MICAL2促進胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是一種致命的惡性腫瘤，其特征是早期轉(zhuǎn)移、對傳統(tǒng)療法的耐藥性以及預(yù)后極差。盡管在理解PDAC的遺傳學(xué)、識別轉(zhuǎn)錄亞型以及對其腫瘤微環(huán)境的深入了解方面取得了顯著進展，但仍缺乏有效的治療方法。目前該病的治療主要依賴于傳統(tǒng)的細胞毒性療法，這種療法易對患者產(chǎn)生不良影響。在本研究中，作者對PDAC的超級增強子（SE）景觀進行了表征，以識別可能具有靶向性的疾病驅(qū)動因素。分析結(jié)果顯示MICAL2作為PDAC超級增強子相關(guān)基因，能夠編碼黃素單加氧酶MICAL2，該酶誘導(dǎo)肌動蛋白解聚，并通過調(diào)節(jié)血清反應(yīng)因子共激活因子（MRTF-A和MRTF-B）的可用性，間接促進SRF轉(zhuǎn)錄。MICAL2在PDAC中過表達，且高MICAL2表達與患者預(yù)后不良相關(guān)。轉(zhuǎn)錄分析顯示，MICAL2上調(diào)KRAS和EMT信號通路，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在人和小鼠PDAC細胞中MICAL2功能喪失和獲得實驗中，作者發(fā)現(xiàn)MICAL2促進了ERK1/2和AKT的激活，并促進了體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有趣的是，作者還發(fā)現(xiàn)由MRTF-B而不是MRTF-A在體內(nèi)模仿了MICAL2驅(qū)動的表型?？傊?，作者的這項研究突出了MICAL2影響PDAC的多種機制，并為未來研究靶向MICAL2的干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)。該研究于2025年1月發(fā)表在《Cancer Research》，IF 14.2分。

作者從接受PDAC手術(shù)切除的患者中獲取了腫瘤樣本（n = 7），以及接受非腺癌組織切除的患者的正常胰腺組織樣本（n = 6）。將這些組織樣本進行裂解，并進行了組蛋白3賴氨酸27乙?；?/span>H3K27ac）的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq），以識別人類PDAC中的活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)域。作者通過計算方法識別了正常和腫瘤樣本中的超級增強子（SE）區(qū)域和SE相關(guān)基因（圖1A）。在腫瘤樣本中，富集程度最高的SE相關(guān)基因包括DAD1、MBP（與神經(jīng)周圍侵襲相關(guān)）；LIMK2、MSN、CAPZB（與細胞骨架動態(tài)相關(guān)）；FCGR3A、FCGR2A、RUNX1（與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)）。正常胰腺組織中富集的SE相關(guān)基因包括CEL和PLA2G1B（與胰腺外分泌功能相關(guān)）。

接下來，作者試圖識別在PDAC中上調(diào)的基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)有可能被小分子或抗體基礎(chǔ)的治療藥物所靶向。與正常組織相比，MICAL2在腫瘤樣本中顯著富集（Log2變化倍數(shù)為1.07；調(diào)整后的p值為5.39×10^-4）（圖1A）。此外，定量PCR（qPCR）分析顯示，MICAL2 mRNA在腫瘤樣本中富集（p值為0.009），這表明在啟動子和編碼區(qū)域增加的H3K27ac信號確實導(dǎo)致了MICAL2位點的轉(zhuǎn)錄激活增加（圖1B、1C）。為了確定MICAL2轉(zhuǎn)錄水平的提高是否導(dǎo)致PDAC腫瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者對人類正常胰腺和PDAC組織進行了免疫組化（IHC）染色。作者發(fā)現(xiàn)在4例患者腫瘤中MICAL2染色呈現(xiàn)出顯著的腫瘤特異性增加（圖2A）。接下來，作者觀察到在常用的KrasLSL-G12D；TP53LSL-R172H；以及PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和腫瘤特異性得以保持（圖2B）。作者研究了MICAL2表達與接受手術(shù)切除的PDAC患者（PanCuRx）以及晚期疾病患者（COMPASS）的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。作者發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)隊列中，高MICAL2表達與更差的預(yù)后相關(guān)，但在晚期隊列中并非預(yù)后因素（圖2C-D）。這表明MICAL2可能在原發(fā)性到晚期疾病的進展中發(fā)揮作用?？傮w而言，作者發(fā)現(xiàn)PDAC具有與已知PDAC生物學(xué)相關(guān)的獨特SE相關(guān)基因景觀。作者在這些基因中發(fā)現(xiàn)了MICAL2，并確定與正常鄰近組織相比，PDAC中的MICAL2轉(zhuǎn)錄水平更高，這在作者的研究以及其他獨立數(shù)據(jù)集中都得到了證實，并且與蛋白水平的增加表達相關(guān)。重要的是，高MICAL2表達與手術(shù)切除腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，表明高表達MICAL2可能標記著復(fù)發(fā)和進展風(fēng)險增加的腫瘤。

