乙酰轉移酶NAT10通過DDX5/HMGB1軸抑制T細胞免疫，促進鼻咽癌進展

鼻咽癌是一種典型的腫瘤性腫瘤，其特征是多種免疫細胞浸潤到腫瘤內(nèi)部和腫瘤周圍，主要是淋巴細胞（T細胞和B細胞）、樹突狀細胞、單核巨噬細胞、粒細胞和肥大細胞。T細胞和B細胞約占浸潤細胞的90%雖然放療是鼻咽癌的主要治療方式，但其在晚期或轉移性腫瘤患者中的療效有限免疫療法已成為包括鼻咽癌在內(nèi)的各種癌癥的一種有前景的治療方法，因為它具有靶向獨特腫瘤微環(huán)境的潛力。然而，由于鼻咽癌免疫抑制微環(huán)境的復雜性，這種方法存在局限性。因此，進一步研究鼻咽癌患者腫瘤微環(huán)境中免疫抑制的機制是必要的。該文章于2025年2月發(fā)表在《Journal for immunotherapy of cancer》，IF：10.3。

為了研究ac4C修飾對鼻咽癌免疫微環(huán)境的影響，作者首先使用免疫組織化學（IHC）方法評估了150個鼻咽癌組織微陣列中NAT10的表達。染色強度和陽性染色率均分為4個等級（1 ~ 4分），其乘積形成總分。使用X-tile軟件對最終染色強度進行量化，低表達為1-8，高表達為9-16。IHC評分與鼻咽癌臨床結局的相關性分析顯示，與臨床I期和II期鼻咽癌患者相比，臨床III期和IV期鼻咽癌患者的NAT10表達增高。這些發(fā)現(xiàn)表明NAT10表達失調(diào)與終末期鼻咽癌之間存在潛在關聯(lián)（圖1A，B）。此外，NAT10上調(diào)與鼻咽癌復發(fā)和轉移有顯著相關性（圖1C，D）。

生存率分析顯示，NAT10高表達患者的臨床預后較低表達患者差（圖1E）。這些發(fā)現(xiàn)被來自基因表達綜合數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖譜（TGCA）數(shù)據(jù)庫的隊列證實。此外，作者利用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)檢測了NAT10在不同人類癌癥中的表達，發(fā)現(xiàn)NAT10在頭頸癌中表達較高，并將其列為前五大腫瘤之一。作者也證實了NAT10在鼻咽癌細胞中的過表達。

隨后對NPC和正常組織中ac4C修飾水平的評估顯示，與正常組織相比，NPC組織中ac4C表達顯著增加（圖1F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，NAT10介導的ac4C修飾是一種有價值的生存生物標志物，與鼻咽癌進展有關。為了探索NAT10和ac4C修飾在NPC中的致癌作用，作者用GFP標簽或CRISPR-Cas9轉染NAT10慢病毒，在CNE2細胞中過表達或敲除NAT10并驗證其效率。Cas9細胞中ac4C修飾水平降低，如點狀染色所示（圖1G）。

接下來，作者通過植入NAT10敲除、NAT10過表達和控制鼻咽癌細胞的小鼠腫瘤異種移植和轉移模型，在體內(nèi)研究了NAT10促進生長和轉移的功能。腫瘤異種模型顯示NAT10促進腫瘤體積和腫塊生長（圖1H，I），免疫組化結果顯示NAT10與Ki67呈正相關（圖1J-M）。腫瘤轉移模型顯示NAT10通過生物發(fā)光促進鼻咽癌肺轉移（圖1N，O），肺組織H&E染色顯示腫瘤病變與NAT10表達呈正相關（圖1P）。作者還發(fā)現(xiàn)NAT10促進鼻咽癌細胞體外增殖和轉移。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)提示NAT10介導的ac4C修飾促進鼻咽癌的增殖和轉移，并與鼻咽癌的預后有關。

