m7G修飾的mt-tRF3b-LeuTAA通過(guò)軟骨細(xì)胞中SIRT3的SUMO化來(lái)調(diào)節(jié)線粒體自噬和代謝重編程

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退行性疾病，軟骨細(xì)胞退化是其發(fā)展的關(guān)鍵。越來(lái)越多的證據(jù)表明，m7G RNA修飾與OA病理過(guò)程相關(guān)，但其在軟骨細(xì)胞退化中的具體作用尚不明確。在該研究中，作者發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，METTL1 和 m7G的水平顯著升高。此外，METTL1介導(dǎo)的m7G修飾會(huì)上調(diào)線粒體轉(zhuǎn)運(yùn) RNA 衍生片mt-tRF3b-LeuTAA的表達(dá)，從而加劇軟骨細(xì)胞的退變。從機(jī)制上講，mt-tRF3b-LeuTAA 會(huì)降低 SUMO 特異性蛋白酶 1（SENP1）的蛋白表達(dá)，并上調(diào)去乙?；?/span> 3（SIRT3）的 SUMO 化水平，進(jìn)而抑制 PTEN 誘導(dǎo)激酶 1（PINK1）/ 帕金蛋白（Parkin）介導(dǎo)的線粒體自噬。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射聚酰胺-胺-聚乙二醇表面修飾的含最小自肽和軟骨細(xì)胞親和肽的mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑（PMC）可在體內(nèi)減輕內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)（DMM）小鼠軟骨的退變。作者的研究表明，METTL1/m7G/mt-tRF3b-LeuTAA 軸通過(guò)SIRT3的SUMO化抑制線粒體自噬并促進(jìn)線粒體功能障礙，從而加速軟骨降解，并且提示靶向METTL1及其下游信號(hào)軸可能是骨關(guān)節(jié)炎治療的一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)。該研究于2024年10月發(fā)表在《Biomaterials》上，IF：12.8。

??技術(shù)路線：??

主要研究結(jié)果：

1.METTL1介導(dǎo)的m7G修飾導(dǎo)致OA進(jìn)展中的軟骨退化

為了研究m7G甲基轉(zhuǎn)移酶修飾在軟骨退化中的作用，作者通過(guò)RNA-seq技術(shù)檢查了m7G調(diào)節(jié)劑的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)METTL1表達(dá)在OA軟骨細(xì)胞中顯著升高（圖1A和B）。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)表達(dá)和m7G修飾水平在OA軟骨細(xì)胞中顯著增加，而膠原蛋白II型alpha1(COL2A1)表達(dá)顯著降低（圖1C和D，n=30）。Kellgren-Lawrence等級(jí)用于評(píng)估軟骨樣本的退化等級(jí)（KLG；0-4）。結(jié)果顯示METTL1表達(dá)與OA進(jìn)展中的m7G修飾水平呈顯著相關(guān)性（圖1E）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證METTL1介導(dǎo)的m7G修飾是否會(huì)加速OA的病理進(jìn)展，將METTL1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或METTL1-sh質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到原代人軟骨細(xì)胞中。作者觀察到METTL1過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)了MMP13表達(dá)并下調(diào)了COL2A1表達(dá)。同時(shí)，m7G的總水平顯著增加（圖1F-H）。此外，功能獲得和喪失實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)和沉默METTL1均顯著影響軟骨細(xì)胞增殖、凋亡以及合成代謝和分解代謝標(biāo)志物的表達(dá)（圖1I和J）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1介導(dǎo)的m7G修飾有助于OA中的軟骨細(xì)胞退化。

圖 1. OA軟骨細(xì)胞中的METTL1表達(dá)和m7G修飾水平促進(jìn)軟骨細(xì)胞退化

2.METTL1介導(dǎo)的m7G修飾抑制mt-tRF3b-LeuTAA表達(dá)

m7G是一種常見(jiàn)的tRNA衍生片段修飾，在原核生物、真核生物和一些古細(xì)菌中高度保守。為了進(jìn)一步探索METTL1介導(dǎo)的m7G修飾的具體機(jī)制，進(jìn)行了arraystar人類(lèi)m7G小RNA表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列。作者注意到軟骨細(xì)胞中許多tRF具有m7G修飾（圖2A-C）。在臨床樣本中篩選并驗(yàn)證了六種具有高m7G修飾的tRF。其中，與正常軟骨細(xì)胞相比，mt-tRF3b-LeuTAA表達(dá)在OA軟骨細(xì)胞中更穩(wěn)定且更高（圖2D）。mt-tRF3bLeuTAA源自mt-tRNALeuTAA，其源tRNA序列和結(jié)構(gòu)是從MINT基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的（圖2D）。

