巨噬細胞自噬通過降解TARM1抑制腎臟炎癥從而預防急性腎損傷

腎小管上皮細胞中的大自噬/自噬激活可防止急性腎損傷（AKI）。然而，免疫細胞自噬（如涉及巨噬細胞的自噬）在AKI 中的作用仍不清楚。在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)巨噬細胞自噬是AKI 期間的一種適應性反應，因為在LPS 或單側(cè)缺血再灌注誘導的AKI 期間，與WT 小鼠相比，巨噬細胞特異性自噬缺陷（atg5^-/-）小鼠表現(xiàn)出更高的血清肌酐、更嚴重的腎小管損傷、ADGRE1/F4/80+巨噬細胞浸潤增加以及炎癥因子表達升高。在氯膦酸脂質(zhì)體誘導的巨噬細胞耗竭小鼠中，采用轉(zhuǎn)移atg5^-/- 巨噬細胞（而非 WT 巨噬細胞）引起更嚴重的AKI 進一步證實這一點。在體外也得到類似的結(jié)果，即缺乏Atg5 的骨髓源巨噬細胞（BMDMs）對LPS 和IFNG 的反應在很大程度上增加促炎細胞因子的表達。機理上，Atg5基因缺失顯著上調(diào)TARM1（髓樣細胞上與T 細胞相互作用的活化受體1）的蛋白表達，而抑制TARM1 則抑制LPS 和IFNG 誘導的atg5^-/- RAW 264.7 巨噬細胞炎癥反應。E3泛素連接酶MARCHF1和MARCHF8泛素化TARM1，并以自噬依賴的方式促進其降解，而沉默或突變MARCHF1和MARCHF8的功能域則取消TARM1的降解。此外，泛素化的TARM1 從質(zhì)膜內(nèi)化到內(nèi)體，然后被泛素結(jié)合的自噬受體TAX1BP1 和SQSTM1 招募到自噬-溶酶體途徑中降解?？傊?，巨噬細胞自噬可通過MARCHF1和MARCHF8介導的TARM1降解抑制腎臟炎癥，從而預防AKI。該研究于2025年1月發(fā)表在《Autophagy》，IF：14.6。

作者首先研究了AKI患者和小鼠腎巨噬細胞中的自噬現(xiàn)象。單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，在紅外誘導的 AKI（IR-AKI）小鼠的腎巨噬細胞中，Atg5、Atg7、Atg12、Lc3、Sqstm1、Lamp1 和 Lamp2 等自噬基因的表達量比在假小鼠腎巨噬細胞中的表達量要高（圖 1A）。免疫熒光分析顯示，與極小變化腎病/MCN 患者相比，AKI 患者 CD68⁺ 巨噬細胞中 MAP1LC3/LC3（微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3）的表達升高（圖 1B）。這些數(shù)據(jù)表明，自噬是 AKI 期間腎巨噬細胞的一種適應性反應。

為監(jiān)測自噬通量，構(gòu)建巨噬細胞特異性串聯(lián)標記的mCherry-EGFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠，當游離自噬體與溶酶體因酸性而融合時，游離自噬體中的黃色熒光顆粒（mCherry-EGFP-LC3）會變成紅色熒光（mCherry-LC3），從而實現(xiàn)巨噬細胞中自噬體動態(tài)的可視化。免疫熒光分析顯示，與對照組小鼠相比，IR-AKI 和脂多糖（LPS）誘導的敗血癥相關(guān)性 AKI（SA-AKI）小鼠腎臟 ADGRE1/F4/80⁺ 巨噬細胞數(shù)量增加，自噬體（黃色點）和自溶酶體（僅紅色點）增加（圖 1C、D）。這些數(shù)據(jù)表明，在 AKI 進展過程中，腎巨噬細胞中的自噬被激活。

