棕櫚酰化允許 TNF 通路中的 RIPK1 激酶活性和細(xì)胞毒性

??腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)的受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1 （RIPK1）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡，越來越被認(rèn)為是炎癥性疾病的主要驅(qū)動因素。細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)通常會抑制 RIPK1 激酶，以保護(hù)生物體免受其有害后果。然而，當(dāng)保護(hù)性檢查點(diǎn)被禁用時(shí)，允許 RIPK1 激酶活性的機(jī)制仍不清楚。在這里，我們確定 S-棕櫚?；?nbsp;RIPK1 激酶的許可修飾。TNF 誘導(dǎo) RIPK1 棕櫚?；?nbsp;DHHC5 介導(dǎo)，并依賴于 RIPK1 的 K63 連接泛素化，RIPK1 通過促進(jìn)其激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用來增強(qiáng) RIPK1 激酶活性，并在細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)阻斷后促進(jìn)細(xì)胞死亡。此外，DHHC5 在患有代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎的小鼠肝臟中被脂肪酸擴(kuò)增，導(dǎo)致在這種情況下觀察到的 RIPK1 細(xì)胞毒性增加。我們的研究結(jié)果表明，泛素化依賴性棕櫚?；?nbsp;RIPK1 激酶活性能夠誘導(dǎo)下游細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)，并表明 RIPK1 棕櫚?；茄装Y性疾病的可行靶點(diǎn)。本文于2024年11月發(fā)表于《Molecular Cell》，IF：19.3

??研究技術(shù)路線：??

??研究結(jié)果：??

1.RIPK1在 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中 S- 棕櫚?；?/span>

我們著手確定復(fù)合物 I 組分是否是 S- 棕櫚酰化反應(yīng) TNF 感應(yīng)。我們應(yīng)用常用的?；锼亟粨Q(ABE)測定法來檢測 S- 棕櫚?；Ｔ摲椒ㄉ婕白钄嗟鞍踪|(zhì)中的游離半胱氨酸殘基，隨后使用羥胺(HAM)和硫醇反應(yīng)性生物素釋放和捕獲棕櫚?；腚装彼釟埢Ｎ覀兪褂没诿庖叱恋矸?/span>(IP)和 ABE 分析的棕櫚?；鞍赘患由腺|(zhì)譜法，來鑒定復(fù)合物 I 中的 S-棕櫚?；孜?/span>(圖1A)。我們在復(fù)合物 I 中鑒定了三種?；鞍?，包括 RIPK1，TNFR1和 TAB3(圖1B)。使用2-溴棕櫚酸酯(2-BP)(一種常見的 PATs 抑制劑)可以實(shí)現(xiàn) S- 棕櫚?；奶禺愋砸种?。只有 RIPK1和 TNFR1對2-BP 治療敏感(圖1C)。我們專注于 RIPK1棕櫚?；?yàn)?/span> RIPK1棕櫚?；呢S度顯著高于 TNFR1棕櫚?；?/span>TNFR1棕櫚?；耙延袌?bào)道。

HEK293T 細(xì)胞中異位表達(dá)的 RIPK1被棕櫚?；?，在用2-BP 處理后減少(圖1D)。然后，我們使用炔標(biāo)記的棕櫚酸類似物15-十六烷酸(Alk14)作為代謝標(biāo)記，其可以與熒光染料四甲基羅丹明(TAMRA)-疊氮化合物或通過單擊化學(xué)與生物素疊氮化合物偶聯(lián)。在 Alk14的代謝摻入后異位表達(dá)的 RIPK1被棕櫚?；?圖1E)。相比之下，內(nèi)源性 RIPK1在基礎(chǔ)條件下不經(jīng)歷棕櫚?；?。然而，TNF 刺激顯著增加了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)和骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)中的 RIPK1棕櫚?；?圖1F)。進(jìn)一步的分析顯示，超過25% 的 RIPK1被棕櫚酰化，如?；垡叶?PEG)交換(APE)測定所示。

