乳腺癌中表達(dá)NRP2的細(xì)胞是S-亞硝基化樞紐，可減輕輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

盡管新輔助化療極大的改善了乳腺癌患者的治療效果，但部分患者仍有殘留病灶。放射治療作為治療惡性腫瘤的主要手段之一，在影像技術(shù)和人工智能發(fā)展幫助下，可以為患者提供最佳的個性化治療。然而三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)患者對放射治療具有抵抗性。在該研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)S-亞硝基化修飾介導(dǎo)的放療抵抗機(jī)制并設(shè)計(jì)了恢復(fù)放療敏感性的靶向抗體。該文章于2024年10月發(fā)表在《Journal of Clinical Investigation》，IF=13.3。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.抑制VEGF/NRP2增強(qiáng)TNBC的放射敏感性

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)在TNBC中富集，并且對電離輻射產(chǎn)生的ROS具有抵抗性。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF通路通過單次跨膜蛋白NRP2維持CSC的功能，但是VEGF/NRP2通路在氧化應(yīng)激緩沖方面的作用尚不清楚。

研究者通過對比人正常乳腺細(xì)胞和TNBC原代細(xì)胞單劑量放療后的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，22個編碼細(xì)胞表面蛋白的基因在放射治療的TNBC原代細(xì)胞中高表達(dá)。其中，NRP2與接受放療的TNBC患者不良預(yù)后相關(guān)（圖1A）。研究者發(fā)現(xiàn)在放療抵抗的TNBC細(xì)胞系中NRP2在細(xì)胞表面的表達(dá)量與輻射劑量相關(guān)（圖1B）。為研究NRP2表達(dá)是否是放療后存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，研究者在輻射處理后的TNBC細(xì)胞中干擾了NRP2表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞以及克隆形成實(shí)驗(yàn)得到肯定的結(jié)果（圖1C和D）。研究者進(jìn)一步使用NRP2 mAb（aNRP2-10）阻斷VEGF/NRP2結(jié)合，增加了TNBC細(xì)胞對輻射的敏感性（圖1E-G），表明VEGF/NRP2軸具有克服放療細(xì)胞毒性的潛力。

為評估數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化相關(guān)性，研究者在體外實(shí)驗(yàn)中模擬了臨床常規(guī)放療方案，發(fā)現(xiàn)放療抵抗的細(xì)胞中NRP2表達(dá)上調(diào)，使用aNRP2-10則增加了放療敏感性（圖1F）。研究者還使用了TNBC患者來源的類器官(PDOs)和異種移植物(PDXs)證明阻斷NRP2以增強(qiáng)放療敏感的有效性。免疫熒光和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)證明aNRP2-10處理使PDO對輻射敏感（圖1H）。依據(jù)NRP2細(xì)胞表面表達(dá)水平對PDX進(jìn)行分選，研究者發(fā)現(xiàn)NRP2低表達(dá)細(xì)胞對放療更敏感，而aNRP2-10處理增加了NRP2高表達(dá)細(xì)胞對放療的敏感性（圖1I）。

圖1 抑制VEGF/NRP2增強(qiáng)TNBC的放射敏感性

2.表達(dá)NRP2的細(xì)胞是NO信號傳導(dǎo)的樞紐

為研究NRP2促進(jìn)放療抵抗的機(jī)制，研究者對NRP2低表達(dá)和NRP2高表達(dá)TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶NOS2上調(diào)以及一氧化氮（NO）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因富集（圖2A）。一氧化氮是一種能夠引發(fā)放射抗性的獨(dú)特生物活性信使。隨后，研究者通過免疫熒光檢測了患者組織中NO的替代標(biāo)志物硝基酪氨酸和NRP2的表達(dá)，盡管硝基酪氨酸和NRP2的定位存在顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，但Pearson共定位系數(shù)表明這兩個標(biāo)記物之間存在很強(qiáng)的線性關(guān)系（圖2B）。研究者假定，NRP2表達(dá)的細(xì)胞通過調(diào)節(jié)NOS2表達(dá)，構(gòu)成一個硝基化反應(yīng)的核心樞紐。為證明VEGF/NRP2軸可以調(diào)節(jié)NOS2，研究者分別干擾了NRP2、VEGF-C的表達(dá)，以及使用aNRP2-10阻斷VEGF/NRP2結(jié)合，發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞中NOS2顯著下調(diào)（圖2C）。并且在NRP2敲降的細(xì)胞中，NO替代標(biāo)志物亞硝酸鹽也減少（圖2D）。為評估NO在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散能力，研究者做了如下實(shí)驗(yàn)：收集NRP2高表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基，添加DMSO或NO清除劑（c-PTIO），用于培養(yǎng)NRP2敲降的細(xì)胞。結(jié)果顯示NRP2高表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基增加了硝基酪氨酸含量，使用c-PTIO則消除了這種作用（圖2E）。

