IL-34介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細胞重編程是p53失活驅(qū)動的免疫逃逸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
作為癌癥中最常見的基因改變，超過一半的人類癌癥具有導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活的p53突變。然而，p53如何調(diào)節(jié)免疫圖譜以創(chuàng)造免疫逃逸的生態(tài)位仍然難以捉摸。作者發(fā)現(xiàn)癌癥干細胞（CSCs）中建立了白細胞介素-34（IL-34）調(diào)控的生態(tài)位來促進p53失活肝癌的腫瘤發(fā)生。機制上發(fā)現(xiàn)Il34是一個被p53轉(zhuǎn)錄抑制的基因，p53丟失導(dǎo)致CSCs分泌IL-34。IL-34誘導(dǎo)CD36介導(dǎo)的脂肪酸氧化代謝升高，驅(qū)動泡沫樣腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）的M2極化。IL-34調(diào)節(jié)TAMs抑制CD8+T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫以促進免疫逃逸。阻斷IL-34-CD36軸引起抗腫瘤免疫，并與抗PD-1免疫治療協(xié)同作用。本研究結(jié)果揭示了p53調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的潛在機制，并為p53失活的癌癥免疫治療提供了潛在的靶點。
該研究于2024年10月8日發(fā)表在《Immunity》，IF：25.5
機制圖
主要研究結(jié)果
1. IL-34是p53失活驅(qū)動的腫瘤發(fā)生所必需的
為了了解p53如何調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，用CRISPR-Cas9和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)生成p53缺陷（Trp53null）（Trp53+Pten，Trp53+Kras）和p53野生型（Trp53WT）（Ctnnb1+Pten，Kras+Pten）的自發(fā)性肝癌模型。接下來對Trp53WT和Trp53null腫瘤進行了RNA-seq。細胞因子是腫瘤微環(huán)境中細胞通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，決定腫瘤微環(huán)境的組成。通過對RNA-seq數(shù)據(jù)的分析，注意到IL-34是Trp53null腫瘤上調(diào)基因中最明顯增加的細胞因子（圖1A）。q-PCR、ELISA和免疫印跡顯示，與WT肝臟、CCl4處理的肝臟和Trp53WT腫瘤相比，Trp53null腫瘤中IL-34的表達明顯更高（圖1B）。此外，從自發(fā)性肝癌模型中提取原發(fā)腫瘤細胞用于隨后的機制和移植實驗，其中PT細胞來自Trp53null腫瘤（Trp53+Pten），CT細胞來自Trp53WT腫瘤（Ctnnb1+Pten）。
為確定哪個細胞亞群在腫瘤微環(huán)境中分泌IL-34，對Trp53null（Trp53+Pten）和Trp53WT（Ctnnb1+Pten）腫瘤進行了單核RNA測序（snRNA-seq；10×Genomics）。在數(shù)據(jù)的質(zhì)量過濾后，使用Seurat進行的無監(jiān)督聚類分析產(chǎn)生了14個聚類，然后使用已知的標記對每個聚類進行注釋。通過分析snRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Il34在Trp53null腫瘤中的表達明顯高于Trp53WT腫瘤。在Trp53null腫瘤中，CSCs表現(xiàn)出強烈的IL-34表達，而在所有其他細胞類型中，IL-34的表達都很弱（圖1C-1F）。多重免疫組化染色顯示，IL-34和EpCAM在Trp53null腫瘤中共同定位（圖1G）。這些結(jié)果表明，在Trp53null腫瘤中，CSCs優(yōu)先分泌IL-34。這些結(jié)果共同表明p53失活的CSCs是分泌IL-34的主要細胞亞群。
