CircMVP：結(jié)直腸癌免疫治療的新靶點(diǎn)

當(dāng)前結(jié)直腸癌（CRC）免疫治療效果受限于抗腫瘤免疫抑制，circRNA 與腫瘤免疫的關(guān)聯(lián)備受關(guān)注。研究人員經(jīng)生物信息分析、qRT-PCR、原位雜交等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CRC 患者中 circMVP 表達(dá)上調(diào)，且與預(yù)后不良相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circMVP 可促進(jìn) CRC 細(xì)胞增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤發(fā)生。機(jī)制上，circMVP 與 METTL3 相互作用，穩(wěn)定其在細(xì)胞核中的表達(dá)，增強(qiáng) CTNNB1 的 m6A 修飾，提升 β - 連環(huán)蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活B7-H3 表達(dá)，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。重要的是，抑制 circMVP 表達(dá)能顯著改善抗 B7-H3 免疫治療效果。該研究表明 circMVP 或可作為 CRC 免疫逃逸的預(yù)測指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn)，為 CRC 免疫治療開辟新思路。這篇文章于2025年1月發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF:8.2。

在結(jié)直腸癌樣本中共鑒定出228個獨(dú)特的circRNA候選分子。其中，與作為對照的配對正常組織相比，有19個circRNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，18個表達(dá)下調(diào)（log2|倍數(shù)變化|≥1且P<0.05；圖1A）。散點(diǎn)圖展示了結(jié)直腸癌組織與配對的相鄰正常組織之間circRNA表達(dá)的差異（圖1A）。circMVP（hsa_circ_0000688，別名_000014）由MVP基因第8外顯子反向剪接形成，剪接后序列長度為256nt（圖1B），在結(jié)直腸癌組織中呈穩(wěn)定上調(diào)趨勢。桑格測序也驗(yàn)證了其頭對尾融合位點(diǎn)的排列（圖1C）。Northern印跡分析表明circMVP在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)（圖1D）。

使用RKO（結(jié)直腸癌細(xì)胞）和293T細(xì)胞來研究circMVP的存在情況。通過設(shè)計(jì)特異性的發(fā)散引物和收斂引物進(jìn)行PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示存在circMVP的反向剪接形式或經(jīng)典形式，而非線性MVP（圖1E）。circMVP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)通過對RNase R消化的抗性得到證實(shí)（圖1F）。因此，對結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD1、HCT8、HCT116和RKO中的circMVP表達(dá)進(jìn)行了評估。在這些細(xì)胞系中，DLD1和RKO細(xì)胞分別表現(xiàn)出最高和最低水平的circMVP表達(dá)（圖1G）。此外，MVP的表達(dá)與circMVP的趨勢一致，且這些表達(dá)特征與circRNA的生成生物學(xué)過程相符（圖1G、圖1I）。

RNA熒光原位雜交（FISH）檢測顯示，circMVP主要定位于細(xì)胞核中，但在細(xì)胞質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)（圖1H）。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circMVP主要在細(xì)胞核中表達(dá)，部分在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖1I）。在結(jié)直腸癌樣本中，通過對切除組織切片進(jìn)行原位雜交（ISH）分析來評估circMVP的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常上皮組織相比，結(jié)直腸癌組織中circMVP的表達(dá)升高（圖1J）。通過單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）評估了結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的細(xì)胞組成。通過PCA對所有細(xì)胞進(jìn)行客觀聚類來闡明細(xì)胞組成，并使用UMAP進(jìn)行可視化展示，包括檢測CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類型（圖1K）。MVP和circMVP主要在上皮細(xì)胞（結(jié)直腸癌細(xì)胞）簇中表達(dá)（圖1L）。因此，作者研究了circMVP在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的具體表達(dá)情況。

測量了結(jié)直腸癌細(xì)胞系中circMVP的內(nèi)源性表達(dá)，選擇了circMVP表達(dá)相對較高的DLD1細(xì)胞和表達(dá)相對較低的HCT8細(xì)胞，并根據(jù)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，敲低circMVP顯著抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和集落形成，而circMVP過表達(dá)則促進(jìn)了這些過程（圖2A）。通過Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了circMVP對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示敲低circMVP抑制了DLD1和HCT8細(xì)胞的遷移和侵襲。相反，circMVP過表達(dá)則顯著促進(jìn)了這些過程（圖2C和2D）。此外，circMVP沉默抑制了小鼠體內(nèi)結(jié)直腸癌的致瘤性，而circMVP過表達(dá)則促進(jìn)了其致瘤性（圖2E和2F）。