我們還觀察到 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著增加，由于復(fù)合物 I10中 RIPK1的已知泛素化，其顯示出高分子量的涂片模式(圖1G)。RIPK1的這種修飾在2-BP 處理后減少(圖1H) ，證實(shí)這些條帶確實(shí)是棕櫚?；慕Y(jié)果。我們還觀察到在 TNF 刺激的小鼠中，作為主要靶器官之一的肝組織中 RIPK1棕櫚酰化的增加(圖1I)。因此，RIPK1是 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中蛋白 S- 棕櫚?；牡孜?。

Figure 1 RIPK1在 TNF 刺激下棕櫚?；?/span>

2.RIPK1在進(jìn)化上保守的 Cys257處被棕櫚酰化

我們還觀察到 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著增加，由于復(fù)合物 I10中 RIPK1的已知泛素化，其顯示出高分子量的涂片模式(圖1G)。RIPK1的這種修飾在2-BP 處理后減少(圖1H) ，證實(shí)這些條帶確實(shí)是棕櫚?；慕Y(jié)果。我們還觀察到在 TNF 刺激的小鼠中，作為主要靶器官之一的肝組織中 RIPK1棕櫚?；脑黾?圖1I)。因此，RIPK1是 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中蛋白 S- 棕櫚?；牡孜?。

接下來，我們利用 CRISPR-Cas9技術(shù)產(chǎn)生 Ripk1C257S/C257S敲入小鼠。Ripk1C257S/C257S突變小鼠以正常的孟德爾比率出生，并且它們的生長看起來正常。來自 Ripk1C257S/C257S小鼠的初級 MEF 在 TNF 刺激下始終表現(xiàn)出有缺陷的 RIPK1棕櫚?；?圖2D 和2E)。此外，與 Ripk1WT/WT 小鼠相比，Ripk1C257S/C257S小鼠的肝組織中 TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1棕櫚?；档?圖2F)。我們沒有觀察到 WT RIPK1和 C257S 突變體之間的熱穩(wěn)定性或二硫鍵形成模式的顯著差異，表明這種突變可能不會改變 RIPK1的整體折疊。

Figure 2 棕櫚?；ㄟ^增強(qiáng)其激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用來促進(jìn) RIPK1激酶活性

3.棕櫚?；龠M(jìn)復(fù)合物 I 中 RIPK1激酶的激活

我們接下來研究了棕櫚?；欠裼绊?nbsp;RIPK1向復(fù)合物 I 的募集。我們對復(fù)合物 I 進(jìn)行了質(zhì)譜法分析，發(fā)現(xiàn)2-BP 不改變復(fù)合物 I 中 RIPK1的量，這通過免疫印跡證實(shí)(圖2G)。與 WT RIPK1相比，RIPK1的 C257S 突變體表現(xiàn)出與復(fù)合物 I 相當(dāng)?shù)哪技?圖2H)。此外，2-BP 不影響復(fù)合物 I 中其他已知成分的水平。

RIPK1的激酶非依賴性激活可以通過 NF-κB 和 MAPK 途徑促進(jìn)細(xì)胞存活; 或者，RIPK1的激酶激活可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。阻斷 RIPK1棕櫚酰化對 TNF 刺激的 MEF 中 NF-κB 和 MAPK 信號傳導(dǎo)的激活沒有影響。我們接下來通過在 RIPK1(p-S166 RIPK1)上使用針對磷酸化 S166的抗體來評估 RIPK1棕櫚?；欠裼绊懫浼っ富钚?，RIPK1是其激酶活化的公認(rèn)標(biāo)志物。單獨(dú)的 TNF 可以激活復(fù)合物 I.41中的 RIPK1的非致死庫。在2-BP 處理的 MEF 或 Ripk1C257S/C257SMEF 中，p-S166 RIPK1的水平顯著降低,與各自的對照 MEF (圖2G 和2H)相比，表明棕櫚酰化促進(jìn)復(fù)合物 I 中 RIPK1的激酶活化。鑒于 C257位于激酶結(jié)構(gòu)域(KD)中，我們推測該位點(diǎn)的棕櫚?；赡茉鰪?qiáng) RIPK1活性。RIPK1的過度表達(dá)可導(dǎo)致自發(fā)激酶活化。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá) RIPK1-C257S 突變體導(dǎo)致與 WT 相比 p-S166 RIPK1水平較低，并且兩者都被 RIPK1激酶抑制劑 necrostatin-1s (Nec-1s)抑制。值得注意的是，C257S 突變本身不影響體外激酶測定中 RIPK1-KD 的活性，表明棕櫚?；{(diào)節(jié) RIPK1激酶的細(xì)胞特異性機(jī)制。

