相互作用增強(qiáng)與TRIM32向STING募集增加相關(guān)，而在Sqstm1-/-細(xì)胞中則受損，這表明p62通過與TRIM32相互作用促進(jìn)STING泛素化的關(guān)鍵作用，即使在Nbr1缺失的HSC中，TRIM32也不直接與p62相互作用（圖6D）。

作者的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)NBR1阻止TRIM32促進(jìn)STING泛素化。cGAMP刺激使NBR1與TRIM32分離，這一事實(shí)支持了這一觀點(diǎn)（圖6J-6L）。與作者的假設(shè)一致，NBR1過表達(dá)破壞了TRIM32與STING之間的相互作用（圖6M），表明NBR1負(fù)調(diào)控TRIM32-STING復(fù)合物的形成，阻礙了STING泛素化。p62的逐漸募集導(dǎo)致NBR1與STING的分離，促進(jìn)了TRIM32隨后與STING的關(guān)聯(lián)（圖6N），從而啟動(dòng)了IFN通路的激活。這些結(jié)果表明，NBR1和p62在IFN級(jí)聯(lián)中的相反作用是通過它們影響TRIM32誘導(dǎo)的STING泛素化的能力介導(dǎo)的，這是TBK1募集和IFN信號(hào)激活的關(guān)鍵事件（圖6O）。

圖7 在HCC進(jìn)展過程中，NBR1在HSC中上調(diào)，并與低STING水平相關(guān)

10. 在HCC進(jìn)展過程中，NBR1在HSC中上調(diào)，并與低STING水平相關(guān)

為了支持作者研究結(jié)果的生理學(xué)相關(guān)性，作者首先評(píng)估了HCC進(jìn)展過程中HSCs中p62和NBR1的表達(dá)。作者用OPAL-multiplex法對(duì)來自正常肝臟、MASH和HCC的人類臨床標(biāo)本進(jìn)行p62、NBR1和aSMA染色。與作者之前發(fā)表的數(shù)據(jù)一致，與正常肝臟相比，MASH和HCC樣本中HSC中的16p62水平降低（圖7A和7B）。相比之下，HSCs中的NBR1表達(dá)在從正常肝臟到MASH的過渡過程中逐漸增加，并在HCC中進(jìn)一步增加（圖7A和7B）。在兩種體內(nèi)損傷/纖維化小鼠模型中，HSCs中的NBR1水平一致地顯著升高。

為了驗(yàn)證p62和NBR1在人類標(biāo)本中IFN通路中的相反作用，作者首先查詢了公開可用的單細(xì)胞RNA測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)集，其中包括來自健康供體和HCC患者的HSC。來自腫瘤樣本的造血干細(xì)胞被標(biāo)記為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），根據(jù)NBR1和SQSTM1的表達(dá)進(jìn)行分類。該分析顯示，在NBR1低表達(dá)的HSC中，IFN應(yīng)答特征顯著富集，而在SQSTM1低表達(dá)的HSC中，IFN應(yīng)答特征顯著減少（圖S7C-S7N）。這些數(shù)據(jù)支持NBR1和p62在調(diào)節(jié)人類HSC中IFN信號(hào)通路中的相反作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NBR1在人類HCC中作為STING負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用，作者使用OPAL-multiplex分析了大量手術(shù)切除的HCC標(biāo)本。在組織微陣列（TMA）的287個(gè)樣本中，根據(jù)aSMA+細(xì)胞中NBR1的表達(dá)水平對(duì)200個(gè)樣本進(jìn)行分層（圖7C和7D）。偶然性分析顯示，與NBR1陰性染色的HCC患者相比，HSCs中可檢測(cè)到NBR1表達(dá)的HCC患者的STING陰性/低發(fā)生率更高（圖7E和7F）。與此一致的是，多變量logistic回歸分析表明，HSCs中NBR1陽性表達(dá)與STING低水平相關(guān)，獨(dú)立于其他病理特征（圖7G），表明NBR1在HCC人類腫瘤中調(diào)節(jié)IFN信號(hào)通路中起主要作用。多變量logistic回歸分析還表明，HSCs中NBR1的表達(dá)是低分化HCC的重要預(yù)測(cè)因子（圖7G），這表明HSCs中NBR1的表達(dá)對(duì)于產(chǎn)生免疫抑制微環(huán)境至關(guān)重要，該微環(huán)境通過STING-IFN級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)。

結(jié)論：

作者之前報(bào)道過p62的缺失破壞了一種機(jī)制，該機(jī)制通過維生素D受體（VDR）級(jí)聯(lián)的持續(xù)激活來維持造血干細(xì)胞處于靜止、未分化狀態(tài)因此，p62的缺失驅(qū)動(dòng)造血干細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，這是導(dǎo)致肝癌的促炎和纖維化微環(huán)境的原因。這些先前的數(shù)據(jù)和本文報(bào)道的數(shù)據(jù)提出了p62在肝臟炎癥中起雙重作用的模型。p62通過VDR級(jí)聯(lián)阻止HSC的活化，并通過STING控制NBR1拮抗的免疫監(jiān)視。作者的數(shù)據(jù)支持旨在消耗NBR1或損害其與STING相互作用的策略，以促進(jìn)CD8+驅(qū)動(dòng)的免疫療法在p62水平降低的HCC腫瘤中。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分析、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和免疫熒光、組織微陣列分析、原位接近結(jié)扎試驗(yàn)、免疫印跡和免疫沉淀試驗(yàn)、基于bioid2的篩選、基于bioid2篩選的LC-MS/MS分析、BioID數(shù)據(jù)分析、基因表達(dá)分析、生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)：

Nishimura, S., Linares, J. F., L'Hermitte, A., Duran, A., Cid-Diaz, T., Martinez-Ordo?ez, A., Ruiz-Martinez, M., Kudo, Y., Marzio, A., Heikenwalder, M., Roberts, L. R., Diaz-Meco, M. T., & Moscat, J. (2024). Opposing regulation of the STING pathway in hepatic stellate cells by NBR1 and p62 determines the progression of hepatocellular carcinoma. Molecular cell, S1097-2765(24)00782-2. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.09.026