Pearson相關(guān)性分析顯示mt-tRF3b-LeuTAA表達(dá)與m7G修飾、METTL1水平和KLG之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖2E）。此外，m7G修飾RNA免疫沉淀表明mt-tRF3b-LeuTAA在m7G位點(diǎn)高度富集（圖2F）。METTL1敲低上調(diào)了mttRF3b-LeuTAA的表達(dá)，這與METTL1過(guò)表達(dá)形成對(duì)比（圖2G）。免疫熒光(IF)和熒光原位雜交(FISH)顯示METTL1和mt-tRF3b-LeuTAA在軟骨細(xì)胞中共定位（圖2H和I）。以上結(jié)果表明mt-tRF3bLeuTAA上存在m7G修飾，而METTL1是該修飾的原因。

圖2. METTL1介導(dǎo)的m7 G-甲基化tRNA衍生片段的鑒定

3．Mt-tRF3b-LeuTAA加劇軟骨細(xì)胞退化

為了進(jìn)一步研究mt-tRF3b-LeuTAA在OA中的作用，將mt-tRF3bLeuTAA模擬物、mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑和對(duì)照轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中。IF結(jié)果顯示，mt-tRF3bLeuTAA模擬物增加了軟骨細(xì)胞中MMP13的表達(dá)并降低了COL2A1的表達(dá)。然而，mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑產(chǎn)生了相反的效果。此外，mt-tRF3b-LeuTAA模擬物D.LongetalBiomaterials314(2025)122903通過(guò)EdU測(cè)定抑制了軟骨細(xì)胞增殖，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL測(cè)定增加了軟骨細(xì)胞凋亡。Westernblot分析顯示，mttRF3b-LeuTAA模擬物上調(diào)了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中分解代謝標(biāo)志物(MMP13、RUNX2和ADAMTS4)的水平，并降低了軟骨相關(guān)合成代謝標(biāo)志物(Aggrecan、SOX9和COL2A1)的水平。這些結(jié)果表明mt-tRF3b-LeuTAA導(dǎo)致OA中的軟骨退化。

tRF可以通過(guò)靶向mRNA來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄。作者利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（miRanda、TargetScan和tRFTars）預(yù)測(cè)并篩選了mt-tRF3b-LeuTAA靶向的6個(gè)mRNA，包括TNF受體相關(guān)因子2(TARF2)、甲狀腺激素受體相互作用蛋白4(TRIP4)、C-X-C基序趨化因子配體8(CXCL8)、細(xì)胞周期蛋白D2(CCND2)、ras相關(guān)蛋白Rab-2A(RAB2A)和sentrin特異性蛋白酶1(SENP1)。在軟骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mt-tRF3bLeuTAA后，只有SENP1表達(dá)顯著降低，這表明SENP1是mt-tRF3b-LeuTAA的有效下游靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明mt-tRF3b-LeuTAA可能通過(guò)靶向SENP1促進(jìn)軟骨細(xì)胞退化。

圖 3. mt-tRF3b-LeuTAA 通過(guò) PINK1/Parkin 通路促進(jìn) SIRT3 SUMO 化，從而抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬

4.Mt-tRF3b-LeuTAA促進(jìn)SIRT3SUMO化并抑制PINK1/Parkin依賴(lài)性線粒體自噬

作者之前的研究表明，SIRT3通過(guò)PINK1/Parkin通路激活線粒體自噬。其他研究表明，SIRT3含有1型SUMO化(SUMO1)位點(diǎn)，SUMO1修飾可通過(guò)降低底物去乙?；钚詠?lái)抑制SIRT3功能。為了驗(yàn)證mt-tRF3b-LeuTAA是否通過(guò)PINK1/Parkin通路影響SIRT3SUMO化和線粒體自噬，在原代人軟骨細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)mt-tRF3b-LeuTAA。作者發(fā)現(xiàn)mt-tRF3b-LeuTAA模擬物導(dǎo)致總SUMO1修飾更高，而mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑具有相反的效果（圖3A和B）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)mt-tRF3b-LeuTAA模擬物增強(qiáng)了SIRT3SUMO1修飾（圖3C-F）。為進(jìn)一步探討mt-tRF3b-LeuTAA調(diào)控軟骨細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制，作者進(jìn)行了Westernblot、mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒及mito-Keima實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示mt-tRF3b-LeuTAA模擬物抑制了軟骨細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、LC3II/I、Beclin-1及COL2A1，增加了P62及MMP13。此外，mt-tRF3b-LeuTAA模擬物增加了凋亡相關(guān)蛋白BAX，抑制了增殖相關(guān)蛋白Bcl-2（圖3G）。mRFP-GFP-LC3、透射電子顯微鏡(TEM)和線粒體-凱馬分析顯示，mt-tRF3b-LeuTAA模擬物下調(diào)了軟骨細(xì)胞中的線粒體自噬通量（圖3H-J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，mt-tRF3b-LeuTAA促進(jìn)SIRT3SUMO化并抑制OA中的PINK1/Parkin依賴(lài)性線粒體自噬。

圖 4. mt-tRF3b-LeuTAA 通過(guò)線粒體自噬調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞葡萄糖代謝重編程

5.Mt-tRF3b-LeuTAA促進(jìn)軟骨細(xì)胞異常能量代謝

線粒體自噬也與能量代謝有關(guān)，包括氧化磷酸化 (OXPHO) 和糖酵解。為了確定mt-tRF3b-LeuTAA是否調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的OXPHO和糖酵解，對(duì)線粒體的代謝功能進(jìn)行了評(píng)估。作者發(fā)現(xiàn)mttRF3b-LeuTAA模擬了活性氧(ROS)生成增加(圖4A和B)，以及線粒體膜電位降低、軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡增加(圖4C和D)。Westernblot分析顯示，mttRF3b-LeuTAA模擬物可導(dǎo)致糖代謝相關(guān)酶水平升高，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1型(GLUT1)、己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶(PFKP)、丙酮酸激酶肌同工酶M2(PKM2)和丙酮酸脫氫酶E1(PDHA)(圖4E)。此外，mt-tRF3b-LeuTAA模擬物可降低耗氧率(OCR)水平，增加乳酸生成，減少ATP生成(圖4F)。然而，在軟骨細(xì)胞中敲低mt-tRF3b-LeuTAA則會(huì)引起相反的效果。這些結(jié)果證實(shí)，mt-tRF3b-LeuTAA下調(diào)線粒體自噬并促進(jìn)糖酵解，破壞正常的能量代謝，導(dǎo)致OA中持續(xù)的ROS和乳酸沉積。

圖 5. mt-tRF3b-LeuTAA 通過(guò)靶向 SENP1 抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬

6.Mt-tRF3b-LeuTAA通過(guò)靶向SENP1抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬并促進(jìn)葡萄糖代謝重編程

SENP1作為SUMO1修飾的主要調(diào)控酶，對(duì)SIRT3SUMO1修飾具有較高的水解效率。為了確認(rèn)mt-tRF3b-LeuTAA是否通過(guò)靶向SENP1增強(qiáng)SIRT3SUMO1修飾并抑制PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，作者進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，將mt-tRF3b-LeuTAA模擬物和mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑轉(zhuǎn)染到原代人軟骨細(xì)胞中。作者發(fā)現(xiàn)mt-tRF3b-LeuTAA模擬物顯著抑制了SENP1的表達(dá)，這與mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑形成對(duì)比。

