PYCR1通過(guò)乳酸化修飾促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

肝癌（LC）是世界上最致命的癌癥之一，現(xiàn)有的治療方法療效有限。本研究旨在闡明PYCR1作為LC的潛在治療靶點(diǎn)的作用和潛在機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)PYCR1在HCC中表達(dá)顯著升高，且這種高表達(dá)與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)。在體內(nèi)和體外，敲除或抑制PYCR1均可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲除或抑制PYCR1可以抑制HCC細(xì)胞中的糖酵解，減少IRS1組蛋白的H3K18乳酸化，從而抑制IRS1的表達(dá)。我們的研究結(jié)果確定PYCR1是影響腫瘤細(xì)胞代謝和基因表達(dá)的LC進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。通過(guò)證明靶向PYCR1抑制LC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的潛力，本研究確定PYCR1是一個(gè)有希望的LC治療靶點(diǎn)。本文于2024年10月發(fā)表于Clin Transl Med（IF=7.9）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）PYCR1在LC中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與LC患者預(yù)后不良相關(guān)

LC和癌旁組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的分析。結(jié)果顯示，肺癌中PYCR1 RNA水平顯著升高（圖1A）。此外，PYCR1高表達(dá)與肺癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)（圖1B）。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證，肺癌組織中的PYCR1蛋白水平顯著高于癌旁組織（圖1C）。利用包含83對(duì)肺癌樣本的組織微陣列的免疫組化（IHC）結(jié)果也顯示，PYCR1在肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，并與肺癌患者的生存相關(guān)（圖1D、E）。隨后的Cox生存分析進(jìn)一步支持了這些結(jié)果（圖1F）。PYCR1的甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖1G）。為了驗(yàn)證這一觀察結(jié)果，我們用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-AZA；10μM）處理細(xì)胞系。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，經(jīng)5-AZA處理后，蛋白質(zhì)水平顯著升高（圖1H）。綜上所述，PYCR1在肺癌中高表達(dá)，并與預(yù)后不良相關(guān)，其表達(dá)部分受DNA甲基化的調(diào)控。

2）在體外敲除或抑制PYCR1可抑制LC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的PYCR1敲除HepG2和HuH-7細(xì)胞。Western blot驗(yàn)證敲除效率（圖2A）。此外，我們?cè)谖墨I(xiàn)中發(fā)現(xiàn)了一種PYCR1抑制劑，該抑制劑已在多項(xiàng)研究中使用，并顯示出顯著的效果。然后，我們委托該公司合成這種抑制劑，并使用穩(wěn)定的敲除細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以加強(qiáng)我們的結(jié)果。我們測(cè)試了這種抑制劑的多個(gè)濃度，發(fā)現(xiàn)20 μM的濃度能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，其抑制水平與PYCR1敲除相當(dāng)。為了驗(yàn)證PYCR1對(duì)肺癌細(xì)胞體外的影響，我們進(jìn)行了多項(xiàng)表型分析實(shí)驗(yàn)。敲減/抑制PYCR1后，細(xì)胞形成的克隆數(shù)量顯著減少（圖2B,C）。EdU實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，敲除或抑制肺癌細(xì)胞中的PYCR1后，增殖細(xì)胞的比例顯著降低（圖2D,E）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，敲除/抑制PYCR1后，S期細(xì)胞的比例顯著減少（圖2F,G），凋亡分析顯示，敲除/抑制PYCR1后，凋亡細(xì)胞的百分比顯著增加（圖2H,I）。這些結(jié)果表明，抑制或敲除PYCR1抑制了肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。接下來(lái)，我們探索PYCR1敲除/抑制對(duì)LC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PYCR1敲除或抑制組LC細(xì)胞的遷移面積明顯小于對(duì)照組（圖3A，B）。在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲除/抑制PYCR1后，通過(guò)腔室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖3C-F）。這些結(jié)果初步表明，敲除/抑制PYCR1可顯著降低LC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