4.棕櫚?；龠M(jìn) RIPK1-KD 的同源相互作用

RIPK1由 N- 末端 KD，中間結(jié)構(gòu)域(ID)和 C- 末端死亡結(jié)構(gòu)域(DD)組成。 RIPK1的激酶活化通過二聚體內(nèi)的反式自磷酸化發(fā)生，這可能是由其 KD 的同源結(jié)合介導(dǎo)的。眾所周知，DD 介導(dǎo)的二聚化對于 RIPK1的自體磷酸化和激活是必不可少的。然而，KD 如何實(shí)現(xiàn)同源相互作用以促進(jìn)自體磷酸化仍然不清楚(圖2I)。我們觀察到異位表達(dá)的 RIPK1-KD 的同源相互作用，其通過2-BP 處理或 C257S 突變降低，表明棕櫚酰化促進(jìn) RIPK1-KD 同源相互作用。相比之下，2-BP 處理對 RIPK1-DD 的同源相互作用沒有影響。我們進(jìn)一步應(yīng)用 NanoLuc 二元技術(shù)(NanoBiT) ，一種由結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的大 BiT (LgBiT)和小 BiT (SmBiT)亞基組成的雙組分系統(tǒng)，可用于細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用，以研究棕櫚酰化對 RIPK1-KD 同源相互作用的影響(圖2J)。N- 末端或 C- 末端 LgBiT 融合的 RIPK1的相互作用分別用 N- 末端或 C- 末端 SmBiT 融合的 RIPK1檢測，但不與陰性對照 SmBiT-HaloTag (圖2J)檢測，提示 RIPK1的同源相互作用。然而，2-BP 顯著降低了 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用(圖2J) ，而對 RIPK1-LgBiT 和 RIPK1-SmBiT 之間的相互作用影響較小(圖 S2J) ，表明 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用信號主要來源于 RIPK1-KD 同源相互作用。此外，LgBiT-RIPK1-C257S 和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用顯著低于 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用(圖2J)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在 RIPK1-DD 二聚化后，棕櫚酰化對于促進(jìn) RIPK1-KD 同源相互作用是重要的，從而促進(jìn)了 RIPK1的自體磷酸化。

5.當(dāng)保護(hù)性檢查點(diǎn)被禁用時(shí)，棕櫚?；?nbsp;RIPK1具有細(xì)胞毒性

我們接下來分析了 RIPK1棕櫚?；?nbsp;TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1激酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。已知有兩個(gè)檢查點(diǎn)可以抵消由 TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1依賴性細(xì)胞死亡。第一個(gè)涉及通過激酶如 TGF-β 激活激酶1(TAK1) ，IκB 激酶 α/β (IKKα/β)和 TANK 結(jié)合激酶1(TBK1)磷酸化依賴性失活復(fù)合物 I 中的 RIPK1，阻止 RIPK1激酶依賴性細(xì)胞凋亡(RDA)。第二個(gè)檢查點(diǎn)涉及復(fù)合 IIa/b 中半胱天冬酶 -8依賴性的 RIPK1切割，防止 RIPK1激酶依賴性 necroptosis。我們觀察到通過 TNF 刺激聯(lián)合 TAK1抑制(T/5z7) ，IKKα/β 抑制(T/TPCA-1) ，TBK1抑制(T/MRT)或 TBK1缺陷可以通過2-BP 或 RIPK1-C257S 突變。RDA 涉及 RIPK1和半胱天冬酶的激活。2-BP 處理的 MEF 或 Ripk1C257S/C257S MEF 在 T/5z7刺激下顯示 RIPK1激酶活性降低和半胱天冬酶 -8介導(dǎo)的半胱天冬酶 -3切割(CC3)的抑制(圖3C 和3D)。用2-BP 或 RIPK1-C257S 突變處理也導(dǎo)致復(fù)合物 IIb 的形成減少。值得注意的是，RIPK1棕櫚?；皇芮?nbsp;RDA 刺激的影響。TNF 誘導(dǎo)的促存活基因的 NF-κB 依賴性上調(diào)保護(hù)細(xì)胞免受 RIPK1激酶非依賴性細(xì)胞凋亡(RIA)。放線菌酮(CHX)可阻斷 NF-κB 途徑下游的翻譯，從而促進(jìn) RIA，其不能被 Nec-1s 阻斷。2-BP 或 RIPK1-C257S 突變對 TNF/CHX 誘導(dǎo)的 MEF 死亡沒有影響，表明棕櫚?；?nbsp;RIA 中不起作用。