然后，將mt-tRF3b-LeuTAA和SENP1分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中。結(jié)果表明，SENP1敲低增強(qiáng)了總SUMO1修飾和SIRT3SUMO1修飾（圖5A）。此外，SENP1敲低通過(guò)檢測(cè)mRFP-GFP-LC3、mito-Keima和線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平抑制了PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬（圖5B-G）。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)SENP1敲低降低了線粒體膜電位，增加了ROS生成（圖6A-D），并促進(jìn)了糖酵解（圖6E和F）。重要的是，通過(guò)轉(zhuǎn)染mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑可以挽救SENP1敲低的影響。此外，SENP1過(guò)表達(dá)檢測(cè)到了相反的效果，而通過(guò)用mt-tRF3b-LeuTAA模擬物轉(zhuǎn)染可以挽救這些效果，進(jìn)一步支持SENP1作為mt-tRF3b-LeuTAA的功能介質(zhì)。最后，作者通過(guò)Targetscan和miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了mt-tRF3b-LeuTAA和SENP1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)mt-tRF3bLeuTAA與SENP1mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)mttRF3b-LeuTAA可以直接結(jié)合SENP1mRNA3′-UTR。

總體而言，這些結(jié)果表明mt-tRF3b-LeuTAA靶向SENP1來(lái)調(diào)節(jié)SIRT3SUMO1修飾，從而抑制PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬并促進(jìn)軟骨細(xì)胞中的葡萄糖代謝重編程。

圖6. mt-tRF3b-LeuTAA 通過(guò)靶向SENP1 促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝重編程

7構(gòu)建針對(duì)軟骨細(xì)胞的高親和力納米載體

基于上述mt-tRF3b-LeuTAA調(diào)控軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，作者進(jìn)一步探索mt-tRF3b-LeuTAA在OA中的治療潛力。首先，構(gòu)建軟骨細(xì)胞親和性及吞噬細(xì)胞逃逸性納米粒子，以聚酰胺胺（PAMAM）為載體，將最小“自身”肽（MSP）和軟骨細(xì)胞親和肽（CAP）附著于納米載體上（圖7A），將該納米載體體系命名為PMC（Polyamidoamine-polyethyleneglycolsurface-modifiedwithMinimalself-peptidesandChondrocyte-affinitypeptides）。游離miRNA形成的亮帶在PMC處完全消失，tRF的重量比為0.5–14，表明tRF分子已被PMC復(fù)合和阻滯。瓊脂糖凝膠電泳表明，在N/P比為8時(shí)，所有tRF分子均未復(fù)合（圖7B）。細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，在40-50%聚乙二醇(PEG)的納米膠囊對(duì)原代人軟骨細(xì)胞的毒性較低，而RT-qPCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)PEG比例為40%的納米膠囊可提供更佳的遞送效果（圖7C和D）。

然后，將mt-tRF3b-LeuTAA裝載到PMC中。平均粒徑為45.8nm，正電荷為10.7mV（圖7E-G）。為了評(píng)估PMC的降解和持續(xù)釋放，將OA滑液與PMC-mt-tRF3b-LeuTAA和裸露的mt-tRF3b-LeuTAA一起孵育。RNA擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳顯示與PMC培養(yǎng)24h后可檢測(cè)到條帶（圖7H）。

接下來(lái)，將人軟骨外植體與PMC-mt-tRF3bLeuTAA（FITC）或Nakedmt-tRF3b-LeuTAA（FITC）一起培養(yǎng)24h，進(jìn)行體外滲透實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示PMC-mt-tRF3b-LeuTAA組熒光增強(qiáng)，而Nakedmt-tRF3b-LeuTAA組呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（圖7I）。同樣，將巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞與PMC-mttRF3b-LeuTAA或Nakedmt-tRF3b-LeuTAA一起培養(yǎng)24h。在PMC-mt-tRF3bLeuTAA組中，軟骨細(xì)胞比巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光。（圖7J）。然后，作者通過(guò)將PMC-mt-tRF3b-LeuTAA添加到六種不同類(lèi)型的細(xì)胞中來(lái)研究PMC的靶向軟骨細(xì)胞能力。結(jié)果表明，與其他類(lèi)型的細(xì)胞相比，軟骨細(xì)胞特異性地吸收了PMC-mt-tRF3b-LeuTAA。最重要的是，PMC-mt-tRF3b-LeuTAA是一種很有前途的納米載體，可用于進(jìn)一步評(píng)估OA的體內(nèi)治療效果。