3）在體內(nèi)敲除或抑制PYCR1會(huì)阻礙LC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)只能證明PYCR1在體外的角色。因此，我們使用裸鼠異種移植模型和尾靜脈注射的肺癌轉(zhuǎn)移小鼠模型來(lái)探討PYCR1敲除或抑制對(duì)肺癌體內(nèi)增殖和遷移/侵襲能力的影響。在使用異種移植模型時(shí)，我們觀察到敲除組腫瘤的大小顯著小于對(duì)照組，抑制劑組也觀察到了類似趨勢(shì)。此外，我們對(duì)異種移植組織進(jìn)行了HE和Ki67染色。結(jié)果顯示，敲減或抑制PYCR1后，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著減少（圖4A,B）。在肺癌轉(zhuǎn)移模型中，PYCR1敲除組小鼠的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著少于對(duì)照組小鼠（圖4C）。為了進(jìn)一步支持這些結(jié)果，我們從敲減和抑制劑組的肺癌細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。然后我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了與增殖和周期相關(guān)的蛋白、與遷移/侵襲相關(guān)的蛋白以及與凋亡相關(guān)的蛋白。結(jié)果顯示，在敲除或抑制PYCR1后，CCND1、CDK4、CDK6、N-鈣粘蛋白、波形蛋白和MMP9的表達(dá)顯著下調(diào)。相反，敲除或抑制PYCR1后，E-鈣粘蛋白和裂解的caspase 9的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4D–G）。總結(jié)來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)支持我們之前的研究結(jié)果，并驗(yàn)證了高表達(dá)的PYCR1在促進(jìn)肺癌惡性進(jìn)展中的作用。

4）敲除或抑制PYCR1會(huì)干擾LC中PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK通路

表型實(shí)驗(yàn)表明PYCR1促進(jìn)LC的惡性進(jìn)展。然而，其潛在機(jī)制尚不清楚。接下來(lái)，我們使用RNA-seq鑒定HepG2細(xì)胞中PYCR1敲除后表達(dá)水平顯著改變的基因（圖5A）。途徑富集分析顯示，PYCR1敲除后表達(dá)下調(diào)的基因主要富集于間隙連接途徑、mTOR途徑和胰島素途徑，而PYCR1敲除后表達(dá)上調(diào)的基因主要富集于鐵死亡和壞死性凋亡途徑（圖5B、C）。此外，LC組織RNA-seq數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）顯示PYCR1表達(dá)與PI3K/Akt/mTOR通路顯著正相關(guān)（圖5D）。此外，我們觀察到PYCR1表達(dá)與糖酵解代謝途徑之間存在顯著的正相關(guān)（圖5E）。我們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR通路的上游基因IRS1在敲除PYCR1后顯著下調(diào)。此外，參與調(diào)控MAPK/ERK通路的下游基因IRS1、SOS1和SOS2在敲除PYCR1后也顯著下調(diào)。這些結(jié)果經(jīng)qPCR證實(shí)（圖5F，G）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述現(xiàn)象，我們從PYCR1敲除的LC細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot。結(jié)果顯示，PI3K/AKT/mTOR通路和MAPK/ERK通路主要蛋白水平降低（圖5H， 1）。這兩種途徑可以強(qiáng)烈地影響癌癥的進(jìn)展，它們的聯(lián)合作用可以解釋在以前的表型實(shí)驗(yàn)中觀察到的變化。

5）敲除或抑制PYCR1通過(guò)調(diào)節(jié)IRS1的表達(dá)來(lái)?yè)p害LC的進(jìn)展

接下來(lái)，我們探討了PYCR1是否通過(guò)IRS1促進(jìn)了LC的進(jìn)展。在LC細(xì)胞中敲除PYCR1， IRS1過(guò)表達(dá)，然后將兩種處理聯(lián)合使用。集落形成和EdU染色結(jié)果表明，在PYCR1敲除細(xì)胞中，IRS1過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力顯著提高（圖6A，B）。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)IRS1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力增加（圖6C，D）。Western blot結(jié)果顯示，在PYCR1敲除或抑制的LC細(xì)胞中，IRS1過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化被消除（圖6E）。IRS1過(guò)表達(dá)還挽救了PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK通路中關(guān)鍵分子被抑制的磷酸化（圖6F）。此外，對(duì)先前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的腫瘤組織進(jìn)行免疫組化，證實(shí)體內(nèi)PYCR1敲低/抑制后IRS1下調(diào)（圖6G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PYCR1的敲低/抑制導(dǎo)致的LC進(jìn)展損傷是由于IRS1的抑制。