通過對人類基因組和小鼠基因組的比較，發(fā)現(xiàn)circMVP在多種小鼠來源的細(xì)胞中表達(dá)，包括結(jié)直腸癌細(xì)胞，這進(jìn)一步證明了circMVP在物種間表達(dá)的保守性和穩(wěn)定性（圖2G）。通過在C57BL/6小鼠皮下接種MC38細(xì)胞建立MC38腫瘤模型。circMVP促進(jìn)了MC38細(xì)胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，敲低circMVP則阻礙了上述過程（圖2F - 2H）。確實(shí)，抑制circMVP可抑制結(jié)直腸癌的致瘤潛能，而其過表達(dá)則在C57BL/6小鼠中促進(jìn)了致瘤性（圖2H和圖2I）。此外，分析結(jié)直腸癌組織樣本的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞群落中MVP的轉(zhuǎn)錄水平顯著更高（圖2J、圖2K）。綜上所述，這些結(jié)果表明circMVP具有促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的功能。

在體外對circMVP轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行生物素標(biāo)記，以探索其下游分子。根據(jù)之前的結(jié)果，circMVP主要在結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。因此，使用核蛋白標(biāo)記鏈霉親和素磁珠進(jìn)行RNA下拉檢測（圖3A）。通過考馬斯亮藍(lán)染色鑒定與circMVP結(jié)合的蛋白質(zhì)。對特異性條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析和western blot分析，結(jié)果顯示circMVP直接與METTL3蛋白結(jié)合（圖3B、3C）。通過RNA免疫沉淀（RIP）檢測進(jìn)一步證實(shí)了circMVP與METTL3的結(jié)合，該檢測顯示了METTL3與circMVP的RIP結(jié)果（圖3D）。RNA電泳遷移率變動分析（EMSA）證實(shí)了circMVP的核酸與METTL3特異性結(jié)合。在DLD1細(xì)胞中進(jìn)行的IF和FISH檢測表明，circMVP和METTL3主要在細(xì)胞核中共定位（圖3E）。此外，作者觀察到抑制蛋白酶體活性可防止si-circMVP誘導(dǎo)的DLD1細(xì)胞內(nèi)源性METTL3下調(diào)，這表明circMVP抑制了METTL3通過泛素化途徑的降解（圖3F）。

使用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）來評估circMVP對METTL3降解過程的影響。在DLD1細(xì)胞中敲低circMVP延長了METTL3的降解時間（圖3G）。METTL3作為MTase復(fù)合物中的關(guān)鍵催化劑，參與m6A修飾的添加過程。因此，評估了METTL3對circMVP表達(dá)的影響。RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，circMVP與METTL3結(jié)合后穩(wěn)定性增加。分別轉(zhuǎn)染METTL3質(zhì)粒和siMETTL3以實(shí)現(xiàn)circMVP的過表達(dá)和敲低，這表明了circMVP對METTL3的調(diào)節(jié)作用（圖3H）。這些結(jié)果表明，circMVP與METTL3結(jié)合并穩(wěn)定其表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的下游作用。