使用抑制劑如Z-Val-Ala-Asp-FMK (zVAD)抑制 caspase-8可誘導(dǎo) TNF 刺激的細(xì)胞中 RIPK1激酶依賴性壞死。用 CHX 和 zVAD (T/C/Z)聯(lián)合治療 TNF 是可被 Nec-1s38,43抑制的 necroptosis 的完善模型(圖3E)。我們發(fā)現(xiàn)2-BP 或 RIPK1-C257S 突變顯著降低了細(xì)胞對 T/C/Z 誘導(dǎo)的 necroptosis 的敏感性(圖3E 和3F)。壞死也發(fā)生在用 TNF 和 zVAD 處理的細(xì)胞中，伴隨5z7(T/5z7/Z)抑制 TAK1,50也被2-BP 或 RIPK1-C257S 突變減少。此外，2-BP 處理的細(xì)胞或 Ripk1C257S/C257S 細(xì)胞對 necroptosis 誘導(dǎo)的敏感性降低通過 p-S166 RIPK1和壞死生物標(biāo)志物 p-T231/S232 RIPK3和 p-S345 MLKL20,51(圖3G，3H)的降低進(jìn)一步標(biāo)志。最后，2-BP 或 RIPK1-C257S 突變導(dǎo)致壞死體形成減少。值得注意的是，RIPK1棕櫚?；皇艽賶乃烙|發(fā)因子的影響。RIPK1激酶依賴性細(xì)胞死亡嚴(yán)重參與介導(dǎo) TNF 誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。2-BP 或 RIPK1-C257S 敲入突變有效地保護(hù)小鼠免受致死劑量的 TNF 誘導(dǎo)的致死性(圖3I 和3J) ，進(jìn)一步支持棕櫚?；诖龠M(jìn) RIPK1細(xì)胞毒性中的作用。

當(dāng)巨噬細(xì)胞中半胱天冬酶 -8被抑制時(shí)，RIPk1介導(dǎo)的 necroptosis 也可以在 Toll樣受體(LPS)刺激的脂多糖4(TLR4)途徑中觸發(fā)。引人注目的是，與相應(yīng)的對照細(xì)胞相比，2-BP 處理的 BMDMs 或 Ripk1C257S/C257S BMDMs 顯示對由 LPS 聯(lián)合 zVAD (LPS/Z)誘導(dǎo)的 necroptosis 的敏感性降低。用 LPS/Z 刺激的 BMDM 中的2-BP 處理也降低了 p-S166 RIPK1，p-T231/S232 RIPK3和 p-S345 MLKL 的水平?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，RIPK1棕櫚?；S可其激酶活性和細(xì)胞毒性失活的細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)。

Figure 3 棕櫚?；龠M(jìn) RIPK1對細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)的細(xì)胞毒性阻斷

6.DHHC5介導(dǎo)復(fù)合物 I 的 RIPK1棕櫚酰化

在哺乳動物中，DHHC 家族由23個(gè)成員組成。我們使用短發(fā)夾 RNA (shRNA)敲低這23種 DHHC 蛋白在 MEF 中的表達(dá)，并鑒定了6種在敲低時(shí)抑制 RDA 和/或 necroptosis 的 PATs (Z 評分 > 1)(圖4A)。RIPK1與六個(gè)預(yù)選的 PATs 中的每一個(gè)的過度表達(dá)確定只有 DHHC5增強(qiáng) RIPK1棕櫚?；?。此外，DHHC5的缺失大大降低了異位表達(dá)的 RIPK1的棕櫚?；?。