6）PYCR1通過(guò)調(diào)節(jié)IRS1啟動(dòng)子區(qū)域的H3K18乳酸化來(lái)影響IRS1的表達(dá)

盡管我們確定了PYCR1通過(guò)IRS1促進(jìn)肺癌進(jìn)展，但這兩種分子之間的聯(lián)系機(jī)制仍然未知。PYCR1主要位于線粒體中，而IRS1位于細(xì)胞質(zhì)中。這些細(xì)胞器之間沒(méi)有直接接觸，使得相互作用變得困難。我們的免疫沉淀和質(zhì)譜結(jié)果也排除了這兩種分子之間相互作用的可能（結(jié)果未顯示）。我們發(fā)現(xiàn)PYCR1敲減組中糖酵解的代謝產(chǎn)物乳酸的含量顯著減少（圖7A–C）。使用生化試劑盒也觀察到了乳酸含量的顯著下降（圖7D）。最近的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸可以主導(dǎo)蛋白質(zhì)的乳酸化修飾。因此，我們假設(shè)IRS1的下調(diào)是由細(xì)胞內(nèi)乳酸含量的減少引起的，進(jìn)而導(dǎo)致組蛋白H3K18乳酸化的下調(diào)。為了驗(yàn)證我們的推測(cè)，我們首先使用Western blot分析了總體蛋白質(zhì)的乳酸化水平。結(jié)果顯示，當(dāng)PYCR1被敲減或抑制時(shí)，總體細(xì)胞質(zhì)蛋白的乳酸化水平和組蛋白H3K18位點(diǎn)的富集都下調(diào)了（圖7E）。然后我們進(jìn)行了ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)IRS1啟動(dòng)子區(qū)域的H3K18la富集情況。結(jié)果顯示，PYCR1敲除后，IRS1啟動(dòng)子區(qū)域的H3K18la富集顯著減少（圖7F）。此外，IRS1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，響應(yīng)PYCR1的IRS1轉(zhuǎn)錄活性顯著降低（圖7G）。海馬細(xì)胞代謝分析結(jié)果顯示，LC細(xì)胞中PYCR1抑制/敲低后，糖酵解程度顯著降低（圖7H）。Western blot分析證實(shí)了PYCR1敲除后葡萄糖攝取相關(guān)蛋白（GLUT2/3/4）的表達(dá)減少（圖7I）。

結(jié)論：

我們的研究揭示了PYCR1在LC中的表達(dá)模式和促瘤作用，并確定了PYCR1促進(jìn)LC進(jìn)展的下游靶點(diǎn)IRS1。此外，我們的研究表明，PYCR1可以通過(guò)組蛋白乳酸化調(diào)節(jié)LC中乳酸代謝，影響基因表達(dá)。我們的研究為尋找治療LC的新靶點(diǎn)提供了新的途徑。

實(shí)驗(yàn)方法：

CRISPR-Cas9基因敲除，EdU，流式，傷口愈合實(shí)驗(yàn)，Transwell，RNA測(cè)序，ChIP?PCR，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

參考文獻(xiàn)：

Wang H, Xu M, Zhang T, Pan J, Li C, Pan B, Zhou L, Huang Y, Gao C, He M, Xue Y, Ji X, Zhang X, Wang N, Zhou H, Wang Q, Li JZ. PYCR1 promotes liver cancer cell growth and metastasis by regulating IRS1 expression through lactylation modification. Clin Transl Med. 2024 Oct;14(10):e70045. doi: 10.1002/ctm2.70045.