METTL3作為MTase復(fù)合物中的催化核心，負(fù)責(zé)m6A修飾的整合過程。對circMVP介導(dǎo)的METTL3調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能評估顯示，通過斑點(diǎn)印跡檢測發(fā)現(xiàn)circMVP上調(diào)了RNA的m6A表達(dá)（圖4A）。當(dāng)敲低circMVP或METTL3時，METTL3和m6A的表達(dá)下降（圖4B）。相反，上調(diào)circMVP或METTL3后，METTL3和m6A的表達(dá)增加（圖4B）。接下來，對在HCT8細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)circMVP的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。GO分析表明，circMVP激活了包括免疫效應(yīng)過程、細(xì)胞間粘附和上皮細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程（圖4C）。KEGG分析表明，circMVP促進(jìn)了Wnt信號通路的激活、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、粘著斑以及細(xì)胞粘附分子等途徑（圖4D）。GSEA分析表明，circMVP促進(jìn)了Wnt/β - 連環(huán)蛋白信號通路的激活。此外，評估了由Wnt/β - 連環(huán)蛋白信號通路激活所調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄水平。circMVP過表達(dá)后，由β - 連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)的下游基因簇顯著上調(diào)（圖4E）。對細(xì)胞中circMVP、METTL3和β - 連環(huán)蛋白的表達(dá)和定位進(jìn)行IF分析，結(jié)果表明circMVP過表達(dá)穩(wěn)定了METTL3，并上調(diào)了β - 連環(huán)蛋白的表達(dá)和核異位。此外，這表明circMVP/METTL3可能通過β - 連環(huán)蛋白信號通路調(diào)節(jié)下游信號通路和轉(zhuǎn)錄激活（圖4F）。

m6A修飾參與mRNA代謝的多種分子過程，包括可變剪接、精確翻譯和mRNA穩(wěn)定性的精細(xì)調(diào)節(jié)。本研究旨在通過使用基于序列的RNA腺苷甲基化預(yù)測器，分析CTNNB1的RNA序列中m6A修飾位點(diǎn)的分布情況，以探究METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的影響。人類和小鼠的CTNNB1 mRNA均具有較高的m6A修飾置信區(qū)間。作者進(jìn)行了m6A甲基化免疫沉淀RNA測序（MeRIP - seq），IGV分析顯示METTL3基因敲除（KO）后CTNNB1轉(zhuǎn)錄本上的m6A峰減少。此外，基序富集分析揭示了上述m6A峰中存在一個共同的序列基序“GGACU”（圖4G）；因此，研究了METTL3的m6A修飾對CTNNB1轉(zhuǎn)錄本的影響。在分子水平上，m6A修飾在多種mRNA代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。為了闡明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對CTNNB1 mRNA代謝的影響，使用PCR - 瓊脂糖凝膠電泳對CTNNB1轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定性評估，并使用qRT - PCR對METTL3與CTNNB1 mRNA的結(jié)合進(jìn)行定量分析（圖4H）。此外，在小鼠腫瘤細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)Ctnnb1（小鼠β - 連環(huán)蛋白的基因符號），并隨后將MC38細(xì)胞用作本研究的體內(nèi)模型。這些結(jié)果表明，circMVP/METTL3催化β - 連環(huán)蛋白信號通路，并調(diào)節(jié)其下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。

YTHDF1是一種關(guān)鍵的m6A讀取蛋白，它通過與起始因子和核糖體相互作用，促進(jìn)m6A的沉積和mRNA的翻譯效率。研究了YTHDF1在METTL3對CTNNB1 mRNA的m6A “讀取” 效應(yīng)中的作用。RIP - qPCR和鏈霉親和素RNA下拉實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF1在內(nèi)源和外源均介導(dǎo)了β - 連環(huán)蛋白的增加，且DLD1細(xì)胞中CTNNB1的轉(zhuǎn)錄沒有顯著變化（圖4I）。qRT - PCR結(jié)果表明circMVP/METTL3不影響CTNNB1的轉(zhuǎn)錄。隨后，使用核糖體分析技術(shù)從對照組（NC）和circMVP組中分離出各種RNA組分。結(jié)果顯示，NC細(xì)胞中翻譯活躍的多聚核糖體（>80S）中CTNNB1 mRNA的表達(dá)顯著低于circMVP細(xì)胞，而在單體核糖體（<40S、40S、60S和80S）中的表達(dá)沒有顯著差異（圖4J）。值得注意的是，在DLD1細(xì)胞中過表達(dá)METTL3以及在HCT8細(xì)胞中下調(diào)METTL3后，觀察到m6A和β - 連環(huán)蛋白蛋白表達(dá)的恢復(fù)（圖4K）。

