高級別漿液性卵巢癌 PTEN 丟失與巨噬細胞動力學(xué)的關(guān)系
高級別漿液性卵巢癌(HGSC)仍然是一種預(yù)后不良的疾病，對目前的免疫檢查點抑制劑無反應(yīng)。雖然 PI3K 途徑的改變，如 PTEN 缺失，在 HGSC 很常見，但是針對這一途徑的嘗試并不成功。我們假設(shè)異常的 PI3K 途徑激活可能改變 HGSC 免疫微環(huán)境并提供靶向機會。單細胞 RNA 測序鑒定了小鼠模型中特異于 Pten 無效網(wǎng)膜腫瘤的駐留巨噬細胞群體，流式細胞術(shù)證實了這一點。這些巨噬細胞來源于腹腔液巨噬細胞，表現(xiàn)出獨特的基因表達程序，以血紅素加氧酶 -1(HMOX1)的高表達為標志。靶向腹腔巨噬細胞阻止了 HMOX1hi 巨噬細胞的出現(xiàn)，減少了腫瘤的生長。此外，直接抑制 HMOX1延長體內(nèi)存活。RNA 測序鑒定了 Pten 缺失腫瘤細胞中的 IL33作為可能的候選驅(qū)動因子，導(dǎo)致了 HMOX1hi 巨噬細胞的出現(xiàn)。人類 HGSC 腫瘤中也含有 HMOX1hi 巨噬細胞及其相應(yīng)的基因表達程序。此外，這些巨噬細胞的存在與激活的腫瘤 PI3K/mTOR 信號傳導(dǎo)和 HGSC 患者的總生存率差有關(guān)。相比之下，HMOX1hi 巨噬細胞數(shù)量少的腫瘤表現(xiàn)為適應(yīng)性免疫應(yīng)答基因表達增加。這些數(shù)據(jù)表明靶向 HMOX1hi 巨噬細胞是治療不良預(yù)后 HGSC 的一種潛在的治療策略。本文于2024年11月發(fā)表于《Cancer Immunology》，IF：12.5
研究技術(shù)路線：
研究結(jié)果：
1. Pten-null細胞依賴于腫瘤微環(huán)境加速腫瘤生長
為了解決 PTEN 缺失如何影響 HGSC 生長，我們利用匹配的 ID8細胞，單獨使用 Trp53或我們以前產(chǎn)生的 Trp53和 PTEN 中的失活突變。使用多個單獨的克隆，我們證實在腹膜內(nèi)注射后，與 Trp53-/-相比，Trp53-/-; Pten-/-ID8細胞導(dǎo)致顯著縮短的存活(圖1A)。如前所述，Pten 缺失在2D 高附著條件下(圖1B 和 C) ，包括具有額外的 Brca2突變(圖1D)以及在低血清和血清饑餓條件下(圖1E) ，提示增強的腹膜內(nèi)生長不是腫瘤細胞固有的。
腫瘤細胞必須抵抗失巢凋亡，然后在低附著條件下生長，以促進 HGSC 的腹膜播散。Trp53-/-和 Trp53-/-; Pten-/-ID8克隆在體外低附著條件下形成球狀簇，但隨著時間的推移，兩種基因型的收縮率是相等的(圖1F)。在體內(nèi)，Pten 丟失在腹腔注射后沒有立即的生存優(yōu)勢(圖1G)。S1C)。然而，注射后14天，腹腔液中 Pten 無效細胞顯著擴增(圖1G)。此外，在注射 Trp53-/-； Pten-/-細胞的小鼠中，HGSC 轉(zhuǎn)移的主要部位網(wǎng)膜中的腫瘤負荷在第14天更大，在第25至28天顯著更大(圖1H)。
為了確保我們的發(fā)現(xiàn)不是 ID8特異性的，我們使用了 HGS2，一種由 Trp53fl/fl，Brca2fl/fl，Ptenfl/fl，Pax8Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的腫瘤產(chǎn)生的細胞系。我們使用慢病毒在 HGS2中重新表達 Pten，這并不影響倍增時間在二維高附著(圖1I)或形成球體的能力在低附著(圖1J)。但與對照病毒感染的細胞相比，在體內(nèi)產(chǎn)生較小的網(wǎng)膜腫瘤(圖1K)。總之，這些數(shù)據(jù)強烈表明腹膜微環(huán)境支持 Pten 無效腫瘤的加速生長。