為研究IL-34對Trp53null肝癌發(fā)展的潛在影響，首先評估了IL-34過表達的自發(fā)性肝癌模型（Ctnnb1+Pten）的進展，發(fā)現(xiàn)IL-34過表達顯著加速了Trp53WT肝癌的進展。接下來生成了IL34-/-小鼠，然后注射Trp53+Pten或Trp53+Myc質(zhì)粒來誘導(dǎo)自發(fā)性Trp53null肝癌。與Il34+/-對照組相比，在Il34-/-小鼠中沒有觀察到Trp53null肝癌的腫瘤發(fā)生，病理學(xué)家將接受Trp53+Pten質(zhì)粒的Il34?/-小鼠中的小病變確定為脂肪變性，而不是癌前病變或結(jié)節(jié)（圖1H-1K）。這些發(fā)現(xiàn)表明白細胞介素-34是p53失活驅(qū)動的腫瘤發(fā)生所必需的。
圖1：p53失活的CSC異常高分泌IL-34促進肝癌發(fā)生
2. p53功能缺失直接觸發(fā)IL-34分泌
考慮到在p53失活的CSCs中觀察到IL-34高表達，并考慮到p53作為轉(zhuǎn)錄因子的已知功能，推測p53可能抑制Il34轉(zhuǎn)錄。在CT細胞（Trp53+/+）和AML12細胞（小鼠肝細胞系）中，Trp53的基因缺失導(dǎo)致用Nutlin-3預(yù)處理細胞時無法增加p21的表達（圖2A和2E）。事實上，觀察到Trp53的基因缺失導(dǎo)致IL-34的表達上調(diào)（圖2B-2D和2F）。相比之下，在PT細胞中Trp53過表達時，IL-34轉(zhuǎn)錄被顯著抑制（Trp53-/-）（圖2G）。
與小鼠數(shù)據(jù)一致，HepG2細胞（人肝癌細胞，TP53WT）中TP53基因缺失后IL-34表達上調(diào)（圖2H-2J）。為了確定p53是否結(jié)合IL-34的調(diào)節(jié)區(qū)域，使用p53抗體進行ChIP及高通量測序。在IL34和CDKN1A（p21）位點觀察到p53結(jié)合（圖2K）。ChIP-PCR和DNA下拉分析還顯示p53結(jié)合到IL34啟動子（圖2L和2M）。這些結(jié)果表明p53直接抑制IL34轉(zhuǎn)錄。接下來探究p53是否調(diào)節(jié)IL34啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。構(gòu)建含有IL34啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒（轉(zhuǎn)錄起始位點-2kb），并與WT p53過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。與空載體相比，p53過表達導(dǎo)致標準化熒光素酶活性降低（圖2N）。請注意，當與突變型p53（R249S或R175H）共轉(zhuǎn)染時，沒有觀察到這些降低（圖2O）。為確定IL34啟動子上的結(jié)合區(qū)域，截斷了IL34啟動子，并注意到當從-1,200到-800的區(qū)域缺失時，p53的調(diào)節(jié)活性喪失（圖2P）。值得注意的是，一個一致的p53結(jié)合位點（RRRCWWGYYY）34位于IL34啟動子的-858至-838（圖2Q），并突變該結(jié)合位點廢除了WT p53過表達時熒光素酶活性的降低（圖2R），這些數(shù)據(jù)表明p53直接抑制IL34轉(zhuǎn)錄，p53缺失和突變p53都失去了對IL34的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。