通過慢病毒將circMVP轉(zhuǎn)染到MC38小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞中，然后將這些細(xì)胞注射到同基因的C57BL6小鼠體內(nèi)，以研究circMVP在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。與NC組相比，circMVP組中通過ISH和IHC技術(shù)檢測到circMVP、METTL3、YTHDF1和β - 連環(huán)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)（圖5A）。此外，觀察到β - 連環(huán)蛋白核定位的細(xì)胞百分比增加（圖5A）。通過分離和收集腫瘤的單細(xì)胞懸液并進(jìn)行scRNA - seq，探索了circMVP對結(jié)直腸癌和腫瘤微環(huán)境（TME）的影響（NC組：18294個細(xì)胞；circMVP組：15040個細(xì)胞）。與NC組相比，circMVP組腫瘤中的T細(xì)胞和NK細(xì)胞顯著增加（圖5B）。對上皮細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞亞群進(jìn)行了進(jìn)一步聚類分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，circMVP過表達(dá)組中這些細(xì)胞均增加（圖5B）。作者假設(shè)circMVP通過誘導(dǎo)細(xì)胞中的負(fù)性刺激分子來抑制抗腫瘤免疫。檢查了上皮細(xì)胞的功能標(biāo)記物Grb2和Krt14，這些基因主要在上皮細(xì)胞簇中富集。通過分析結(jié)直腸組織中的TME細(xì)胞，研究了circMVP對結(jié)直腸癌發(fā)生過程中TME的影響。聚類分析顯示，與NC組相比，circMVP組中CD45+免疫細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DCs）顯著擴(kuò)增，而成纖維細(xì)胞收縮（圖5C和圖5D）。CD8+ T細(xì)胞是主要的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞，在腫瘤中具有重要作用，并以復(fù)雜的方式參與抗腫瘤免疫領(lǐng)域。本研究探索了circMVP對免疫細(xì)胞群體的影響，亞群分析顯示，與NC組相比，circMVP組中活化的CD8+ T細(xì)胞比例下降，而初始CD8+ T細(xì)胞比例增加（圖5E）。作者還評估了circMVP對NK細(xì)胞的影響。根據(jù)基因標(biāo)記物鑒定出成熟、未成熟和其他NK細(xì)胞亞型。在circMVP組中觀察到未成熟NK細(xì)胞比例增加，成熟NK細(xì)胞比例下降。在circMVP組中也發(fā)現(xiàn)了其他類型的NK細(xì)胞，但數(shù)量太少無法準(zhǔn)確鑒定（圖5F）。通過鑒定兩個亞群（CD86+巨噬細(xì)胞和其他未鑒定的巨噬細(xì)胞）來評估circMVP對巨噬細(xì)胞的影響（圖5G）。此外，在circMVP的作用下，Treg細(xì)胞簇進(jìn)一步分為自然Treg細(xì)胞；然而，由于數(shù)量減少，無法將其他群落確定為明確的Tregs亞群（圖5H）。

上述結(jié)果表明，circMVP可能通過影響T細(xì)胞干擾結(jié)直腸癌的適應(yīng)性免疫。分析腫瘤（上皮）細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)標(biāo)記物的表達(dá)，circMVP組中共刺激分子轉(zhuǎn)錄水平的改變支持了這一假設(shè)。通過對免疫細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，證實(shí)了circMVP對腫瘤中CD8+ T細(xì)胞比例的影響。circMVP過表達(dá)組中的CD8+ T細(xì)胞顯著低于NC組（圖5I）。對NC和circMVP標(biāo)記的CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行分析，circMVP組和NC組CD8+ T細(xì)胞中的差異表達(dá)基因表明，circMVP抑制了CD8+ T免疫反應(yīng)的激活（圖5J）。因此，體內(nèi)數(shù)據(jù)的結(jié)果支持了circMVP在結(jié)直腸癌中的免疫抑制功能。

circMVP 通過增強(qiáng) METTL3 來調(diào)節(jié) β- 連環(huán)蛋白的抗腫瘤免疫功能。circMVP的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步評估。先前的研究表明，腫瘤細(xì)胞中的 β- 連環(huán)蛋白作為共轉(zhuǎn)錄因子參與基因調(diào)控，包括調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CD276（編碼 B7-H3）的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)（圖 6A）。核質(zhì)分離結(jié)果顯示，在 DLD1 細(xì)胞中敲低 circMVP 后，METTL3、β- 連環(huán)蛋白和 B7H3 蛋白的表達(dá)均下降。circMVP過表達(dá)后，METTL3 表達(dá)增加，β- 連環(huán)蛋白的核信號增強(qiáng)，B7-H3 表達(dá)上調(diào)（圖 6B）。在敲低 circMVP 的 DLD1 細(xì)胞中，過表達(dá) METTL3 顯著逆轉(zhuǎn)了 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 蛋白的表達(dá)變化；而在 HCT8 細(xì)胞中，過表達(dá) circMVP 并下調(diào) METTL3 后，B7-H3 的表達(dá)也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（圖 6C）。