在上皮細胞中，作者發(fā)現(xiàn)MICAL2基因座上游存在416個假定的超級增強子（SE）區(qū)域。為了確定MICAL2轉(zhuǎn)錄水平的提高是否導(dǎo)致PDAC腫瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者對人類正常胰腺和PDAC組織進行了免疫組化（IHC）檢測。在4例患者腫瘤中，MICAL2染色呈現(xiàn)出顯著的腫瘤特異性增加（圖2A）。

接下來，作者觀察到在常用的KrasLSL-G12D，TP53LSL-R172H和PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和腫瘤特異性得以保留（圖2B）。在手術(shù)隊列中，高MICAL2表達與更差的預(yù)后相關(guān)，但在晚期隊列中并不具有預(yù)后價值（圖2C-D）。這表明MICAL2可能在原發(fā)疾病向晚期疾病進展中發(fā)揮作用。

總體而言，作者的數(shù)據(jù)表明PDAC具有與已知PDAC生物學(xué)相關(guān)的獨特SE相關(guān)基因景觀。作者在這些基因中發(fā)現(xiàn)了MICAL2，并確定與正常鄰近組織相比，PDAC中MICAL2的轉(zhuǎn)錄水平更高，這在作者的研究以及其他獨立數(shù)據(jù)集中均有所體現(xiàn)，并且與蛋白水平的增加表達相關(guān)。重要的是，高MICAL2表達與手術(shù)切除腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，表明高表達MICAL2可能標記著復(fù)發(fā)和進展風(fēng)險增加的腫瘤。

作者發(fā)現(xiàn)，在MICAL2基因敲低（KD）細胞中，額外的促生存途徑喪失，例如TNFα和HIF1α信號通路，這表明MICAL2可能在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中作為原癌基因發(fā)揮作用。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)EMT信號通路在MICAL2 KD細胞中也顯著減少（圖3A）。作者利用Der實驗室最近發(fā)表的一項研究，該研究全面分析了KRAS依賴的轉(zhuǎn)錄程序，并發(fā)現(xiàn)沉默MICAL2后，KRAS調(diào)控的基因進一步下調(diào)，這表明MICAL2調(diào)節(jié)KRAS信號通路（圖3B）。作為一種正交途徑分析方法，作者通過OncoGPS方法識別了與MICAL2表達相關(guān)的細胞狀態(tài)，這些細胞狀態(tài)是通過KRAS激活的下游轉(zhuǎn)錄活性在癌癥細胞系百科全書（CCLE）的其他腫瘤模型中闡明的。與GSEA類似，作者發(fā)現(xiàn)EMT狀態(tài)與CCLE中更高的MICAL2基因表達相關(guān)（圖3C）。為了進一步研究EMT表型，作者使用了一種源自KPC肝轉(zhuǎn)移的PDAC類器官系KPC46，該類器官具有間充質(zhì)特征和高轉(zhuǎn)移傾向（圖3D）。在MICAL2 KD細胞中，作者觀察到間充質(zhì)到上皮的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為高度均勻、極化、緊湊的上皮細胞結(jié)構(gòu)，表達增加的E-鈣粘蛋白（圖3E）?？傮w而言，這些實驗揭示了MICAL2在人類和小鼠PDAC模型中驅(qū)動MRTF/SRF轉(zhuǎn)錄、EMT和促癌途徑。

作者的轉(zhuǎn)錄組分析表明，MICAL2缺失的PDAC細胞中KRAS信號通路發(fā)生了改變。因此，作者評估了在MICAL2功能喪失和獲得的細胞中KRAS效應(yīng)通路PI3K/AKT和MAPK/ERK信號的激活情況。由于MICAL2的缺失導(dǎo)致SRF共激活因子MRTF-A和MRTF-B的表達發(fā)生改變，作者還研究了這兩個基因敲低（KD）的效果。在人類PDAC細胞系AsPC1中，MICAL2的缺失導(dǎo)致p-AKT顯著減少，而p-ERK1/2沒有變化（圖3F）。負性細胞周期調(diào)節(jié)因子P27在MICAL2敲低細胞中顯著增加，這表明MICAL2可能通過這種方式調(diào)節(jié)細胞增殖。通過siRNA介導(dǎo)的MRTF-B沉默模擬了MICAL2沉默細胞中觀察到的p-AKT減少現(xiàn)象。有趣的是，MRTF-A的缺失并未重現(xiàn)這一表型，且MRTFs的功能喪失并未模擬P27的增加。