為研究巨噬細胞自噬在AKI中的作用，將Lyz2（溶菌酶2）-Cre與Atg5^flox/+小鼠雜交，產(chǎn)生巨噬細胞自噬缺陷小鼠（atg5^-/-小鼠）和Atg5flox/flox（WT）對照小鼠。如圖 2A 所示，LPS（5 毫克/千克）處理后 12 小時，atg5^-/- 小鼠的死亡率為 50%，36 小時后增至 100%。相反，WT 小鼠表現(xiàn)出對 LPS 的抵抗力，在整個實驗期間死亡率僅為五分之一。因此，將 LPS 的劑量降至 1 mg/kg（體重），以防止 atg5^-/- 小鼠死亡。與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠的血清肌酐（Scr）水平升高（圖2B）。此外，腎臟的病理損傷加劇，與WT小鼠相比，Atg5^-/-小鼠腎小管損傷的標志物HAVCR1/KIM-1上調(diào)（圖2C-F）。因此，與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠發(fā)生更嚴重的SA-AKI。這些發(fā)現(xiàn)在IR-AKI中得到進一步證實。此外，與 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠的腎小管損傷更嚴重，HAVCR1 表達更高（圖 2G-J）?？傊@些結(jié)果說明巨噬細胞自噬可保護小鼠免受 LPS 和 IR 誘導的 AKI 的影響。

如圖 3A 和 B 所示，與患有 SA-AKI 的 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠腎組織中的 ADGRE1+ 巨噬細胞更為明顯。此外，在SA-AKI期間，與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠腎臟炎癥因子（包括CCL2/MCP-1、NLRP3和IL18）的表達明顯上調(diào)（圖3C、D）。與SA-AKI中的情況一樣，巨噬細胞中Atg5的缺失也會明顯增強ADGRE1+巨噬細胞的浸潤（圖3E、F）和atg5^-/-小鼠腎臟炎癥細胞因子的產(chǎn)生（圖3G、H）。體外研究也證實類似的結(jié)果，體外研究顯示，與WT BMDMs相比，LPS和IFNG刺激顯著增加atg5^-/-BMDMs中NOS2、NLRP3和IL18的蛋白水平（圖3I、J）。這些結(jié)果表明，巨噬細胞自噬可抑制 AKI 中的腎臟炎癥。

在Lyz2-Cre下缺失Atg5不僅會破壞巨噬細胞的自噬，還會破壞中性粒細胞系的自噬，而中性粒細胞系也會導致AKI中的腎臟炎癥。為排除這種可能性，接下來利用過繼轉(zhuǎn)移實驗檢驗自噬是否能通過抑制巨噬細胞介導的炎癥反應來減輕 AKI（圖 4A）?？肆_膦酸脂質(zhì)體誘導的巨噬細胞消耗保護了SA-AKI 小鼠的腎損傷和炎癥反應（圖 4B-D、J），證明巨噬細胞是驅(qū)動 AKI 的關(guān)鍵免疫細胞成分。此外，與 WT RAW 264.7 巨噬細胞相反，在接受 SA-AKI 的巨噬細胞缺失 WT 小鼠中，采納轉(zhuǎn)移 atg5^-/- RAW 264.7 巨噬細胞會明顯損害腎功能并加劇腎小管損傷（圖 4B-D）。同樣，與向巨噬細胞耗竭的 WT 或 atg5^-/-小鼠移入 WT BMDMs 相比，移入 atg5^-/- BMDMs 會顯著加重腎小管病變、上調(diào) HAVCR1 表達和升高血清肌酐（圖 4E-I）。此外，與接受 WT 巨噬細胞的小鼠相比，自噬缺陷巨噬細胞的過繼轉(zhuǎn)移明顯增加巨噬細胞耗竭 WT 小鼠腎臟中這些炎癥分子的水平（圖 4J、K）。這些結(jié)果進一步證實，自噬缺陷的巨噬細胞是導致 AKI 中腎小管過度損傷和腎臟炎癥的罪魁禍首。

為探索自噬抑制巨噬細胞促炎活性的機制，對受到LPS和IFNG刺激的WT小鼠和atg5^-/-小鼠的BMDMs進行了蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果顯示，分別有15個和10個蛋白質(zhì)被顯著上調(diào)和下調(diào)（|log2 fold|>2，p < 0.05）（圖5A）。其中，新發(fā)現(xiàn)的白細胞免疫球蛋白樣受體家族成員TARM1與WT BMDMs相比，在LPS和IFNG處理后在atg5^-/-BMDMs中明顯上調(diào)（圖5B，C）。此外，在 SA-AKI 期間，與 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠腎組織中的 TARM1 也明顯上調(diào)（圖 5D、E）。有趣的是，通過 siRNA 或固定競爭性 TARM1-FC 融合蛋白抑制 TARM1 能顯著抑制 LPS- 和 IFNG 誘導的 Atg5 缺陷 RAW 264.7 巨噬細胞中 NOS2 或 IL18 的表達（圖 5F-K）。這些結(jié)果表明，自噬缺陷誘導的TARM1通過SYK-NFKB信號通路激活促炎巨噬細胞。