接下來，研究者從TCGA數(shù)據(jù)庫中選擇接受放射治療的癌癥患者，并根據(jù)其NRP2和NOS2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行分離。生存分析表明，NRP2和NOS2表達(dá)均高于中位的患者無病生存時間較短。為了驗(yàn)證NRP2/NOS2軸在放療抵抗中的作用，使用化學(xué)抑制劑1400W或shRNAs抑制TNBC細(xì)胞中的NOS2活性，觀察到在寬范圍的輻射劑量下細(xì)胞存活率顯著降低。在NRP2敲降細(xì)胞中過表達(dá)NOS2則逆轉(zhuǎn)了放療抵抗的表型（圖2F）。重要的是，當(dāng)用aNRP2-10處理時，NOS2過表達(dá)的TNBC細(xì)胞的放射敏感性沒有發(fā)生變化，這表明aNRP2-1治療后NOS2抑制對調(diào)節(jié)放射敏感性的必要性。

圖2 表達(dá)NRP2的細(xì)胞是NO信號傳導(dǎo)的樞紐

3.NRP2誘導(dǎo)NOS2表達(dá)以減輕輻射誘導(dǎo)的ROS

為進(jìn)一步研究NRP2作用的硝基化反應(yīng)介導(dǎo)放療抵抗的機(jī)制，研究者評估了減輕輻射誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素：DNA損傷修復(fù)和氧化應(yīng)激。DNA損傷修復(fù)的指標(biāo)之一是追蹤照射后γ-H2AX焦點(diǎn)隨時間的衰減。相比于對照組，NRP2敲降細(xì)胞檢測到更多的γ-H2AX焦點(diǎn)，表明受到了更多的DNA損傷，或者其DNA損傷修復(fù)能力受到了影響（圖3A）。研究者進(jìn)一步檢測了NRP2敲降細(xì)胞中ROS水平，ROS是引起DNA損傷積累的因素之一。使用ROS指示劑H2DCFDA，研究者發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)NRP2敲降細(xì)胞和NRP2功能阻斷的細(xì)胞中ROS增加（圖3B和C）。在檢測DNA損傷的彗星實(shí)驗(yàn)中，NRP2敲降細(xì)胞DNA損傷程度更高，而使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以減輕NRP2敲降細(xì)胞DNA損傷，而對對照細(xì)胞沒有作用（圖3D）。以上實(shí)驗(yàn)表明，VEGF/NRP2可以最大限度地減少輻射誘導(dǎo)的ROS積累，并減輕DNA損傷。為檢測VEGF/NRP2軸對ROS的緩沖作用是否依賴NOS2活性，使用1400W抑制NOS2功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NRP2敲降細(xì)胞中抑制NOS2，ROS水平?jīng)]有明顯變化，而對照組細(xì)胞抑制NOS2功能導(dǎo)致ROS水平上升（圖3E）。并且在NRP2敲降細(xì)胞中過表達(dá)NOS2可以減少輻照誘導(dǎo)的ROS水平（圖3F）。以上結(jié)果表明，NRP2/NOS2軸察省的NO可以減輕輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷。

圖3 NRP2誘導(dǎo)NOS2表達(dá)以減輕輻射誘導(dǎo)的ROS

4.VEGF/NRP2通過Gli1調(diào)節(jié)NOS2轉(zhuǎn)錄

研究者過去研究發(fā)現(xiàn)，VEGF/NRP2下游信號通路誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Gli1表達(dá)，在NRP2敲降和功能阻斷細(xì)胞中Gli1表達(dá)降低（圖4A和B）。并且，輻射增加了Gli1表達(dá)，但是在NRP2功能阻斷后Gli1表達(dá)降低（圖4C）。研究者假設(shè)NOS2是Gli1的靶基因，使用Gli1抑制劑GANT61處理TNBC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NOS2 mRNA表達(dá)顯著降低（圖4D）。敲降Gli1得到了一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4E）。而在NRP2敲降細(xì)胞中過表達(dá)Gli1則增加NOS2表達(dá)（圖4F）。研究者結(jié)合已發(fā)表的Gli1 ChiP-seq數(shù)據(jù)和ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，證明了Gli1可以與NOS2啟動子結(jié)合（圖4G）。為進(jìn)一步證明Gil1驅(qū)動NOS2轉(zhuǎn)錄，研究者用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了Gil1與NOS2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，結(jié)果導(dǎo)致NOS2 mRNA表達(dá)減少（圖4H），并且這些細(xì)胞對輻照敏感（圖4I）。以上結(jié)果說明NOS2表達(dá)依賴于Gli1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖4 VEGF/NRP2通過Gli1調(diào)節(jié)NOS2轉(zhuǎn)錄