在 DHHC5敲低的細(xì)胞中，但在其他 DHHC 敲低的細(xì)胞中，TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1棕櫚酰化被消除。我們進(jìn)一步通過在炔烴標(biāo)記的棕櫚酰輔酶 A (CoA)(Alk14-CoA)存在下將純化的 RIPK1蛋白與 DHHC5溫育來進(jìn)行體外棕櫚?；瘻y定。我們檢測了由 DHHC5催化的 RIPK1的體外棕櫚酰化，但不是通過在保守的 DHHC 基序(DHHS5)31(圖4C)內(nèi)含有 Cys-to-Ser 取代(C134S)的 DHHC5的催化失活突變體。當(dāng)在體外棕櫚?；瘻y定中與 DHHC5和 Alk14-CoA 溫育時(shí)，RIPK1-C257S 突變體也表現(xiàn)出棕櫚酰化缺陷(圖4D)。與 WT 細(xì)胞相比，我們觀察到 DHHC5缺陷型細(xì)胞中復(fù)合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著減少(圖4E) ，表明 DHHC5對于 TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中的 RIPK1棕櫚?；潜匦璧?。

Figure 4 DHHC5介導(dǎo) TNF 誘導(dǎo)的復(fù)合物 I 中 RIPK1棕櫚?；?/span>

7.DHHC5介導(dǎo)的棕櫚?；蕾囉?nbsp;K63連接的 RIPK1泛素化

RIPK1在復(fù)合物 I 中高度泛素化，作為多種蛋白質(zhì)復(fù)合物募集的支架。我們推測抑制 RIPK1泛素化是否可能影響其棕櫚酰化。在 TNF 感應(yīng)后，RIPK1和其他復(fù)合物 I 組分迅速經(jīng)歷由 cIAP1/2介導(dǎo)的 K63和 K11連接的泛素化以及由線性泛素鏈組裝復(fù)合物(LUBAC，包含 HOIL-1，HOIP 和 SHARPIN)介導(dǎo)的線性泛素化。值得注意的是，復(fù)合物 I 中 RIPK1的棕櫚?；?nbsp;SM-164處理的 cIAP1/2消耗后被消除(圖4F)。然而，其中 LUBAC 功能失調(diào)的 Hoip-/-MEF 表現(xiàn)出與 WT MEF 相似程度的 RIPK1棕櫚酰化。這些結(jié)果表明 RIPK1棕櫚酰化依賴于 cIAP1/2介導(dǎo)的泛素化。與此相一致的是，2-BP 對 TNF 聯(lián)合 SM-164(T/S)或 T/S/Z 誘導(dǎo)的 necroptosis 誘導(dǎo)的 RDA 沒有影響。相比之下，已知 HOIP 缺陷使細(xì)胞對 RIPK1激酶依賴性細(xì)胞死亡敏感，但2-BP 仍然在 HOIP 缺陷型 MEF 中提供了對 RDA 和 necroptosis 的保護(hù)。CIAP1/2介導(dǎo)的 RIPK1的泛素化主要發(fā)生在復(fù)合物 I中的鼠 RIPK1(人 RIPK1的 K377)的 Lys376(K376)上。值得注意的是，表達(dá) RIPK1-K376R 突變體的細(xì)胞顯示消除的棕櫚酰化(圖4G) ，并且它們在 RDA 和 necroptosis 方面對2-BP 處理沒有反應(yīng)。

我們觀察到在 TNF 處理的 MEF 中，RIPK1和 DHHC5之間的相互作用顯著增加，如通過鄰近連接測定(PLA)所確定的(圖4H)。因此，DHHC5和 RIPK1被招募到復(fù)合物 I 中。然而，在用 SM-164處理的細(xì)胞中，RIPK1和 DHHC5之間的 TNF 誘導(dǎo)的相互作用完全消除(圖4I) ，表明在 RIPK1上加入 cIAP1/2的泛素鏈促進(jìn) DHHC5的募集。CIAP1/2誘導(dǎo) RIPK1的 K63和 K11連接的泛素化。我們發(fā)現(xiàn) DHHC5向復(fù)合物 I 的募集主要由 K63連接的泛素鏈介導(dǎo)(圖4J)。因此，cIAP1/2介導(dǎo)的 K63連接的 RIPK1泛素化促進(jìn) DHHC5募集至復(fù)合物 I，允許復(fù)合物 I 中 DHHC5介導(dǎo)的 RIPK1的棕櫚?；?圖4K)。