自噬-溶酶體途徑和蛋白酶體系統(tǒng)是細胞蛋白質(zhì)降解的兩個主要途徑，這一點已得到公認。在本研究中，蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 BMDMs 不會改變 TARM1 的表達（圖 6C，D）。相反，自噬激活劑 Rap 或 torin1 誘導的自噬下調(diào) BMDMs 中 TARM1 的表達；然而，CQ 或巴佛洛霉素 A1（Baf）抑制自噬增加 TARM1 的水平（圖 6E，F），這表明巨噬細胞 TARM1 是通過自噬-溶酶體途徑而不是蛋白酶體途徑降解的。

以前的研究表明，細胞膜受體在泛素化后被轉(zhuǎn)運到內(nèi)體，然后被分類到溶酶體降解。然而，最近的研究表明，自噬參與膜受體的降解。在這里，作者發(fā)現(xiàn)，通過刪除 Atg5 或用自噬抑制劑沃特曼寧（Wortmannin）和 LY294002 處理來抑制自噬體的形成，導致 TARM1 在 RAW 264.7 巨噬細胞中積累。同時抑制自噬體的形成和溶酶體的功能并不會導致 TARM1 表達的進一步上調(diào)（圖 6G-J），這表明自噬體和溶酶體以相同的途徑降解巨噬細胞中的 TARM1。

泛素化是蛋白質(zhì)降解不可或缺的步驟。假設巨噬細胞的 TARM1 首先被 E3 泛素連接酶泛素化，如圖 7A 所述內(nèi)化到內(nèi)體，被 LC3 陽性的自噬體吞噬進入溶酶體降解。為解決這些假設，首先探討哪種 E3 泛素連接酶介導 TARM1 泛素化，這是 TARM1 被自噬受體識別并轉(zhuǎn)運至自噬-溶酶體降解的關(guān)鍵修飾。利用在線工具 UbiBrowser 2.0 (http://ubibrowser.bio-it.cn/ubibrowser_v3/home/index)預測在人類和小鼠中保守的 E3 泛素連接酶 MARCHF1、MARCHF8 和 SYTL4 可介導 TARM1 泛素化（圖 7B）。用 TARM1-Flag 和空載體或 MARCHF1-MYC、MARCHF8-MYC 或 SYTL4-MYC 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞。強制表達 MARCHF1 或 MARCHF8 以劑量依賴的方式降解 TARM1，而 SYTL4 的過表達不改變 TARM1 的水平（圖 7C）。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，CQ抑制MARCHF1和MARCHF8誘導的TARM1降解，而蛋白酶體抑制劑MG132沒有抑制這種降解（圖7D），這支持MARCHF1和MARCHF8通過自噬而不是蛋白酶體介導的蛋白水解誘導TARM1降解。此外，共免疫沉淀實驗進一步表明，MARCHF1 和 MARCHF8 與 TARM1 相互作用并促進其泛素化（圖 7E、F）。與此相反，當 MARCHF1 和 MARCHF8 的功能域發(fā)生突變時，它們在 TARM1 泛素化和降解中的功能喪失（圖 7G）。

最后，用shRNA 沉默MARCHF1 和MARCHF8 增加RAW 264.7 巨噬細胞中TARM1 的表達，同時增加NOS2 和IL18 的水平（圖8A-D）。相反，過表達MARCHF1 和MARCHF8 抑制TARM1，從而降低巨噬細胞中NOS2 和IL18 的水平（圖8E-H）?？傊?，這些結(jié)果表明，MARCHF1和MARCHF8 促進自噬介導的TARM1 降解，從而抑制巨噬細胞的炎癥反應。