圖2：p53功能喪失直接觸發(fā)IL-34分泌
3. IL-34誘導(dǎo)的促腫瘤泡沫樣巨噬細胞在p53失活的CSCs附近聚集
鑒于IL-34是一種參與單核細胞增殖、存活和分化為巨噬細胞的細胞因子，接下來通過CIBERSORT36調(diào)查肝臟腫瘤免疫細胞的組成，發(fā)現(xiàn)IL-34表達與巨噬細胞比例之間存在正相關(guān)關(guān)系。此外，snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示Trp53null腫瘤中巨噬細胞的比例明顯高于Trp53WT腫瘤中的比例。然后對Trp53null腫瘤進行了空間轉(zhuǎn)錄組測序（10×Genomics）和注釋。發(fā)現(xiàn)許多MDMs（Lyz2，Cx3cr1）分布在IL34+細胞周圍（圖3A）。多重免疫組化染色進一步證實TAMs在Trp53null腫瘤中分泌IL-34的CSC附近積累（圖3B）。接下來想探究Trp53null腫瘤中TAMs的特征，并對Trp53null和Trp53WT腫瘤中的TAMs進行分類，以進行RNA-seq。GO分析顯示，Trp53null腫瘤中的TAMs富集與促進巨噬細胞向泡沫細胞分化相關(guān)的基因。GSEA表明，Trp53null腫瘤中的TAMs富集了脂滴特征。接下來使用BODIPY脂肪酸探針對TAMs進行染色：Trp53null腫瘤中的TAMs比Trp53WT腫瘤中的TAMs積累了更多的脂肪酸，并形成了更多的脂滴（圖3C和3D）。表明Trp53null腫瘤中的TAMs類似于泡沫樣巨噬細胞。
為確定p53失活的CSCs是否通過IL-34誘導(dǎo)這些TAMs，首先使用IL-34在體外治療BMDMs，發(fā)現(xiàn)IL-34暴露顯著增加細胞內(nèi)脂肪酸并促進BMDMs中脂滴的形成（圖3E和3F）。此外，IL-34暴露還上調(diào)了M2相關(guān)標志物（例如，MRc1、Arg1、Ccl2、TGFβ和IL-10）的表達。值得注意的是，CCL2負責(zé)CCR2+單核細胞的招募。接下來，將BMDM與Trp53+/+或Trp53-/-腫瘤細胞共同培養(yǎng)，并檢測來自Trp53+/+或Trp53-/-腫瘤的TAMs。與Trp53-/-腫瘤細胞培養(yǎng)的BMDM和來自Trp53-/-腫瘤的TAMs積累了更多的脂肪酸，并且更傾向于促腫瘤表型。請注意，Trp53-/-腫瘤細胞中Il34的基因缺失消除了BMDM和TAMs的這些變化（圖3G、3H）。這些結(jié)果支持IL-34負責(zé)促進Trp53null腫瘤中TAMs的脂質(zhì)積累和促腫瘤極化。
圖3：IL-34在CSCs附近誘導(dǎo)p53失活的泡沫樣TAMs
4. IL-34通過CD36促進脂肪酸攝取，并通過FAO代謝重編程誘導(dǎo)巨噬細胞的促腫瘤極化
接下來想知道IL-34如何促進TAMs中的脂質(zhì)積累。因此使用脂肪酸BODIPY FL C12探針進行了測定，發(fā)現(xiàn)IL-34暴露的BMDMs中脂肪酸攝取顯著較高（圖4A）。RNA-seq分析顯示，IL-34暴露的BMDMs中CD36的表達升高），CD36與長鏈脂肪酸的結(jié)合有高親和力。qPCR和流式細胞術(shù)分析證實，IL-34處理導(dǎo)致BMDMs中CD36表達顯著增加（圖4B和4C）。然而，在使用CD36抑制劑磺基琥珀酰亞胺油酸酯（SSO）或CD36抗體預(yù)處理BMDMs時，IL-34暴露并沒有促進巨噬細胞脂質(zhì)積累（圖4D和4E），這支持了CD36是TAMs脂肪酸含量升高的原因。PPAR-γ是編碼具有脂質(zhì)調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括CD36。因此推測IL-34可能通過上調(diào)PPAR信號活性來促進CD36的表達。