腫瘤的惡性程度、轉移程度、復發(fā)程度往往與免疫抑制微環(huán)境，尤其是T細胞功能不足密切相關。人類鼻咽部表現(xiàn)出多種免疫浸潤，先前的單細胞測序研究表明，正常鼻咽部組織主要由T淋巴細胞和B淋巴細胞組成。在炎癥的情況下，B細胞在鼻咽組織中更加豐富，而T細胞在鼻咽癌的腫瘤微環(huán)境中普遍存在。隨著鼻咽癌的進展，腫瘤微環(huán)境中T細胞的功能受到明顯抑制。為了研究ac4C修飾對NPC免疫微環(huán)境的影響，作者分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中免疫數(shù)據(jù)庫TIMER2.0中的HNSCC。分析顯示，NAT10的表達與T細胞、樹突狀細胞（DC）、自然殺傷細胞（NK細胞）、B細胞、中性粒細胞和巨噬細胞呈顯著負相關（圖2A）。此外，為了證實NAT10在NPC中的免疫抑制作用，作者利用CRISPR/Cas9技術培育了NAT10敲除C57BL/6小鼠，命名為C57BL/6 NAT10em1Smoc。對未經(jīng)處理的C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠的外周血流式細胞儀面板分析顯示，敲除NAT10顯著增加CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和dc的百分比（圖2B-D）。進一步分析C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠外周血中3萬個細胞的T - distributed random Neighbor Embedding（T-sne）亞群，作者發(fā)現(xiàn)NAT10敲除組CD4+T細胞和CD8+T細胞顯著增加，而dc數(shù)量較少且無顯著變化（圖2E，F）。此外，C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc的外周血特異性t細胞分析結果相同。隨后的T細胞殺傷實驗表明，NAT10-Cas9鼻咽癌細胞更容易被T細胞殺死（圖2G，H）。此外，將人T細胞注入裸鼠尾靜脈，皮下植入敲除或過表達或?qū)φ盏?/span>NPC細胞，研究人T細胞與不同類型NPC細胞的相互作用（圖2I）。結果顯示，鼻咽癌細胞對t細胞殺傷敏感，與對照組相比，敲除NAT10可顯著提高鼻咽癌細胞的t細胞免疫（圖2J，K）。此外，利用CNE2和C666-1細胞系，作者發(fā)現(xiàn)NAT10缺乏增強了T細胞的活力，促進了T細胞向腫瘤中心募集（圖2L，M）。

腫瘤細胞分泌T細胞浸潤所需的細胞因子，如CXCL9、CXCL10、CXCL16，可有效擴增CD8+ T細胞29趨化因子是一種小分子量（8-14 kDa）的多功能細胞因子，在炎癥期間指導免疫細胞向特定組織的遷移中起著至關重要的作用隨后，作者研究了是否有其他分泌蛋白受NAT10調(diào)控，從而影響腫瘤免疫抑制微環(huán)境的發(fā)展。在條件培養(yǎng)基中，使用蛋白質(zhì)陣列對CNE2細胞和C666-1細胞中表達或不表達NAT10 Cas9的一組趨化因子進行定量。結合CNE2和C666-1的交集，作者發(fā)現(xiàn)CXCL16是受NAT10影響的最穩(wěn)定、最顯著、最獨特的趨化因子（圖2N）。此外，ELISA結果顯示，在細胞上清中缺乏NAT10后，CXCL16表達顯著增加（圖2O）。CXCL16在促進t細胞存活和協(xié)調(diào)CD8+T細胞擴增中起關鍵作用。CXC- CXCL9和CXCL10作為CXC趨化因子受體3的配體參與腫瘤微環(huán)境中TH1、CD8+ T和NK細胞的募集是重要的然后，T細胞和CNE2細胞共培養(yǎng)實驗顯示，NPC細胞敲除NAT10減少了周圍T細胞的凋亡（圖2P）。綜上所述，ac4C修飾不僅抑制T細胞的募集和功能，還會影響腫瘤微環(huán)境中細胞因子的分泌，這可能是T細胞募集的原因，是免疫抑制的一種表現(xiàn)。綜上所述，NAT10敲除可促進T細胞和趨化因子活性，從而抑制腫瘤進展。