Figure 1 Pten-null細胞依賴于腫瘤微環(huán)境加速腫瘤生長
2. Pten-null腫瘤細胞增強了網(wǎng)膜內(nèi)駐留樣巨噬細胞的積累
我們假設(shè)巨噬細胞支持 Pten-null腫瘤的播種和生長。在小鼠的腹膜腔和網(wǎng)膜中存在兩個主要的巨噬細胞群體: 不斷由血液 Ly6Chi 單核細胞補充的 F4/80loMHCIIhi 單核細胞來源的巨噬細胞和胚胎來源的 F4/80hiMHCIIlo 駐留巨噬細胞，它們都是自我維持和從當(dāng)?shù)氐?/span> F4/80loMHCIIhi 庫中補充的。在確認了我們的門控策略的特殊性之后，我們首先評估了巨噬細胞/單核細胞群在腫瘤生長過程中的變化。ID8細胞注射1天內(nèi)引起 Ly6Chi 單核細胞流入腹腔液。在 Trp53-/-; Pten-/-注射的小鼠中，這種浸潤在第14天顯著增加(圖2A)?？赡軄碓从谠搯魏思毎麕斓?/span> F4/80loMHCIIhi 巨噬細胞的增加(圖2B)在 Trp53-/-; Pten-/-注射后14天也是明顯的。在 Trp53-/-; Pten-/-注射的小鼠中，網(wǎng)膜駐留的 F4/80hiMHCIIlo 群體在第14天增加(圖2C)。有趣的是，在第28天，當(dāng)兩種基因型都有相當(dāng)大的腫瘤負荷時，Trp53-/-; Pten-/-網(wǎng)膜腫瘤在多個亞克隆中含有顯著更多的駐留樣巨噬細胞(圖2D)。此外，大約40% 的駐留樣巨噬細胞表達長期駐留標記 TIM4 + ，表明它們不是新招募的(圖2E 和 F)。
我們還使用了具有或不具有 Pten-null的 Trp53-/-; Brca2-/-ID8細胞。單獨的 Brca2缺失并不影響駐留巨噬細胞的擴張(圖2G)。然而，Pten 的額外缺失再次顯著增加了駐留巨噬細胞的密度(圖2G) ，這與單核細胞來源的巨噬細胞和 T 細胞的相對缺乏相結(jié)合(圖2H 和 I)。這與體內(nèi)侵略性的增加有關(guān)。除了 Pten 之外，Brca2的缺失拯救了單獨使用 Pten 損失觀察到的單核細胞衍生的巨噬細胞和 T 細胞的募集(圖2J 和 K) ，表明 Pten 缺失特異性地改變駐留巨噬細胞而不是誘導(dǎo)免疫微環(huán)境中的全局變化。
為了確定駐留巨噬細胞是否是Pten-null網(wǎng)膜腫瘤生長的驅(qū)動因素，我們首先在腫瘤接種之前使用腹膜內(nèi)氯膦酸鹽包封的脂質(zhì)體(CEL)耗盡所有巨噬細胞。這種泛巨噬細胞的消耗完全阻止了 Trp53-/-; Pten-/-網(wǎng)膜腫瘤的形成和腹水的產(chǎn)生(圖2L)。不幸的是，如先前報道的，CEL 注射后觀察到的高死亡率阻礙了我們機構(gòu)使用 CEL 的進一步研究。為了進一步解剖巨噬細胞對 Pten-null腫瘤生長的貢獻，我們利用缺乏 Ccr2的一個(Ccr2RFP/+)或兩個拷貝(Ccr2RFP/RFP)的小鼠，因此顯著減少了骨髓單核細胞的出口。正如預(yù)期的那樣，Ccr2RFP/+ 和 Ccr2RFP/RFP 小鼠的腹膜液和網(wǎng)膜中的單核細胞和單核細胞來源的巨噬細胞顯著減少，駐留巨噬細胞庫沒有改變。引人注目的是，Ccr2的缺失顯著增加了 Trp53-/-; Pten-/-注射的小鼠中的腫瘤負荷和腹水體積(圖2M) ，表明單核細胞衍生的巨噬細胞在 Pten-null腫瘤接種和生長期間具有保護性抗腫瘤作用。
Figure 2 Pten-null的腫瘤細胞增強了網(wǎng)膜內(nèi)駐留樣巨噬細胞的積累