5.NFE2L2活性依賴于NRP2誘導(dǎo)的NOS2表達(dá)

研究者接下來通過分析放療敏感的TNBC細(xì)胞系和放療抵抗的TNBC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探索下游機(jī)制。NOS2 mRNA在放療抵抗的TNBC細(xì)胞系中上調(diào)，并且NFE2L2/KEAP1通路在差異基因中富集。NFE2L2是抗氧化反應(yīng)元件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以減輕癌癥細(xì)胞中的ROS水平，并受NO調(diào)節(jié)。研究者假設(shè)，VEGF/NRP2通過誘導(dǎo)基于KEAP1（Cullin 3的泛素連接酶的成分之一）的S-亞硝基化，促進(jìn)NFE2L2定位到細(xì)胞核。免疫熒光證明NRP2敲降和功能阻斷細(xì)胞中，NFE2L2核定位減少（圖5A和B）。研究者借助檢測NFE2L2靶基因的表達(dá)證明NRP2敲降導(dǎo)致NFE2L2穩(wěn)定性降低（圖5C）。為證明NFE2L2依賴NOS2發(fā)揮活性，研究者敲降NOS2表達(dá)或者抑制其功能，發(fā)現(xiàn)NFE2L2核定位減少取決于NOS2表達(dá)，而不是NRP2（圖5D）。

研究者發(fā)現(xiàn)使用NO清除劑c-PTIO會導(dǎo)致NFE2L2靶基因轉(zhuǎn)錄本減少；用對照組的培養(yǎng)液處理NRP2敲降細(xì)胞導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄本增多，添加c-PTIO則會抵消這種效果。向NRP2敲降細(xì)胞中添加NO供體SNAP可以增加NFE2L2核定位（圖5E）。接下來，研究者對在NRP2表達(dá)的細(xì)胞中NFE2L2靶基因的表達(dá)取決于NO產(chǎn)生和隨后KEAP1的S-亞硝基化進(jìn)行驗(yàn)證。研究者通過生物素轉(zhuǎn)化和碘-TMT轉(zhuǎn)化檢測S-亞硝基化水平。NRP2敲降細(xì)胞中KEAP1的S-亞硝基化水平明顯降低（圖5F和G）。進(jìn)一步，研究者構(gòu)建了一個沒有KEAP1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性NFE2L2（caNFE2L2）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入NRP2敲降細(xì)胞中。caNFE2L2的表達(dá)增加了輻射抵抗（圖5H）。研究者發(fā)現(xiàn)分級輻射僅能在對照細(xì)胞中誘導(dǎo)NFE2L2激活，而NRP2敲除細(xì)胞沒有這種反應(yīng)（圖5J）。這一結(jié)果表明，腫瘤在放射治療期間依賴于表達(dá)NRP2的細(xì)胞來促進(jìn)NFE2L2的激活，從而促進(jìn)抵抗性。

圖5 VEGF/NRP2通過Gli1調(diào)節(jié)NOS2轉(zhuǎn)錄

圖6 NFE2L2活性依賴于NRP2誘導(dǎo)的NOS2表達(dá)