作者使用對照和NAT10 Cas9 CNE2細胞進行了乙?；?/span>RNA免疫沉淀測序（acRIP-seq）和RNA測序（RNA-seq）的聯(lián)合分析，以研究NPC中與t細胞募集相關的潛在ac4c修飾mRNA靶點（圖3A）。基因表達譜的相關分析顯示，181個差異表達基因至少有兩倍的變化。其中，61個基因顯著下調(diào)（圖3B）。隨后對ac4C修飾的評估顯示，在Cas9細胞中，ac4C基序的富集顯著減少，尤其是“CXXCXXCXX”基序。此外，作者觀察到ac4C位點在翻譯起始位點附近聚集，大多數(shù)位點位于編碼序列內(nèi)。野生型（WT）組有3448個獨特的ac4C修飾峰和2896個獨特的ac4C基因，而Cas9組有2850個獨特的ac4C修飾峰和2458個獨特的ac4C基因。鑒于NAT10作為乙酰轉移酶的作用，作者推測WT組中出現(xiàn)的基因可能包含NAT10的真正靶點。作者將acRIP-seq和RNA-seq交聯(lián)，分析了181個差異表達基因（fold change≥2，FDR<0.05），鑒定出87個下調(diào)基因和94個上調(diào)基因。該分析確定了28個與Cas9組中ac4C低乙?；?/span>mRNA水平相關的基因。在這些基因中，有10個被鑒定為轉錄因子或轉錄輔助因子，占分析基因總數(shù)的三分之一以上（圖3C）。

基因本體分析顯示，ac4C峰降低的基因與多種生物過程有關，包括mRNA轉錄和細胞生長。結合mRNA和蛋白表達水平分析，發(fā)現(xiàn)ac4C顯著調(diào)控3個基因，包括轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白γ (CEBPG)、轉錄輔助因子死盒解旋酶5（DDX5）和解旋酶樣轉錄因子（HLTF），它們在抑制NAT10時均能顯著下調(diào)mRNA和蛋白水平（圖3D，E。在NAT10基因敲除后，ac4C修飾豐度降低了CEBPG、DDX5和HLTF的ac4C修飾豐度，正如整合基因組學觀察器（Integrative Genomics Viewer）示意圖所證實的那樣，ac4C修飾峰減少（圖3F，G）。此外，RIP實驗證實，敲除NAT10可抑制其與CEBPG、DDX5和HLTF rna的相互作用（圖3H）。因此，NAT10促進CEBPG、DDX5和HLTF的ac4C乙?；?。

接下來，作者探討了ac4c介導的CEBPG、DDX5和HLTF調(diào)控的潛在機制。作者的研究結果表明，在WT和NAT10 Cas9 CNE2細胞之間，CEBPG、DDX5和HLTF的啟動子活性沒有顯著差異。隨后，用放線菌素- d處理WT和NAT10 Cas9細胞以抑制轉錄。結果顯示，NAT10的缺失顯著影響了CNE2細胞中CEBPG、DDX5和HLTF mRNA的穩(wěn)定性，表明NAT10在調(diào)節(jié)這些基因的轉錄中起著至關重要的作用。此外，作者還研究了ac4C是否會調(diào)節(jié)CEBPG、DDX5和HLTF的表達，而不僅僅是mRNA的穩(wěn)定性。為此，轉染了載體或NAT10過表達構建體的WT細胞用L-leucinamide（MG132）處理以抑制蛋白酶體活性，或用環(huán)己亞胺（CHX）處理以阻斷蛋白質(zhì)翻譯。數(shù)據(jù)顯示，MG132（而非CHX）的存在減弱了NAT10誘導的CEBPG、DDX5和HLTF的表達。這表明NAT10調(diào)節(jié)的是蛋白質(zhì)翻譯，而不是CEBPG、DDX5和HLTF的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或翻譯后修飾。阻斷蛋白翻譯作用下，WT和NAT10 Cas9 CNE2細胞中CEBPG、DDX5和HLTF的半衰期無顯著差異，進一步支持了這一發(fā)現(xiàn)。綜上所述，ac4C乙?；龠M了CEBPG、DDX5和HLTF mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。