先前的研究表明，IL-4通過代謝重編程誘導(dǎo)M2樣巨噬細胞極化，從而顯著提高脂肪酸氧化（FAO）作為能量來源。IL-34可能誘導(dǎo)類似的代謝重編程以促進巨噬細胞M2樣巨噬細胞極化的想法，GSEA分析表明，在IL-34暴露的BMDM中，F(xiàn)AO基因被富集和上調(diào)（圖4F）。與糖酵解相比，F(xiàn)AO消耗更多的氧并產(chǎn)生更多的ATP。Seahorse分析表明，IL-34暴露增加了BMDM的氧消耗，并且這種增加在用FAO酶CPT1的抑制劑（依托莫昔爾）預(yù)處理細胞時被阻止（圖4G）。這些發(fā)現(xiàn)共同支持IL-34可以誘導(dǎo)巨噬細胞向FAO能量代謝重編程。然而，作者又注意到IL-34暴露并沒有引起CD36沉默的RAW264.7細胞（巨噬細胞系）耗氧量和M2樣巨噬細胞極化的增加（圖S4E-S4H）。在用SSO或依托莫西預(yù)處理BMDMs時，IL-34暴露也沒有促進M2樣巨噬細胞極化（圖4H和4I）。也就是說，當CD36和FAO被破壞時，IL-34無法誘導(dǎo)巨噬細胞M2樣的巨噬細胞極化，這支持了它們是巨噬細胞極化過程的重要組成部分。由于IL-34誘導(dǎo)CD36表達，并且IL-34和CD36都是向FAO重編程所必需的，提出了“IL-34-CD36軸”負責(zé)形成泡沫樣的促腫瘤TAMs。
圖4：IL-34通過CD36促進脂肪酸攝取并通過FAO代謝重編程誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化
5. IL-34-CD36介導(dǎo)的代謝重編程以驅(qū)動Trp53null腫瘤中TAMs的促腫瘤極化
接下來研究了IL-34-CD36軸在Trp53null腫瘤中泡沫樣促腫瘤TAMs中的參與。首先與Trp53+/+或Trp53-/-腫瘤細胞共同培養(yǎng)BMDMs。與Trp53+/+腫瘤細胞培養(yǎng)的BMDMs相比，用Trp53+/+腫瘤細胞培養(yǎng)的BMDMs中CD36和FAO基因Cpt1a的表達顯著高于用Trp53+/+腫瘤細胞培養(yǎng)的BMDMs（圖5A和5B）。值得注意的是，Trp53-/-腫瘤細胞中Il34的基因缺失消除了BMDMs中CD36和Cpt1a的表達增加（圖5C和5D）。因此，Trp53-/-腫瘤細胞分泌的IL-34可以誘導(dǎo)巨噬細胞中的CD36表達和FAO誘導(dǎo)。還重新分析了Trp53null肝臟腫瘤的snRNA-seq數(shù)據(jù)，并注意到CD36的表達在MDMs中最高。MDM的KEGG分析表明富集了包括脂肪酸降解和脂肪酸代謝在內(nèi)的途徑。流式細胞術(shù)分析還顯示，Trp53null肝臟腫瘤的TAMs中CD36的表達明顯高于Trp53WT肝臟腫瘤的TAMs（圖5E）。請注意，通過多重免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)Trp53null肝臟腫瘤中確實存在特異性表達CD36的TAMs群體（圖5F）。這些發(fā)現(xiàn)共同支持IL-34誘導(dǎo)CD36介導(dǎo)的脂肪酸代謝變化，以驅(qū)動Trp53null腫瘤中泡沫樣巨噬細胞的M2樣巨噬細胞極化。為了提供IL-34-CD36軸促進體內(nèi)TAM脂質(zhì)積累和M2樣巨噬細胞極化的直接證據(jù)，首先構(gòu)建了IL-34過表達的CT細胞（Trp53+/+）和IL-34消融的PT細胞（Trp53-/-），然后將這些細胞皮下接種到小鼠體內(nèi)，觀察到IL-34過表達腫瘤中TAMs的百分比高于CT腫瘤，IL-34過表達顯著增加了TAMs中CD36和CD206的表達以及脂質(zhì)含量。這些結(jié)果共同證明了IL-34-CD36軸驅(qū)動Trp53null腫瘤中泡沫樣巨噬細胞的M2樣巨噬細胞極化。
圖5：IL-34協(xié)調(diào)CD36介導(dǎo)的代謝重編程以驅(qū)動Trp53null腫瘤中TAMs的促腫瘤極化
6. IL-34調(diào)控的TAMs抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，促進腫瘤免疫逃逸