接下來，研究 circMVP通過 METTL3/β- 連環(huán)蛋白對 B7-H3 的調(diào)節(jié)作用。ChIP-seq 數(shù)據(jù)分析顯示，β- 連環(huán)蛋白作用于 CD276 的染色質(zhì)區(qū)域，并對 IGV 和 MEME 進(jìn)行基序分析（圖 6D）。ChIP PCR - 瓊脂糖凝膠電泳和 ChIP qPCR 分析均表明，β- 連環(huán)蛋白作用于 CD276 的啟動子區(qū)域，進(jìn)而調(diào)節(jié) CD276 轉(zhuǎn)錄的增加（圖 6E 和 6F）。IF 檢測顯示，敲低circMVP 的 DLD1 細(xì)胞中，METTL3 和 β- 連環(huán)蛋白的核異位現(xiàn)象減少（圖 6G）。敲低 circMVP 可能抑制 β- 連環(huán)蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的功能，qPCR 結(jié)果顯示 circMVP 和 METTL3 上調(diào)了 CD276 的表達(dá)（圖 6H）。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上，在穩(wěn)定過表達(dá) circMVP 的 DLD1 細(xì)胞中過表達(dá) METTL3，在穩(wěn)定過表達(dá) circMVP 的 HCT8 細(xì)胞中敲低 METTL3，然后進(jìn)行核質(zhì)分離檢測，結(jié)果表明 circMVP 促進(jìn)了 β- 連環(huán)蛋白的核定位以及 B7-H3 蛋白的增加。敲除 METTL3 則抑制了這一現(xiàn)象（圖 6I）。裸鼠腫瘤的 IHC 檢測顯示，敲低 circMVP 降低了 B7-H3 蛋白的表達(dá)，B7-H3 主要在結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)，而 circMVP 的表達(dá)上調(diào)（圖 6J）。為探究 METTL3 是否直接作用于 CD276 mRNA 從而影響 B7-H3 蛋白的表達(dá)，作者分析了 METTL3 甲基化的 RIPseq 數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn) CD276 中不存在 METTL3 作用的顯著峰值。上述結(jié)果表明，circMVP 可能通過促進(jìn) β- 連環(huán)蛋白結(jié)合 METTL3 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié) B7-H3 的表達(dá)。

circMVP 促進(jìn)腫瘤生成，并對 T 細(xì)胞效應(yīng)具有抑制作用（圖5J）。重要的是，這可能暗示結(jié)直腸癌對免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療的敏感性受到影響。因此，作者提出假設(shè)，針對 circMVP 生成或功能的干預(yù)措施可能會增強(qiáng) ICB 的治療效果，特別是對于circMVP 陽性且對 ICB 耐藥的腫瘤。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者用抗 B7-H3 抗體 Omburtamab，或 circMVP 陰性對照（NC）與敲低（shRNA）的組合，處理對 ICB 耐藥的 MC38 腫瘤（圖 7A）。與作者之前的發(fā)現(xiàn)一致，敲低 circMVP 抑制了腫瘤生長（圖 7B 和 7C）。此外，抗 B7-H3 組的腫瘤生長明顯低于抗 Ig 組。值得注意的是，抗B7-H3 與 circMVP 敲低聯(lián)合處理的小鼠表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制作用（圖 7B 和 7C）。盡管單一療法的療效在一定程度上令人滿意，但 circMVP 沉默與 ICB 聯(lián)合使用可顯著降低腫瘤負(fù)擔(dān)，而 circMVP + 抗 B7-H3 的聯(lián)合使用顯著提高了總體生存率（圖 7D）。對腫瘤中 circMVP敲低的 ISH 和 IHC 檢測還發(fā)現(xiàn)，它降低了 β- 連環(huán)蛋白的表達(dá)和核異位，同時下調(diào)了 B7-H3 的表達(dá)（圖 7E）。這些發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)鍵證據(jù)，表明 circMVP 可能抑制 T 細(xì)胞的抗腫瘤作用以及B7-H3 的 ICB 協(xié)同效應(yīng)。