8.DHHC5促進(jìn) TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1激酶活化和細(xì)胞毒性

隨后我們研究了 DHHC5在促進(jìn) RIPK1激酶活化和細(xì)胞毒性中的作用。當(dāng)細(xì)胞接受 TNF 刺激時(shí)，DHHC5缺陷導(dǎo)致復(fù)合物 I 中 p-S166 RIPK1的減少(圖5A)。結(jié)果，DHHC5缺陷細(xì)胞對 T/5z7誘導(dǎo)的 RDA 的敏感性降低(圖5B)。此外，DHHC5缺陷顯著降低了用 T/5z7處理的細(xì)胞中的 RIPK1和半胱天冬酶活化以及復(fù)雜的 IIb 形成(圖5C)。同樣，DHHC5缺陷細(xì)胞對 T/C/Z 誘導(dǎo)的壞死的敏感性顯著降低(圖5D)。一致的是，DHHC5缺陷導(dǎo)致用 T/C/Z 處理的細(xì)胞中 p-S166 RIPK1，p-T231/S232 RIPK3，p-S345 MLKL 和壞死體形成的減少(圖5E)。與棕櫚酰化在促進(jìn) RIPK1-KD 同源相互作用中的作用一致，DHHC5缺陷降低了 RIPK1的 KD-KD 相互作用(圖5F)。

綜上所述，這些結(jié)果建立了以下模型，說明 RIPK1激酶活化是如何被許可促進(jìn)細(xì)胞毒性的(圖5G)。在 TNF 感應(yīng)后，RIPK1被迅速募集到復(fù)合物 I 中，在那里它經(jīng)歷 cIAP1/2介導(dǎo)的 K63連接的泛素化，其促進(jìn) DHHC5的募集，其催化 RIPK1-KD 的棕櫚?；．?dāng)細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)被阻斷時(shí)，棕櫚?；龠M(jìn) RIPK1-KD 的同源相互作用并增強(qiáng) RIPK1反式激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

Figure 5 DHHC5在細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)阻斷時(shí)促進(jìn) RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性

9.DHHC5在 MASH 肝臟中通過脂肪酸擴(kuò)增

以前的研究已經(jīng)將 RIPK1的細(xì)胞毒性與 MASH 聯(lián)系起來，其中肝臟積聚了過多的脂肪沉積物。然而，MASH 中 RIPK1激活的機(jī)制仍然難以捉摸。我們發(fā)現(xiàn)喂食膽堿缺陷型高脂飲食(CD-HFD)的小鼠可以迅速誘導(dǎo) MASH 組織病理學(xué)，與正常脂肪飲食(ND)的小鼠相比，RIPK1棕櫚?；@著增加(圖6A)。與喂食 ND 的小鼠相比，喂食 CD-HFD 或常用 HFD 的小鼠的肝組織中 DHHC5的蛋白質(zhì)水平也升高(圖6B)。此外，與喂食 ND 的小鼠相比，喂食 CD-HFD 的小鼠的肝組織中 Dhhc5的 mRNA 水平顯著升高。