3. Pten-null腫瘤驅(qū)動一個獨特的 HMOX1hi 巨噬細胞亞群的出現(xiàn)
巨噬細胞表型不能簡化為二元 M1/M2標記物表達，網(wǎng)膜腫瘤中存在多種不同的亞型。因此，我們使用 SMART-Seq2方案對來自網(wǎng)膜腫瘤的流式分選巨噬細胞進行 scRNA-seq。統(tǒng)一流形近似和投影聚類顯示了五個不同的聚類(圖3A 和 B)。簇0表達在單核細胞衍生的巨噬細胞中經(jīng)典發(fā)現(xiàn)的基因，包括 MHCII 相關(guān)分子(H2-Eb1，H2-DMb2，H2-DMb1，H2-Ab1，Cd74，H2-Oa 和 H2-Aa) ，趨化因子受體 Ccr2，Cx3cr1和共刺激分子 Cd86。通過流式細胞術(shù)，簇0也定位于 F4/80loMHCIIhi 區(qū)(圖3C)。簇1和簇3均表達腹膜巨噬細胞定義的基因。簇1表達 Fcna (ficolin 1) ，Fn1(纖連蛋白1)和類視黃醇 X 受體 Rxra，并且通過流式細胞術(shù)主要位于 F4/80loMHCIIhi 區(qū)域(圖3C)。簇3表達更多的經(jīng)典腹膜駐留基因，包括 Ltbp1，Garnl3，Serpinb2，Alox15，Selp，F5，Timd4，Icam2(CD102)和 Gata6。通過流式細胞術(shù)定位于 F4/80hiMHCIIlo 區(qū)域的簇3(圖3C) ，其與 TIM4(Timd4)的表達一起表明簇1是轉(zhuǎn)變成簇3的單核細胞衍生的前體。簇4表達的基因通常在上皮細胞或間皮細胞(Krt18，Krt19，Msln，Wt1)中發(fā)現(xiàn)，這表明它們可能是吞噬巨噬細胞。
最有趣的簇是簇2，它幾乎完全在 Trp53-/-，Pten-/-腫瘤中發(fā)現(xiàn)(圖3A 和 B) ，并且具有高表達的 HMOX1(Hmox1) ，這是一種酶，催化血紅素分解成一氧化碳，鐵(Fe2 +)和膽綠素。簇2還表達參與脂質(zhì)積累的基因，如 Trib3(Tribbles 假激酶 -3)和 Lgals3(半乳糖凝集素3) ，以及防止重金屬毒性的基因，如金屬硫蛋白 Mt1和 Mt2。簇2還表達了與免疫抑制相關(guān)的基因，包括 Cd274(PD-L1) ，Arg1(精氨酸酶1)和 Vegfa。通過流式細胞術(shù)，簇2主要定位于 F4/80hiMHCIIlo 區(qū)域，表明它可能來源于腹膜巨噬細胞(圖3C)。我們使用 Monocle3進行假時間分析來估計假定的分化方向。當(dāng)重新聚集時，選擇第0組作為起始節(jié)點，假時間預(yù)測第2組來源于第1組和第3組(圖3D) ，表明它代表腹膜駐留巨噬細胞的一個亞型。
我們通過流式細胞術(shù)在早期(進行腹水形成)和晚期(存在腹水)時間點證實了這些巨噬細胞亞群的存在(圖3E 和 F)。這證實了在 Trp53-/-; Pten-/-腫瘤中早期存在簇2巨噬細胞(定義為 Arginase1+ PD-L1+ 或 HMOX1hi) ，并且在晚期腫瘤中顯著增加(圖3G 和 H)。我們還使用 IHC 驗證了 ID8網(wǎng)膜腫瘤切片中 HMOX1+ 細胞的存在(圖3I) ，其中它們在脂肪細胞周圍和腫瘤邊界中被觀察到(圖3J)。
我們接下來評估了 HMOX1在簇2中表達的選擇性。使用 Hmox1GFP 轉(zhuǎn)基因小鼠，我們證實只有單核細胞和巨噬細胞表達 HMOX1(圖3K)。盡管 LYVE1 + 間皮細胞襯里群體(占總巨噬細胞的一小部分)具有最高的表達，但是簇2(精氨酸酶1 + PD-L1 +)高度表達 HMOX1，其次是 CD102 + 腹膜巨噬細胞。CD11c + MHCIIhi 單核細胞來源的巨噬細胞和單核細胞表達較弱，其他群體表達較弱或不表達。當(dāng)組合時，我們的數(shù)據(jù)顯示精氨酸酶1 + PD-L1 + HMOX1hi 巨噬細胞在 Trp53-/-; Pten-/-腫瘤中顯著富集(圖3L)。