接下來討論了IL-34誘導(dǎo)的TAMs在腫瘤發(fā)育中的作用，觀察到IL-34在PT腫瘤中的遺傳缺失導(dǎo)致小鼠明顯的生長受限（圖6A）。然而，通過注射氯膦酸脂質(zhì)體對巨噬細胞的系統(tǒng)性消耗消除了IL-34缺陷的PT腫瘤和對照PT腫瘤之間腫瘤生長的差異（圖6A、6B）。這些數(shù)據(jù)表明IL-34調(diào)控的TAMs促進腫瘤免疫逃避。
TAMs可以通過抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫來促進腫瘤免疫逃逸，從snRNA-seq數(shù)據(jù)來看，Trp53null腫瘤中腫瘤浸潤T細胞的比例明顯低于Trp53WT腫瘤。接下來研究了腫瘤浸潤T細胞的特征，并將Trp53null和Trp53WT肝臟腫瘤中的T細胞（CD45+CD3+）進行了RNA-seq。差異基因分析顯示，Trp53null腫瘤中的T細胞比Trp53WT腫瘤中的T細胞具有更高的耗盡標志物表達（例如，Pdcd1，Ctla4，Lag3和havcr2）（圖6C）。流式細胞術(shù)顯示，Trp53null腫瘤中的CD8+T細胞產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α低于Trp53WT腫瘤（圖6D）。接下來從Trp53null和Trp53WT肝腫瘤中篩選TAMs，并將它們與脾T細胞共同培養(yǎng)用于體外T細胞抑制試驗：來自Trp53null腫瘤的TAMs對T細胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生的抑制能力強于來自Trp53WT肝腫瘤的TAMs。這些數(shù)據(jù)表明來自Trp53null腫瘤的TAMs可能抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。值得注意的是，PT（Trp53?/?）腫瘤中IL-34的基因缺失導(dǎo)致腫瘤浸潤性T細胞增加（圖6E）。來自IL-34缺陷PT腫瘤的腫瘤浸潤性T細胞比來自對照PT腫瘤的T細胞表達較低的PD-1和較高的IFN-γ和TNF-α（圖6F-6H）。類似地，TAMs上CD36的條件性基因缺失導(dǎo)致PT腫瘤明顯的生長限制，但沒有導(dǎo)致CT（Trp53+/+）腫瘤（圖6I），并導(dǎo)致PT腫瘤中腫瘤浸潤性T細胞增加（圖6J）。然而，當小鼠接受CD8抗體腹腔注射時，IL-34缺陷PT腫瘤和對照PT腫瘤中腫瘤生長的差異完全丟失（圖6K）。這些數(shù)據(jù)共同表明，IL-34-CD36軸編排的TAMs通過抑制Trp53null肝癌中T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫來促進腫瘤逃逸免疫。
圖6：IL-34調(diào)控的TAMs抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，促進腫瘤免疫逃逸
7. 阻斷IL-34信號可作為TP53突變癌癥的潛在免疫療法
鑒于IL-34-CD36軸誘導(dǎo)的TAMs在Trp53缺失的肝臟腫瘤中促進腫瘤免疫逃避，想了解阻斷IL-34-CD36軸是否可以抑制腫瘤生長。用IL-34或CD36的中和抗體處理Trp53?/?PT荷瘤小鼠。IL-34或CD36的抗體阻斷導(dǎo)致腫瘤生長明顯受限（圖7A和S7A）。通過IL-34或CD36的抗體阻斷，單核細胞TAMs的比例顯著降低，TAMs的脂質(zhì)含量和CD206表達降低。此外，阻斷IL-34或CD36導(dǎo)致T細胞浸潤和產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的T細胞百分比顯著增加。值得注意的是，抗IL -34和抗CD6聯(lián)合治療PT荷瘤小鼠，對小鼠的生長限制更強，存活時間明顯延長（圖7B和7C）。這些數(shù)據(jù)表明，IL-34-CD36軸是p53失活肝癌的潛在治療靶點。