我們在 MASH 肝臟中觀察到 DHHC5在肝細(xì)胞中的特異性上調(diào)，但在非實(shí)質(zhì)(NPC)細(xì)胞中沒有(圖6C)。然后，我們用0.4 mM 棕櫚酸(PA)刺激原代肝細(xì)胞，在該濃度下進(jìn)行以模擬脂肪肝疾病的體內(nèi)條件。我們觀察到 PA 處理后肝細(xì)胞中 Dhc5 mRNA 和蛋白質(zhì)水平的增加(圖6D)。此外，在 PA 處理的肝細(xì)胞中 TNF 誘導(dǎo)的 RIPK1棕櫚酰化增加。Dhc5的啟動子區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子 c-jun66的結(jié)合位點(diǎn)(圖 S6F)。已經(jīng)證實(shí)，PA 激活 c-Jun N- 末端激酶(JNKs) ，其磷酸化 c-Jun 并促進(jìn) MASH。我們假設(shè) PA 誘導(dǎo)的 DHHC5的轉(zhuǎn)錄激活是由 JNK/c-Jun 途徑介導(dǎo)的。一致認(rèn)為，JNK 的藥理學(xué)抑制阻止了 PA 處理的肝細(xì)胞中 DHHC5的增加(圖6D)。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號傳導(dǎo)和 p38信號傳導(dǎo)在 MASH 肝臟和 PA 刺激的肝細(xì)胞中也被激活，這促進(jìn)了 c-Jun 驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)錄。一致地，抑制 ERK 或 p38信號傳導(dǎo)也降低了 PA 誘導(dǎo)的 DHHC5的表達(dá)。

我們通過使用被 JNK 抑制消除的染色質(zhì)免疫沉淀定量實(shí)時(shí) PCR (ChIP-qPCR)觀察到 PA 處理的肝細(xì)胞中 DHHC5啟動子處 c-Jun 的強(qiáng)占據(jù)(圖6E)。然后，我們通過將 Dhhc5啟動子區(qū)與熒光素酶基因連接進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(圖6F)。C-Jun 的過表達(dá)顯著增加了通過 Dhhc5啟動子的轉(zhuǎn)錄激活，但不是通過對照 CMV 啟動子或缺乏 c-Jun 結(jié)合位點(diǎn)的突變的 Dhhc5啟動子(圖6F)。因此，DHHC5通過 JNK/c-Jun 途徑在 MASH 肝細(xì)胞中被脂肪酸擴(kuò)增。

Figure 6 脂肪酸擴(kuò)增的 DHHC5促進(jìn) MASH 中 RIPK1驅(qū)動的肝損傷

10.脂肪酸擴(kuò)增的 DHHC5促進(jìn) MASH 中 RIPK1驅(qū)動的肝損傷

接下來，我們通過將 Dhhc5f/f 小鼠與白蛋白 -Cre (Alb-Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，產(chǎn)生肝細(xì)胞特異性 Dhhc5敲除小鼠，并用 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠以誘導(dǎo) MASH 相關(guān)的組織病理學(xué)。在來自 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的原代肝細(xì)胞中，DHHC5缺陷顯著降低了棕櫚?；?nbsp;RIPK1的水平(圖6G)。與以前的研究一致，我們觀察到通過 p-S166 RIPK1免疫染色確定的 RIPK1激酶活性增加，并且通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色觀察到細(xì)胞死亡，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝切片中，與 ND 喂養(yǎng)的小鼠相比。CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhhc5f/f； Alb-Cre 小鼠的肝臟中 p-S166 RIPK1和 TUNEL 陽性細(xì)胞的量減少(圖6H)。與這一發(fā)現(xiàn)一致，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠(圖6I)中，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平顯著降低，這是肝損傷的兩個(gè)常見標(biāo)志物。

蘇木精和伊紅(H & E)和油紅 O (ORO)染色顯示，與 Dhhc5f/f 小鼠相比，CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠的肝脂肪變性和脂質(zhì)積累沒有改變。這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致，表明抑制 RIPK1激酶不影響 CD-HFD 模型中的肝脂肪變性，其刺激嚴(yán)重的 MASH 病理學(xué)。相比之下，我們觀察到 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhhc5f/f; Alb-Cre 小鼠與 Dhc5f/f 小鼠相比，通過染色巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD45(圖6J)測量。DHHC5缺陷也導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子 Tnf 和 Il6以及趨化性細(xì)胞因子 Ccl2，Ccl5和 Cxcl1的下調(diào)(圖6K)。此外，與對照小鼠相比，通過 Masson 三色染色(MTS)和天狼星紅染色評估的肝纖維化在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠中減少(圖6L)。與纖維化減少一致，dhHC5缺乏下調(diào)膠原基因 Col1a1，纖維化生長因子 Pdgfa，Pdgfb 和受體 Pdgfra 的表達(dá)(圖6M)。當(dāng)用 Nec-1s 處理這些小鼠時(shí)，DHHC5缺陷對 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝損傷的影響受到損害(圖6N) ，表明 DHHC5通過 RIPK1激酶依賴性方式在促進(jìn) MASH 中的肝損傷中起作用。