接下來，作者探討了泛素化是否是 TARM1 內(nèi)吞所必需的。 TARM1 的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含兩個保守的賴氨酸殘基 K286 和 K293，它們是潛在的泛素化位點。因此，用精氨酸取代這兩個賴氨酸殘基，結(jié)果發(fā)現(xiàn) MARCHF1 和 MARCHF8 不能促進突變 TARM1 的泛素化和降解（圖 9A）。免疫熒光結(jié)果進一步表明，TARM1 在 RAW 264.7 巨噬細胞的細胞膜上表達。然而，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，K-to-R 突變的 TARM1 無法從質(zhì)膜內(nèi)化到內(nèi)體（圖 9B）。所有這些結(jié)果表明，TARM1泛素化是其內(nèi)吞不可或缺的條件。隨后，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，轉(zhuǎn)染 TARM1[Mut]-His 的巨噬細胞與轉(zhuǎn)染WT TARM1 的巨噬細胞相比，NOS2、NLRP3 和 IL18 的表達量顯著增加（圖 9C，D）。值得注意的是，這些數(shù)據(jù)強調(diào)了表面-TARM1 而不是細胞質(zhì)-TARM1 在介導巨噬細胞炎癥中的關(guān)鍵作用。

公認的選擇性自噬受體，如 SQSTM1、NBR1、OPTN（optineurin）、CALCOCO2/NDP52 和 TAX1BP1，可通過 LC3 結(jié)合區(qū)/LIR 結(jié)構(gòu)域和 PB1 結(jié)構(gòu)域?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)移至自噬體和溶酶體。通過共免疫沉淀分析，TARM1 可與 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 相互作用（圖 10A），表明 TARM1 可被這些選擇性受體識別。此外，細胞免疫熒光數(shù)據(jù)顯示，LPS 和 IFNG 處理會引發(fā) TARM1 在細胞質(zhì)中聚集，并與轉(zhuǎn)染 TARM1-Flag 的 RAW 264.7 巨噬細胞中的選擇性自噬受體 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 共定位（圖 10B-E）。此外，在 RAW 264.7 巨噬細胞中，LPS 和 IFNG 也誘導 TARM1 與 LC3 共定位。然而，與陰性對照（NC）相比，通過 shRNA 沉默 TAX1BP1 或 SQSTM1 會減少 LPS 和 IFNG 刺激后 TARM1 與 LC3 的共定位，而沉默 NBR1 的影響較小（圖 10F-J）。此外，Atg5的缺失也顯著增加TAX1BP1和SQSTM1的表達，表明TAX1BP1和SQSTM1可能是巨噬細胞中TARM1的主要受體（圖5A）。此外，如圖 10K 所示，自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 與泛素化 TARM1 的親和分離分析表明，泛素化 TARM1 與自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 結(jié)合。這些結(jié)果表明，泛素化的 TARM1 內(nèi)化為內(nèi)體，隨后被細胞質(zhì)中的自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 識別，然后被 LC3 陽性吞噬細胞吞噬并與溶酶體融合降解。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞自噬是對 AKI 的一種適應性反應。在 AKI 小鼠模型中，巨噬細胞自噬功能缺失的小鼠表現(xiàn)出更嚴重的腎損傷和炎癥。巨噬細胞中缺乏自噬相關(guān)基因 Atg5 導致促炎癥細胞因子的高表達。此外，巨噬細胞中缺失 Atg5 增加 TARM1 蛋白，而 TARM1 蛋白受 E3 泛素連接酶 MARCHF1 和 MARCHF8 的調(diào)控，促進其通過自噬降解。這一過程涉及 TARM1 的內(nèi)化和被 SQSTM1 和 TAX1BP1 等自噬受體招募到溶酶體（圖 11）?？傊奘杉毎允煽赏ㄟ^降解 TARM1 減少炎癥反應，從而緩解 AKI，為腎臟疾病的治療提供新的靶點。

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Huang XR, Ye L, An N, Wu CY, Wu HL, Li HY, Huang YH, Ye QR, Liu MD, Yang LW, Liu JX, Tang JX, Pan QJ, Wang P, Sun L, Xia Y, Lan HY, Yang C, Liu HF. Macrophage autophagy protects against acute kidney injury by inhibiting renal inflammation through the degradation of TARM1. Autophagy. 2025 Jan;21(1):120-140. doi: 10.1080/15548627.2024.2393926. Epub 2024 Sep 8. PMID: 39193910; PMCID: PMC11702950.