6.單劑量或常規(guī)分次放療聯(lián)合VEGF/NRP2抑制可延緩腫瘤生長

為了探究VEGF/NRP2抑制增強(qiáng)體內(nèi)放射敏感性的潛力，研究者首先使用小鼠4T1三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞和單劑量放療建立了同種異體移植模型。單次10Gy放療劑量與aNRP2-28治療的組合顯著抑制了腫瘤生長，與單獨(dú)任一治療相比（圖6A）。此外，聯(lián)合治療比其他治療方案增加了腫瘤中的壞死（圖6B）。使用γH2AX作為放射敏感性的可靠標(biāo)記（37, 38），研究者觀察到與IgG對照相比，VEGF/NRP2功能阻斷抗體在放療后增加了γH2AX的表達(dá)（圖6C）。為了評估腫瘤的增殖能力，研究者分析了Ki-67的表達(dá)，并量化了有絲分裂細(xì)胞的數(shù)量。用aNRP2-28治療的腫瘤在Ki-67陽性細(xì)胞的百分比上顯著降低（圖6D）并且有絲分裂細(xì)胞數(shù)量減少，表明VEGF/NRP2功能阻斷抗體也限制了放療后的腫瘤增殖。研究者證實(shí)了之前的研究結(jié)果，即VEGF/NRP2抑制抑制了NOS2（圖6，E和F）和NFE2L2靶基因（圖6G）的表達(dá)。與對照組相比，放療的腫瘤中NOS2和NFE2L2靶基因的表達(dá)更高，而用aNRP2-28治療則減輕了這些通路的表達(dá)。然后，研究者分析了常規(guī)分割放療與aNRP2-28的組合效果。與單劑量放療實(shí)驗(yàn)類似，VEGF/NRP2抑制與常規(guī)分割放療的組合減輕了腫瘤的生長潛力（圖7A），在腫瘤內(nèi)增加了壞死（圖7B），并且增加了γH2AX的保留（圖7C）與單獨(dú)IgG與傳統(tǒng)分割放療組相比。此外，aNRP2-28和放療的聯(lián)合治療降低了NOS2（圖7D）和NFE2L2靶基因（圖7E）的表達(dá)，與單獨(dú)傳統(tǒng)分割放療組相比。關(guān)于aNRP2的作用和安全性，小鼠體重或正常乳腺實(shí)質(zhì)的組織學(xué)變化沒有顯著變化。

圖7 單劑量或常規(guī)分次放療聯(lián)合VEGF/NRP2抑制可延緩腫瘤生長

7.aNRP2分次放療促進(jìn)腫瘤消退

放療技術(shù)的進(jìn)步和幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)推動了在早期、低風(fēng)險乳腺癌中使用低分割放療。標(biāo)準(zhǔn)治療通常需要25次分割的50Gy，而低分割減少了5-15次分割的數(shù)量，每次分割的輻射劑量更高。在這個實(shí)驗(yàn)中，研究者使用了一種侵襲性的TNBC PDX模型。當(dāng)腫瘤達(dá)到適當(dāng)?shù)拇笮r，研究者開始按照圖8A中概述的進(jìn)行放療和抗體治療。單獨(dú)的分割放療或單獨(dú)的aNRP2-10對腫瘤生長沒有影響，這與TNBC對放療的已知不敏感性一致。然而，聯(lián)合治療導(dǎo)致顯著的腫瘤退縮（圖8B），降低了腫瘤重量并增加了壞死（圖8C）。研究者使用相同的實(shí)驗(yàn)方法與4T1移植模型，也導(dǎo)致與單獨(dú)分割放療相比，聯(lián)合治療組腫瘤退縮、腫瘤重量減輕和壞死增加。此外，與其它組相比，聯(lián)合治療組的腫瘤中檢測到更高水平的γH2AX（圖8D）。研究者觀察到與單獨(dú)放療相比，聯(lián)合治療組的腫瘤中NOS2和NFE2L2靶基因的表達(dá)顯著降低（圖8E）。最后，aNRP2與低分割放療的聯(lián)合治療對小鼠體重沒有影響，與單獨(dú)低分割組相比，在PDX或4T1模型中均無影響。

圖8 aNRP2分次放療促進(jìn)腫瘤消退

結(jié)果

這項(xiàng)研究揭示了癌癥中的一種信號通路，可用于提高腫瘤對放射治療的敏感性。具體而言，TNBC中具有依賴于VEGF/NRP2信號傳導(dǎo)的干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群作為局部產(chǎn)生NO的樞紐，促進(jìn)KEAP1等效應(yīng)蛋白的S-亞硝基化，使NFE2L2介導(dǎo)的抗氧化基因得以表達(dá)。因此，腫瘤細(xì)胞可以緩沖輻射誘導(dǎo)的ROS的積累，并減輕其下游效應(yīng)，包括DNA損傷和細(xì)胞死亡。使用功能阻斷的NRP2單克隆抗體來阻斷這些細(xì)胞的亞硝化能力，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對放射治療敏感性。

實(shí)驗(yàn)方法

基因表達(dá)譜分析、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析、RNA測序、免疫熒光和共定位分析、ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)、CRISPR-Cas9基因編輯、S-亞硝基化檢測、細(xì)胞培養(yǎng)與輻射處理、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞活力檢測、流式細(xì)胞術(shù)、ROS檢測、堿性彗星實(shí)驗(yàn)、NO濃度檢測、同種異體移植模型、患者來源的異種移植物模型

參考文獻(xiàn)

Kumar A, Goel H, Wisniewski C, et al. Neuropilin-2 expressing cells in breast cancer are S-nitrosylation hubs that mitigate radiation-induced oxidative stress. J Clin Invest. Published online October 1, 2024. doi:10.1172/JCI18136