11.缺陷型 RIPK1棕櫚酰化改善 MASH 肝損傷

與 DHHC5缺陷小鼠類似，與 Ripk1WT/WT 小鼠相比，CD-HFD 喂養(yǎng)的 Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中的肝脂肪變性沒有改變。然而，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中，RIPK1激活和細(xì)胞死亡被有效抑制(圖7A)。因此，在 CD-HFD 喂養(yǎng)后，與 WT 小鼠相比，Ripk1C257S/C257S小鼠血清 ALT 和 AST 水平顯著降低(圖7B)。RIPK1-C257S 突變也導(dǎo)致炎癥反應(yīng)顯著降低，如 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠肝臟中巨噬細(xì)胞浸潤減少和細(xì)胞因子和趨化因子下調(diào)所示(圖7C 和7D)。此外，CD-HFD 喂養(yǎng)后，組織學(xué)纖維化顯著降低，Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中的纖維化基因譜紊亂也得到改善(圖7E 和7F)。此外，當(dāng)用 Nec-1s 處理這些小鼠時(shí)，RIPK1-C257S 突變對 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝損傷的影響受到損害(圖7G) ，進(jìn)一步表明 RIPK1棕櫚酰化在促進(jìn)體內(nèi) RIPK1細(xì)胞毒性中的重要性。

Figure 7 RIPK1棕櫚酰化缺陷減輕 MASH 相關(guān)性肝損傷

12.靶向 DHHC5對小鼠 MASH 的治療作用

我們接下來評估了靶向 DHHC5對 MASH 相關(guān)性肝損傷小鼠的潛在治療作用。我們產(chǎn)生了編碼靶向肝靶向治療基因載體 DHHC5(71)的短發(fā)夾 microRNA 的腺相關(guān)病毒8(AAV8) ，以誘導(dǎo) MASH 肝細(xì)胞中的 DHHC5敲低。我們用 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠4周以建立 MASH，然后靜脈注射 AAV-shDhc5的小鼠，同時(shí)繼續(xù) CD-HFD 4周。在 AAV 感染4周后，我們在 AAV-shDhc5小鼠的肝臟中檢測到大量的 DHHC5減少。DHHC5敲低不影響 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝脂肪變性。盡管如此，DHHC5敲低顯著降低了 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠肝切片中 RIPK1的活化和細(xì)胞死亡。此外，與 AAV-shNC 小鼠相比，AAV-shDhc5小鼠血清 ALT 和 AST 水平顯著降低。DHHC5敲低也減輕了巨噬細(xì)胞浸潤和肝臟炎癥。此外，AAV-shDhhc5注射液顯著抑制組織學(xué)肝纖維化和促纖維化標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果表明，靶向 DHHC5可以減輕 MASH 相關(guān)的肝損傷。

研究結(jié)論：

因此，預(yù)防肝損傷和肝纖維化是 MASH 治療的一個(gè)主要目標(biāo)，可以通過改善肝臟死亡來實(shí)現(xiàn)。因此，我們的研究具有潛在的臨床意義，并提出 DHHC5和 RIPK1棕櫚?；鳛楦唧w治療 MASH 相關(guān)性肝損傷的可行靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析、啟動子序列分析、基因編輯與突變、體外激酶檢測、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、免疫共沉淀（IP）和免疫印跡（IB）、細(xì)胞培養(yǎng)與處理、細(xì)胞毒性分析、蛋白-蛋白相互作用檢測、代謝標(biāo)記與熒光檢測、免疫熒光與共定位分析、小鼠模型、組織學(xué)染色評估肝脂肪變性和纖維化、檢測血清中肝損傷標(biāo)志物水平

參考文獻(xiàn)：

Zhang N, Liu J, Guo R, Yan L, Yang Y, Shi C, Zhang M, Shan B, Li W, Gu J, Xu D. Palmitoylation licenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway. Mol Cell. 2024 Nov 21;84(22):4419-4435.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2024.10.002. Epub 2024 Oct 28. PMID: 39471814.

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