接下來，作者在KPC46細胞中評估了MICAL2和MRTFs的缺失。作者發(fā)現(xiàn)，小鼠PDAC細胞在MICAL2和MRTF-B沉默的細胞中重現(xiàn)了p-AKT和p-ERK1/2的減少，然而，這一細胞系中P27未發(fā)生變化（圖3G）。這些結(jié)果表明，MICAL2和MRTF-B缺失的細胞中PI3K和MAPK的磷酸化減少，與KRAS信號減弱一致。當(dāng)作者檢查經(jīng)過改造以表達MICAL2的BxPc3細胞時，作者發(fā)現(xiàn)p-AKT和P27的表達顯著增加（圖3H）。為了直接確定MICAL2表達是否改變了KRAS信號，作者在BxPc3細胞中過表達MICAL2后對KRAS-GTP裝載進行了表征。作者發(fā)現(xiàn)這些細胞中KRAS-GTP裝載水平顯著增加，從而直接將MICAL2表達與KRAS活性聯(lián)系起來（圖3I）。

為了進一步評估MICAL2對KRAS信號通路的影響，作者考察了MICAL2基因敲低（KD）對巨胞飲作用的影響，這是一種由KRAS驅(qū)動的細胞外營養(yǎng)物質(zhì)攝取過程。作者觀察到MICAL2缺失細胞中巨胞飲作用顯著減少，這與KRAS信號活性的降低一致（圖3J）。綜上所述，功能喪失和功能獲得研究揭示了MICAL2通過KRAS促進信號傳導(dǎo)，表現(xiàn)為KRAS-GTP結(jié)合、MAPK和PI3K的磷酸化以及巨胞飲作用。盡管存在模型間的差異，這些觀察到的生化結(jié)果與作者對細胞轉(zhuǎn)錄組的通路分析一致。

作者為了探究MICAL2功能喪失和功能獲得對PDAC細胞癌性表型的影響。鑒于MICAL2似乎驅(qū)動EMT過程，作者首先測量了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B缺失細胞的運動能力。作者發(fā)現(xiàn)，在ASPC1和KPC46細胞中，MICAL2敲低（KD）后遷移能力均有所降低（圖4A，B）。作者還發(fā)現(xiàn)，人類ASPC1細胞中MRTF-A和MRTF-B的敲低減少了細胞遷移，而在小鼠KPC46細胞中，僅MRTF-A的敲低導(dǎo)致遷移能力下降。相反，在功能獲得實驗中，過表達MICAL2的BxPc3細胞相比空載體對照細胞顯示出增強的遷移能力（圖4C）。

隨后，作者評估了MICAL2對細胞增殖的影響。作者發(fā)現(xiàn)，MICAL2基因敲低（KD）導(dǎo)致ASPC1和KPC46細胞的增殖顯著減少，而BxPc3細胞中MICAL2的過表達（OE）則使增殖率相較于對照細胞有所增加（圖4D-F）。有趣的是，無論是人類還是小鼠的PDAC細胞中，任一MRTF的敲低僅導(dǎo)致細胞增殖率的部分下降（圖4D-E）。為了更好地了解MICAL2表達影響細胞周期的哪一部分，作者使用流式細胞術(shù)來檢測細胞周期進程。在ASPC1和KPC46細胞中，MICAL2和MRTF-B缺失的細胞顯著傾向于G0/G1期的停滯，并且S期和G2/M期的細胞比例相應(yīng)減少（圖4G和H）。缺乏MRTF-A的KPC46細胞在細胞周期輪廓上沒有變化，但缺乏MRTF-A的ASPC1細胞卻意外地在S期出現(xiàn)阻滯，而非G0/G1期，這暗示了不同模型之間以及人類與小鼠PDAC細胞之間可能存在的差異。相反，過表達MICAL2的BxPc3細胞更快地通過G0/G1期，并且相較于對照組，S期的細胞比例增加，表明MICAL2表達的增加足以促進細胞分裂（圖4I）?？傮w而言，這些實驗表明MICAL2和MRTF-A/B的表達促進了細胞的遷移、侵襲和增殖。此外，這些發(fā)現(xiàn)與作者在PDAC細胞中基因敲低MICAL2后觀察到的RNA測序和生化結(jié)果一致。