大多數(shù)轉錄因子對于控制細胞功能和啟動特定基因的轉錄是必不可少的。因此，作者探討這三種轉錄因子是否調(diào)控NAT10的表達。結果顯示，siHLTF處理降低了NAT10水平，而shDDX5和siCEBPG處理無顯著差異（圖4A）。然而，體外實驗證實CEBPG、DDX5和HLTF促進CNE2細胞的增殖和遷移，從而影響鼻咽癌的惡性進展。隨后，染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）實驗顯示，HLTF特異性定位于NAT10的啟動子區(qū)域，并在促進NAT10轉錄中發(fā)揮作用（圖4B）。此外，熒光素酶報告基因進一步證實，當HLTF結合的NAT10啟動子區(qū)域發(fā)生突變時，HLTF的轉錄活性被顯著抑制（圖4C）。考慮到轉錄因子需要在細胞核中發(fā)揮轉錄調(diào)控作用，作者探討了NAT10是否會影響HLTF進入和退出細胞核。結果表明，過表達NAT10促進了HLTF的核定位，而敲除NAT10則具有相反的作用，促進了HLTF從細胞核中退出（圖4D-F）。綜上所述，HLTF作為下游靶基因受NAT10調(diào)控，同時作為上游轉錄因子調(diào)控NAT10的表達，形成一個正反饋回路（圖4G）。

為了進一步探討CEBPG、DDX5和hTF如何影響T細胞介導的免疫抑制，作者使用CHIPBase和hTF靶點數(shù)據(jù)庫預測它們的下游基因。分析結果顯示，CEBPG調(diào)控下游基因1300個，DDX5調(diào)控下游基因7031個，HLTF沒有任何預測結果。NAT10受HLTF的轉錄調(diào)控；因此，作者將先前測序數(shù)據(jù)中NAT10乙?；捅磉_水平變化一致的基因（fold change≥2，FDR<0.05）與CEBPG和DDX5的預期下游靶標進行了比較，并確定HMGB1是唯一的靶基因（圖5A）?；?/span>TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)HNSCC中CEBPG、DDX5、HLTF與HMGB1呈正相關。轉染DDX5特異性慢病毒短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低DDX5后，HMGB1表達隨之下降（圖5B）。正如預期的那樣，CEBPG和HLTF的沉默導致HMGB1表達降低（圖5C）。通過CHIP實驗，作者證實了DDX5和CEBPG存在于HMGB1的啟動子區(qū)域，而不是HLTF（圖5D）。研究廣泛探討了CEBP家族成員與HMGB134的關系；因此，作者專注于DDX5。Western blot分析顯示，DDX5在NPC細胞中的表達水平高于NP69細胞。DDX5和HMGB1組織芯片的免疫組化分析顯示，DDX5和HMGB1表達上調(diào)與鼻咽癌的臨床分期、復發(fā)、轉移及轉歸有顯著相關性（圖5E-M）。結合免疫組化評分，作者證實DDX5與HMGB1呈正相關（圖5N）。

為了進一步支持NAT10-DDX5- hmgb1軸有助于增強惡性腫瘤的斷言，CNE2細胞接受NAT10 Cas9處理，隨后用帶或不帶hmgb1 shrna的過表達慢病毒NAT10或DDX5轉導。抑制NAT10可降低鼻咽癌細胞的轉移和生長，盡管這些作用被DDX5過表達減弱。同樣，DDX5對鼻咽癌細胞增殖和轉移的抑制作用被HMGB1抵消。免疫組化分析顯示，在鼻咽癌異種移植組中，NAT10、DDX5和HMGB1的表達升高，表明惡性表型加速。綜上所述，這些結果表明DDX5和HMGB1的存在對于NAT10對鼻咽癌惡性特征的影響至關重要。