圖 7. 軟骨細(xì)胞親和吞噬細(xì)胞逃逸納米粒子促進(jìn) mt-tRF3b-LeuTAA 遞送到軟骨細(xì)胞中

8.PMC-mt-tRF3b-LeuTAA減輕DMM小鼠的軟骨退化

為了驗(yàn)證PMC-mt-tRF3b-LeuTAA在體內(nèi)治療OA的效果，合成了Cy5.5標(biāo)記的mt-tRF3b-LeuTAA，并制備了相應(yīng)的納米遞送材料和裸RNA對(duì)照。對(duì)雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。三周后，器官采集和成像顯示PMC-mt-tRF3b-LeuTAA和裸RNA對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，表明PMC-mt-tRF3b-LeuTAA在體內(nèi)的毒性很小。體內(nèi)成像顯示裸mt-tRF3b-LeuTAA的熒光隨時(shí)間下降的速度比PMC-mt-tRF3b-LeuTAA更快。

然后對(duì)雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)（DMM），建立OA模型。所有小鼠隨機(jī)分為Sham組、DMM組、DMM+Nakedmt-tRF3b-LeuTAA組、DMM+PMC-mttRF3b-LeuTAA組和DMM+PMC-mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑組。DMM+Control組小鼠注射Nakedmt-tRF3bLeuTAA，DMM+PMC組小鼠注射PMCmt-tRF3b-LeuTAA或DMM+PMC-mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑。術(shù)后10周，軟骨關(guān)節(jié)間隙、層表面、基質(zhì)染色、軟骨細(xì)胞排列、細(xì)胞萎縮、反應(yīng)性聚集、軟骨下骨血管增生等均有明顯差異（圖8A）。免疫組織化學(xué)和免疫熒光顯示DMM+PMC-mt-tRF3b-LeuTAA組的MMP13、COL10A1、RUNX2表達(dá)較高，COL2A1和Aggrecan表達(dá)較低，而DMM+PMC-mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑組則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（圖8B）。小鼠膝關(guān)節(jié)的微型計(jì)算機(jī)斷層掃描評(píng)估了骨贅和硬化半月板。與單純DMM組相比，DMM+PMC-mt-tRF3b-LeuTAA組的骨贅體積和等級(jí)較高，而DMM+PMCmt-tRF3b-LeuTAA抑制劑組檢測(cè)到的骨贅較低（圖8C）。這些發(fā)現(xiàn)意味著PMC-mt-tRF3b-LeuTAA抑制劑可減輕DMM小鼠的軟骨退化。綜上所述，PMC可以有效地將tRF遞送到軟骨細(xì)胞中，為OA提供一種有前景的基于納米技術(shù)的精準(zhǔn)靶向策略。

圖 8. PMC-mt-tRF3b-LeuTAA 抑制劑減輕 DMM 小鼠的軟骨退化

結(jié)論：

綜上所述，METTL1 介導(dǎo)的m7 G修飾上調(diào)了mt-tRF3b-LeuTAA的表達(dá)，而mt-tRF3bLeuTAA則通過(guò)靶向SENP1來(lái)促進(jìn)SIRT3 SUMO1修飾，從而抑制 SIRT3的功能。該過(guò)程抑制了軟骨細(xì)胞線粒體自噬，促進(jìn)了糖酵解和代謝重編程，并加速了軟骨細(xì)胞的退化。在轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，mt-tRF3bLeuTAA代表了研究線粒體自噬和OA進(jìn)展的新靶點(diǎn)。此外，作者合成了一種新型納米載體PMC，可顯著增強(qiáng)tRF進(jìn)入軟骨細(xì)胞，并為OA中的tRF特異性核酸藥物提供了一種新的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Long D, Deng Z, Zhao X, et al. m⁷G-modified mt-tRF3b-LeuTAA regulates mitophagy and metabolic reprogramming via SUMOylation of SIRT3 in chondrocytes. Biomaterials. Published online October 23, 2024. doi:10.1016/j.biomaterials.2024.122903 

實(shí)驗(yàn)方法：

組織病理學(xué)染色、qPCR、WB、Dot blot、RT-qPCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交、TUNEL、 CCK-8、micro-CT、骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型的構(gòu)建