作者通過體外沉默MICAL2，觀察到細胞增殖、遷移、侵襲減少，以及EMT表型的逆轉(zhuǎn)。因此，作者接下來旨在確定MICAL2和MRTFs的缺失如何影響腫瘤形成，最初使用異位皮下小鼠移植模型。作者首先將具有MICAL2或MRTF-A/B組成性敲低的AsPC1細胞移植到免疫缺陷的NSG小鼠中。作者觀察到，當(dāng)MICAL2和MRTF-B缺失時，腫瘤大小顯著減少，但MRTF-A沉默后沒有顯著差異（圖5A）。在同種小鼠中移植KPC46細胞重現(xiàn)了人類PDAC細胞觀察到的結(jié)果，盡管腫瘤形成減少更為顯著（圖5B）。在一個實驗中，MICAL敲低細胞未形成腫瘤，而在重復(fù)實驗中，6個中有1個腫瘤未形成，其余腫瘤相對于對照組顯著生長抑制。相反，當(dāng)注射到NSG動物的側(cè)腹時，過表達MICAL2的BxPc3細胞比對照細胞生長得更大（圖5C）。為了確定MICAL2敲低細胞生長減少是否由于植入失敗，作者建立了用shRNA靶向MICAL2（ish-MICAL2）或?qū)φ眨?/span>ish-control）的強力霉素（dox）誘導(dǎo)型KPC46細胞。作者將細胞植入同種動物的側(cè)腹，并在強力霉素誘導(dǎo)前讓腫瘤形成10天，通過觸診和超聲波記錄。在用強力霉素處理的ish-MICAL2植入小鼠中，與ish-control相比，44天內(nèi)的腫瘤生長被抑制，但在未用強力霉素處理的常規(guī)飲食小鼠中則沒有（圖5D-E）。作者通過將細胞植入胰尾來研究MICAL2和MRTFs如何影響原位腫瘤生長。作者發(fā)現(xiàn)，只有植入AsPC1 MICAL2-KD細胞的小鼠，而非MRTF-KDs，有顯著減少的腫瘤負荷，而在KPC46模型中，與scramble對照相比，MICAL2和MRTF-B沉默的細胞在體內(nèi)生長減少（圖5F-G）?？傊?，PDAC細胞中MICAL2和MRTF-B的表達促進了異位和原位的腫瘤生長，而MRTF-A的表達對腫瘤生長沒有影響。這些結(jié)果與作者體外發(fā)現(xiàn)MICAL2促進PDAC細胞增殖的發(fā)現(xiàn)一致，并表明MRTF-A和-B在促進胰腺腫瘤生長中扮演不同的角色。

為了確定MICAL2和MRTFs表達如何影響PDAC細胞轉(zhuǎn)移到肝臟的能力，作者將PDAC細胞注射到小鼠的脾臟中。作者首先注射了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低的KPC46細胞（圖6A）。從宏觀上看，作者觀察到在MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低模型中，肝臟轉(zhuǎn)移負擔(dān)顯著減少，與對照細胞相比。從組織學(xué)上看，作者發(fā)現(xiàn)與對照細胞注射時廣泛的轉(zhuǎn)移性疾病相比，敲低模型中只有小的、通常僅在顯微鏡下可檢測到的肝臟轉(zhuǎn)移。為了確定dox誘導(dǎo)的MICAL2敲低細胞的植入是否導(dǎo)致這種表型，作者將ish-MICAL2或ish-對照KPC46細胞注射到同種小鼠的脾臟中，并在注射后第3天給小鼠提供dox。在這個模型中，作者發(fā)現(xiàn)ish-MICAL2組在宏觀和組織學(xué)上的轉(zhuǎn)移顯著減少。最后，作者將過表達MICAL2或載體對照的BxPc3細胞注射到NSG小鼠的脾臟中。這些結(jié)果表明MICAL2、MRTF-A和B促進PDAC細胞的肝臟轉(zhuǎn)移

綜上所述，作者研究了PDAC的表觀基因組圖譜，識別出MICAL2作為一個獨特的PDAC進展驅(qū)動因子，通過其對MRTF/SRF信號通路的調(diào)控。作者還確定了MRTF-A與MRTF-B在促進PDAC生長中的不同效應(yīng)。鑒于MICAL2和MRTF-SRF生物學(xué)在調(diào)控其腫瘤生物學(xué)基本轉(zhuǎn)錄程序中的作用，它們代表了PDAC治療中具有吸引力的、新的且可能易于處理的靶點。

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Garg B, Khan S, Courelli AS, Panneerpandian P, Sheik Pran Babu D, Mose ES, Gulay KCM, Sharma S, Sood D, Wenzel AT, Martsinkovskiy A, Rajbhandari N, Patel J, Jaquish D, Esparza E, Jaque K, Aggarwal N, Lambies G, D'Ippolito A, Austgen K, Johnston B, Orlando DA, Jang GH, Gallinger S, Goodfellow E, Brodt P, Commisso C, Tamayo P, Mesirov JP, Tiriac H, Lowy AM. MICAL2 Promotes Pancreatic Cancer Growth and Metastasis. Cancer Res. 2025 Jan 2. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-0744. Epub ahead of print. PMID: 39745352.