接下來，作者通過靜脈注射外源性人T細胞建立裸鼠腫瘤異種移植模型，檢測NAT10是否通過分泌HMGB1介導鼻咽癌免疫抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，NAT10敲除抑制了鼻咽癌細胞的增殖潛能。然而，慢病毒HMGB1轉染后，增殖能力恢復（圖6A-C）。作者推測NAT10可能通過分泌HMGB1來逃避免疫細胞的殺傷。研究表明，NAT10通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)（包括HMGB1）和一系列趨化因子的分泌來影響t細胞的數(shù)量，進而影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫細胞浸潤，從而建立免疫抑制微環(huán)境，使免疫細胞能夠逃避攻擊。盡管免疫檢查點阻斷療法已證明對許多癌癥患者有顯著的益處，但其他問題仍有待解決，包括患者選擇標準和開發(fā)聯(lián)合療法以增強對單一療法的耐藥性或敏感性。因此，作者確定了NAT10是否會影響癌細胞對PD-1免疫檢查點阻斷治療的反應。此外，與對照C57BL/6小鼠相比，注射熒光素酶慢病毒的Lewis肺癌細胞系（LLC）在C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠皮下異種移植模型中的增殖能力顯著降低（圖6D-G）。隨后對PD-1阻斷治療有效性的評估顯示，NAT10缺陷小鼠的腫瘤對治療的敏感性增加（圖6D-G）。然而，HMGB1過表達使得腫瘤對抗PD-1治療脫敏，腫瘤體積證明了這一點（圖6D-G）。此外，作者分析了小鼠外周血中CD4+和CD8+ T細胞的比例，表明NAT10缺乏增強了T細胞（圖6H，I）。這些結果在C57BL/6 NAT10em1Smoc和C57BL/6小鼠皮下移植CNE2細胞模型中得到進一步證實（圖6J）。此外，CNE2 oeHMGB1或CNE2 NC與T細胞共培養(yǎng)表明，腫瘤來源的HMGB1促進T細胞凋亡（圖6K）。綜上所述，這些結果表明NAT10在調(diào)節(jié)腫瘤細胞對抗PD-1治療的反應中起作用。

總之，作者闡明了NAT10對鼻咽癌免疫抑制微環(huán)境的影響。NAT10是目前唯一已知的ac4C乙酰轉移酶，可促進HLTF、DDX5和CEBPG mRNA的ac4C乙酰化。這種修飾主要通過DDX5/HMGB1軸抑制鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中CD4+和CD8+ T細胞的激活。這些發(fā)現(xiàn)為鼻咽癌免疫治療策略的發(fā)展提供了新的見解。

實驗方法：

序列基序分析、基因表達數(shù)據(jù)分析、轉錄組數(shù)據(jù)分析、乙?；疪NA免疫沉淀測序和RNA測序、基因表達分析、基因編輯與過表達、RNA穩(wěn)定性實驗、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實驗、染色質(zhì)免疫沉淀、熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RNA結合蛋白免疫沉淀、細胞培養(yǎng)與處理、細胞增殖與遷移實驗、流式細胞術、免疫熒光（IF）和免疫組化（IHC）染色、共培養(yǎng)實驗、裸鼠腫瘤異種移植模型、CRISPR-Cas9基因敲除小鼠模型、免疫治療反應評估

參考文獻：

Xie, H., Zhang, K., Yin, H., Zhang, S., Pan, S., Wu, R., Han, Y., Xu, Y., Jiang, W., & You, B. (2025). Acetyltransferase NAT10 inhibits T-cell immunity and promotes nasopharyngeal carcinoma progression through DDX5/HMGB1 axis.Journal for immunotherapy of cancer, 13(2), e010301. https://doi.org/10.1136/jitc-2024-01030