與之前的報道一致，皮下和肝臟接種的Trp53-PT腫瘤對抗PD-1治療沒有反應(yīng)（圖7D-7F）。然而，Il34的基因缺失與抗PD-1聯(lián)合強烈協(xié)同抑制腫瘤生長，導(dǎo)致高達75%的病例完全緩解（圖7D-7F）。隨后通過再次治療完全緩解的小鼠來檢查聯(lián)合阻斷是否賦予長期免疫。注意到與新生小鼠相比，再次治療的小鼠仍然可以拒絕PT腫瘤（圖7G）。IL-34，CD36和PD-1的聯(lián)合治療完全阻斷了Trp53-PT腫瘤的發(fā)展（圖7H），甚至在已建立的較大腫瘤中引起強烈的生長限制（圖7I和7J）。之后研究了IL-34在TP53突變的人肝癌中的高表達是否會增加CD36+促腫瘤巨噬細胞的浸潤。對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析顯示，TP53突變的肝癌比TP53 WT的肝癌有更大程度的巨噬細胞浸潤。通過利用TISIDB網(wǎng)站，IL34的表達與巨噬細胞的浸潤豐度呈正相關(guān)。通過利用TIMER 2.0網(wǎng)站，IL34的表達與CD36、TGFB1和CCL2的表達呈正相關(guān)。對TP53突變肝癌的公共單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)的分析表明，高表達IL34的腫瘤細胞和TAMs表現(xiàn)出CD36的強勁表達，而它們在所有其他細胞類型中的表達都很弱。此外染色顯示，與TP53 WT相比，TP53突變的肝癌增加了CD36+TAM浸潤，接受ICI治療的TP53突變的癌癥患者總生存率較低?？偟膩碚f，研究結(jié)果表明阻斷IL-34信號可能是TP53突變癌癥患者的潛在免疫治療。
圖7：阻斷IL-34信號通路抑制p53失活誘導(dǎo)的肝癌生長
結(jié)論
本項研究中，作者揭示了 IL-34 在腫瘤細胞中表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。作者發(fā)現(xiàn) IL-34 被 p53 轉(zhuǎn)錄抑制，p53 轉(zhuǎn)錄功能的喪失導(dǎo)致 IL-34 表達上調(diào)，從而塑造了驅(qū)動腫瘤免疫逃逸的免疫抑制生態(tài)位。因此，IL-34 塑造腫瘤微環(huán)境是 p53 失活腫瘤的常見特征，阻斷 IL-34 信號傳導(dǎo)可作為靶向 p53 泛突變的治療策略。
實驗方法
動物實驗?zāi)Ｐ秃脱芯繀⑴c者詳細信息；CRISPR Cas9等構(gòu)建質(zhì)粒；自發(fā)性肝癌模型；流式細胞儀和細胞分選；ELISA；線粒體、脂肪酸攝取和脂質(zhì)含量測定；細胞能量代謝分析；熒光素酶報告基因測定；T細胞抑制試驗；RNA-Seq和數(shù)據(jù)分析；DNA pull-down；單核RNA測序和數(shù)據(jù)分析；空間轉(zhuǎn)錄組測定；腫瘤移植、抗體治療和巨噬細胞耗盡；分析TCGA/ICGC數(shù)據(jù)和公共scRNA-seq數(shù)據(jù)
參考文獻
Nian Z, Dou Y, Shen Y, Liu J, Du X, Jiang Y, Zhou Y, Fu B, Sun R, Zheng X, Tian Z, Wei H. Interleukin-34-orchestrated tumor-associated macrophage reprogramming is required for tumor immune escape driven by p53 inactivation. Immunity. 2024 Oct 8;57(10):2344-2361.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2024.08.015. Epub 2024 Sep 24. PMID: 39321806. IF: 25.5 Q1.