通過 ISH 評估 circMVP 的表達(dá)，并用 IHC 檢測結(jié)直腸癌組織中 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 的蛋白表達(dá)，以此探究 circMVP 與其下游靶點(diǎn)之間的相關(guān)性（圖 8A）。研究結(jié)果顯示，在 circMVP 高表達(dá)組中，58.02%（94/162）的結(jié)直腸癌組織樣本表現(xiàn)出 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 表達(dá)水平的升高。這一比例明顯高于 circMVP 低表達(dá)組（圖 8B）。單因素和多因素 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析確定 circMVP、METTL3 和 B7-H3 為結(jié)直腸癌的重要預(yù)后因素（圖 8C 和 8D）。生存分析表明，circMVP 表達(dá)與不良生存相關(guān)（P=0.0009，圖 8E），在 TCGA 結(jié)直腸癌患者中，METTL3 高表達(dá)（P=0.0054）和 B7-H3 高表達(dá)（P=0.0184）也預(yù)示著不良預(yù)后。此外，結(jié)直腸癌樣本中 METTL3 和 B7-H3 蛋白的表達(dá)均與 circMVP 表達(dá)呈正相關(guān)（圖 8F）。

使用 TCGA（COAD 和 READ）外部結(jié)直腸癌隊(duì)列來驗(yàn)證B7-H3 作為結(jié)直腸癌潛在診斷和治療靶點(diǎn)的作用。TCGA-COAD 分析顯示，50.00%（135/270）的結(jié)直腸癌患者 B7-H3（CD276）高表達(dá)，且預(yù)后不良（P=0.046，圖 8G）。TCGA-READ 分析顯示，11.96%（11/92）的結(jié)直腸癌患者 B7-H3（CD276）高表達(dá)，且預(yù)后不良（P=0.020，圖 8G）。總體而言，作者的結(jié)果證明，METTL3 通過 circMVP 介導(dǎo)的 CTNNB1 mRNA 的 m6A 修飾促進(jìn)激活，CTNNB1 翻譯的蛋白 β- 連環(huán)蛋白在結(jié)直腸癌中上調(diào)，這抑制了腫瘤微環(huán)境中依賴 B7-H3 的免疫抑制。

這項(xiàng)研究證明了circMVP 在結(jié)直腸癌中的一種新的調(diào)控功能，該功能促進(jìn)癌細(xì)胞生長和免疫抑制。circMVP 與 METTL3 結(jié)合，調(diào)節(jié) CTNNB1 mRNA 的 m6A 甲基化，上調(diào)β-連環(huán)蛋白蛋白，并激活 B7-H3 表達(dá)。抑制 circMVP 表達(dá)干擾了 CRC 中 B7-H3 依賴的抗癌免疫。鑒定 circMVP/METTL3/β-連環(huán)素/B7-H3 信號軸為免疫抑制和腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制提供了新的見解，為 CRC 確定了新的免疫治療靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄組測序、單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA - seq）、MeRIP 測序分析、空間轉(zhuǎn)錄組測序分析、ISH、FISH、Western blot 、Northern blot、RNA pull-down、RIP、EMSA、PCR、IHC和IF染色、m6A dot blot、ChIP、細(xì)胞培養(yǎng)、集落形成、CCK-8、transwell、流式細(xì)胞術(shù)、小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)

Wang F, Wang Q, Wu Y, Huang Z, Zhong X, Wang H, Yang C, Qin Y, Qi X, Ge X, Mao Y. CircMVP promotes METTL3 activation mediated CTNNB1 m6A modification in the inhibition of colorectal cancer in B7-H3 dependence antitumor immunity. Int J Biol Sci. 2025 Jan 1;21(1):306-327. doi: 10.7150/ijbs.105324. PMID: 39744434; PMCID: PMC11667818.