Figure 3 Pten-null的腫瘤細胞增強了網(wǎng)膜內(nèi)駐留樣巨噬細胞的積累
4. HMOX1hi 巨噬細胞來源于腹腔液巨噬細胞
為了檢驗腹腔液駐留巨噬細胞是 HMOX1hi 巨噬細胞的主要來源的假設(shè)，我們首先在 ID8細胞注射后24小時或13天將 AT CD45.1+ 腹腔液細胞(包括單核細胞，單核細胞來源的和駐留巨噬細胞)轉(zhuǎn)化為 CD45.2+ 小鼠。在網(wǎng)膜腫瘤中檢測到 CD45.1+ 細胞，證明腹腔液和腫瘤之間可以發(fā)生運輸(圖4A)。有趣的是，駐留的 CD45.1+ F4/80hiMHCIIlo 細胞富含 Trp53-/-; Pten-/-腫瘤(圖4B 和 C，左) ，并相應(yīng)地在腹水中耗盡(圖4B 和 C，中)。大多數(shù) CD45.1+ 巨噬細胞是 TIM4+ ，表明長期居住(圖4B 和 C，右)。為了進一步確定 HMOX1hi 巨噬細胞是否可以來源于腹腔液，我們將來自健康 HMOX1GFP 小鼠的腹腔液 F4/80hiCD102+ 細胞分選并將其 AT 到攜帶 Trp53-/-; Pten-/-腫瘤的 HMOX1wt 同窩仔鼠中(圖4D)。我們在 Trp53-/-; Pten-/-網(wǎng)膜腫瘤(圖4E)中檢測到 HMOX1GFP 細胞，其表型復(fù)制宿主自身的群體(CD11c-MHCIIlo，CD102+ 精氨酸酶1+)并且?guī)缀跬耆珌碜蚤L期駐留的 CD102+ TIM4+ 細胞(圖4F)。然而，宿主巨噬細胞庫中的一部分 CD102-細胞具有高精氨酸酶1和 PD-L1表達(圖4G 和 H) ，表明一些簇2巨噬細胞也可能來源于非 CD102+ 腹膜液細胞。
Figure 4 HMOX1hi 巨噬細胞部分來源于腹腔液巨噬細胞
5. HMOX1抑制延長生存期
為了了解 HMOX1是否是 HGSC 潛在的治療靶點，我們使用了 HMOX1抑制劑中卟啉錫(SnMP; ref)。SnMP 處理不影響 MHCIIhiCD11c+ 單核細胞衍生的或 CD102+ F4/80hi 巨噬細胞的網(wǎng)膜密度(圖5A 和 B) ，但確實增加了精氨酸酶1+ PD-L1+ HMOX1+ 巨噬細胞的密度(圖5C)。這可能是對 HMOX1抑制反應(yīng)的補償機制，因為已知 SnMP 刺激 HMOX1上調(diào)，同時仍然阻斷酶活性。有趣的是，HMOX1抑制消耗了 LYVE1+ 巨噬細胞(圖5D) ，這表明它們對血紅素誘導(dǎo)的毒性敏感，與它們接近腫瘤脈管系統(tǒng)一致。SnMP 治療14天可減少腹水形成，但無顯著性差異(P = 0.078; 圖5E)。然而，延長的 SnMP 作為5天/2天休息制度給予，顯著增加了 Trp53-/-; Pten-/-荷瘤小鼠的存活(危險比0.32,95% CI，0.11-0.94，P = 0.002; 圖5F)。
Figure 5 HMOX1抑制延長攜帶 Pten-null ID8腫瘤的小鼠的存活
6. IL33作為簇2巨噬細胞的潛在驅(qū)動因素
為了確定 Pten-null腫瘤細胞如何驅(qū)動巨噬細胞擴增，我們最初篩選了趨化因子和細胞因子的表達。這表明在一些 Pten-null細胞中 Ccl2和 Ccl7的表達顯著增加，但不在另外缺乏 Brca2的細胞中。我們還分析了視黃酸產(chǎn)生酶 Raldh1,2和3的表達，因為腹膜和網(wǎng)膜駐留巨噬細胞由視黃酸支持，其驅(qū)動其駐留基因表達程序，包括 Gata6。然而，通過 Pten 缺失，Raldh1的表達并沒有持續(xù)改變。而 Raldh2和3在所有細胞中的表達可以忽略不計。此外，Trp53-/-; Pten-/-細胞沒有表現(xiàn)出增強的募集骨髓來源的巨噬細胞的能力，而 Ccr2的缺失導(dǎo)致骨髓來源的巨噬細胞向兩種基因型的募集減少。PTEN 缺失可以驅(qū)動前列腺癌中 IL6的產(chǎn)生。然而，在 Trp53-/-; Pten-/-ID8細胞(CT 值)中 Il6表達較弱，克隆之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，盡管 IL6蛋白不能被 ELISA 檢測到。編碼血管內(nèi)皮生長因子的 Vegfa 也沒有受到 Pten 丟失的影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，一個或多個超越 Ccl2和 Ccl7的因子在體內(nèi)產(chǎn)生，支持駐地巨噬細胞的募集和擴張。簇2的基因特征使我們能夠進一步剖析 HMOX1hi 巨噬細胞的潛在驅(qū)動因素。我們首先分析了 Trp53-/-; Pten-/-ID8細胞的大量 RNA-seq 分析。使用這種方法，我們發(fā)現(xiàn)與 Trp53-/-ID8細胞相比，Trp53-/-; Pten-/-中有4,505個基因顯著上調(diào)(圖5G)。使用 IPA (圖5H) ，我們鑒定了簇2的25個潛在的上游調(diào)節(jié)因子，其中16個與 Pten 無效細胞中也上調(diào)的基因重疊(圖5I)。在這些基因中，我們將 Il33鑒定為刺激簇2基因表達的可能候選基因，因為它既是分泌因子，又預(yù)測激活簇2中最大的基因組之一(圖5J)。我們證實在 Pten 缺失的 ID8系中 Il33基因和 IL33蛋白表達增加(圖5K)。然后我們在 IL33存在下培養(yǎng)腹腔液駐留巨噬細胞，觀察到 Hmox1基因表達顯著增加(圖5L)。
7. 小鼠和人類 HMOX1hi 巨噬細胞具有共同的特征
為了確保我們的小鼠數(shù)據(jù)與 HGSC 患者相關(guān)，我們分析了一個大型 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集，其中包含來自42名新診斷的初治 HGSC 患者的160個活組織檢查的數(shù)據(jù)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(n = 166,895)基于已知的標記基因(包括 PTPRC，CD14，FCER1G 和 CD68)進行注釋。我們首先根據(jù) HMOX1表達對人巨噬細胞進行分類，將 HMOX1表達大于平均值1SD 的巨噬細胞定義為 HMOX1hi (圖6A)。然后我們比較了 HMOX1hi 巨噬細胞和每個小鼠群的 DEG。簇2顯示 HMOX1hi 細胞中重疊基因(n = 39)最多(圖6B)。同樣，在 HMOX1hi 巨噬細胞的87 DEG 中，最高比例(44.8% ，n = 39/87) 與簇2共享。HMOX1hi 巨噬細胞富含駐留巨噬細胞(LYVE1) ，血紅素代謝(BLVRB) ，細胞對缺氧(HILPDA) ，金屬硫蛋白(MT1E，MT1F，MT1G，MT1H 和 MT1M) ，鐵轉(zhuǎn)運蛋白，儲存和體內(nèi)平衡(SLC40A1，HAMP，FTH1和 FTL)和脂質(zhì)代謝和儲存(APOC1，PLIN2和 LIPA; 圖6C)。相反，HMOX1lo 巨噬細胞富含干擾素 γ 應(yīng)答基因(CXCL9和 CXCL10) ，免疫細胞和 T 細胞募集基因(CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11和 IL1B)和 MHCII 基因(HLA-DQA1; 圖6C)。對 HMOX1hi 巨噬細胞轉(zhuǎn)錄組的 MSigDB富集分析揭示了在小鼠簇2中也發(fā)現(xiàn)的缺氧反應(yīng)，離子穩(wěn)態(tài)，脂質(zhì)代謝和 mTORC1信號傳導(dǎo)途徑的富集(圖6D)。因此，人類 HGSC 包含一組巨噬細胞，它們與小鼠簇2具有共同的特征，并且具有高 HMOX1表達、組織駐留、擁有屬性氧化應(yīng)激反應(yīng)和低促炎細胞因子/趨化因子表達。
Figure 6 小鼠和人 HMOX1hi 巨噬細胞在 HGSC 中具有共同的特征
8. HMOX1hi 巨噬細胞與 HGSC 中 OS 和 PI3K 信號通路激活的關(guān)系
在小鼠中，簇2巨噬細胞幾乎只在 Pten-null腫瘤中發(fā)現(xiàn)(圖3A 和 B)。在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中，來自富含 HMOX1hi 巨噬細胞的腫瘤的癌細胞。S8A 表現(xiàn)出高 mTOR 信號傳導(dǎo)和高胰島素樣生長因子信號傳導(dǎo)(圖7A) ，可激活 PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)。相比之下，HMOX1hi 巨噬細胞富集的腫瘤中免疫相關(guān)通路下調(diào)(圖7A)。
在 BriTROC-1研究中，來自172名患者的診斷性 HGSC 樣品上的 IHC 表現(xiàn)出 HMOX1和 CD68之間的強相關(guān)性(圖7B 和 C) ，使我們能夠使用高 HMOX1表達作為 HMOX1hi 巨噬細胞的替代物。HMOX1hi 巨噬細胞的存在與腫瘤細胞中陽性 pAKT (S473)染色呈正相關(guān)，盡管很弱(圖7D 和 E)。S8B) ，并且在調(diào)整年齡和分期后也與 BriTROC-1患者的生存率降低獨立相關(guān)[ HR = 1.80(1.07-3.0) ; 圖7F 和 G ]。高 HMOX1表達對預(yù)后的影響在 mRNA 水平的單獨驗證隊列中得到證實。
Figure 7 高比例的 HMOX1hi 巨噬細胞與較差的 OS 和 PI3K 信號通路激活有關(guān)
研究結(jié)論
總之，我們已經(jīng)表明 HMOX1hi 巨噬細胞具有常見的基因表達程序，包括免疫抑制，缺氧，膽固醇流出和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，可以在小鼠和人類 HGSC 中鑒定。HMOX1hi 巨噬細胞在 HGSC 中的功能仍有待充分了解，基因表達途徑可能反映了誘導(dǎo) HMOX1hi 細胞的 PI3K 驅(qū)動的微環(huán)境和整體巨噬細胞功能。盡管如此，我們的研究強調(diào) HMOX1抑制可能為 HGSC 提供相關(guān)的治療策略。
研究方法：
細胞培養(yǎng)，RNA 提取和 cDNA 合成，SMART-Seq2 單細胞 RNA 測序，CD45.1 采血轉(zhuǎn)移，HMOX1GFP 巨噬細胞采血轉(zhuǎn)移，腹腔常駐巨噬細胞體外刺激，單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)分析，ID8 批量 RNA 測序數(shù)據(jù)分析，HMOX1 在獨立驗證隊列中的診斷價值，統(tǒng)計分析。
參考文獻：
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