鐵死亡中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)乳腺癌免疫抑制和化療耐藥

在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡正在成為治療傳統(tǒng)治療方式難治性惡性腫瘤的一種策略。然而，需要更好地了解免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中鐵死亡的后果，以實(shí)現(xiàn)這種方法的潛力。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)化療耐藥乳腺癌中的中性粒細(xì)胞對鐵死亡高度敏感?；熌退幭嚓P(guān)中性粒細(xì)胞中酰基轉(zhuǎn)移酶 MOAT1 的減少誘導(dǎo)了磷脂重編程，將偏好從單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗖伙柡椭舅幔@增加了它們對鐵死亡的易感性。鐵死亡中性粒細(xì)胞分泌 PGE2 、 IDO 和氧化脂質(zhì)，抑制抗腫瘤 CD8+ T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性。此外，中性粒細(xì)胞鐵死亡與 IL1β + CXCL3 + CD4 + （Fer-CD4） T 淋巴細(xì)胞的一個獨(dú)特亞群密切相關(guān)，這些細(xì)胞在化療耐藥腫瘤中富集。Fer-CD4 T 細(xì)胞通過 IL1β/IL1R1/NF-κB 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié) MOAT1 表達(dá)，從而協(xié)調(diào)中性粒細(xì)胞鐵死亡。此外，Fer-CD4 T 細(xì)胞分泌 CXCL3 、 IL8 和 S100A9 以補(bǔ)充腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞庫。鐵死亡中性粒細(xì)胞反過來促進(jìn)了 Fer-CD4 T 細(xì)胞分化。在自發(fā)性腫瘤發(fā)生小鼠模型中，靶向 IL1β+ CD4+ T 細(xì)胞或 IL1R1+ 中性粒細(xì)胞打破串?dāng)_，抑制中性粒細(xì)胞鐵死亡，增強(qiáng)抗腫瘤免疫，克服化療耐藥?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)揭示了中性粒細(xì)胞鐵死亡在塑造免疫景觀中的作用，并為恢復(fù)乳腺癌的免疫監(jiān)視和化療敏感性提出了有吸引力的靶點(diǎn)。本文于2025年1月發(fā)表于《Cancer Research》，IF：13.3

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1. 化療耐藥乳腺癌中的中性粒細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡

為了確定具有不同化療敏感性的乳腺癌中 TIN 的異質(zhì)性，使用磁激活細(xì)胞分選從化療敏感和化療耐藥患者中純化中性粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。值得注意的是，化療耐藥性腫瘤中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，與鐵結(jié)合、DNA 損傷反應(yīng)、泛素化和熱休克蛋白相關(guān)的特征上調(diào)（圖 1A）。此外，與氧化應(yīng)激和氧化劑解毒相關(guān)的基因的表達(dá)也顯著升高。這些觀察結(jié)果表明，化療耐藥腫瘤中性粒細(xì)胞可能經(jīng)歷了氧化應(yīng)激并伴有鐵調(diào)節(jié)失調(diào)，這表明潛在的鐵死亡相關(guān)活性。

在化療耐藥 TIN 中觀察到的細(xì)胞死亡高于化療敏感 TIN。為了研究鐵死亡在化療耐藥中性粒細(xì)胞中的作用，分離了瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞并用各種細(xì)胞死亡抑制劑處理。值得注意的是，與細(xì)胞凋亡抑制劑（z-VAD-FMK）或壞死抑制劑（necrostatin-1）相比，鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1 或去鐵胺）的給藥顯著增加了化療耐藥中性粒細(xì)胞的活力（圖 1B）。相比之下，鐵死亡抑制劑對化療敏感的中性粒細(xì)胞影響最小。此外，化療耐藥中性粒細(xì)胞在暴露于對化療敏感的中性粒細(xì)胞安全的劑量 RSL3（一種鐵死亡誘導(dǎo)劑）后發(fā)生顯著的細(xì)胞死亡（圖 1C）。此外，電子顯微鏡顯示，線粒體收縮和線粒體嵴減少，這是鐵死亡的特征性形態(tài)學(xué)標(biāo)志，在化療耐藥中性粒細(xì)胞中，但在敏感中性粒細(xì)胞中沒有（圖 1D）。使用 BODIPY C11 染色，我們觀察到化療耐藥中性粒細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平顯著升高，這表明鐵死亡（圖 1E 和 F）?；熌退幍闹行粤＜?xì)胞始終表現(xiàn)出轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）的顯著較高表達(dá)，這是鐵死亡的另一個指標(biāo)。這些數(shù)據(jù)表明，化療耐藥腫瘤中性粒細(xì)胞極易發(fā)生鐵死亡。

為了臨床評估中性粒細(xì)胞化療敏感性與鐵死亡之間的相關(guān)性，對 468 例接受新輔助化療的乳腺癌患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了免疫熒光共聚焦成像。我們觀察到化療耐藥中性粒細(xì)胞的鐵死亡特征（4-HNE）明顯高于化療敏感的中性粒細(xì)胞（圖 1G 和 H）。此外，與乳腺癌亞型無關(guān)，原發(fā)腫瘤中 4-HNE+ 中性粒細(xì)胞的較高浸潤與隊(duì)列中較短的無病生存期和總生存期相關(guān)（圖 1I）?？偟膩碚f，我們揭示了化療耐藥腫瘤中的 TIN 表現(xiàn)出對鐵死亡的高度敏感性，而鐵死亡 TIN 與乳腺癌的化療耐藥和不良預(yù)后相關(guān)。

Figure 1 化療耐藥乳腺癌中的中性粒細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡

2. MBOAT1 改變化療耐藥中性粒細(xì)胞的磷脂譜和鐵死亡脆弱性

鑒于化療耐藥中性粒細(xì)胞中明顯的脂質(zhì)過氧化，我們對 5 名化療敏感和 5 名化療耐藥乳腺癌患者的 TIN 進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)分析?；熌退幮灾行粤＜?xì)胞顯示出獨(dú)特的磷脂譜，顯著下調(diào)廣譜磷脂-單不飽和脂肪酸（PL-MUFA），包括磷脂酰乙醇胺（PE）-MUFA、磷脂酰膽堿（PC）-MUFA 和磷脂酰絲氨酸 MUFA。其中，PE-MUFAs，特別是那些含有油酰基（18：1）尾部的 PE-MUFAs，表現(xiàn)出最明顯的減少（圖 2A）。相反，幾種磷脂-多不飽和脂肪酸（PL-PUFA）的水平在化療耐藥中粒細(xì)胞中顯著升高，其中 PE-PUFA 占主導(dǎo)地位（圖 2B）。此外，在化療耐藥中性粒細(xì)胞中，具有花生六烯酰（PE-AA， 20：4）尾部的 PE 顯著積累，極易發(fā)生過氧化，是鐵死亡易感性的主要決定因素。

為了研究磷脂重編程和鐵死亡在化療耐藥中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，使用轉(zhuǎn)錄組分析和 qRT-PCR 分析了與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和鐵死亡有關(guān)的基因。與化療敏感的中性粒細(xì)胞相比，化療耐藥中性粒細(xì)胞在與鐵死亡防御系統(tǒng)（GPX4、SLC7A11、FSP1、DHODH、GCH1 和 NOS2）或脂質(zhì)過氧化和鐵代謝（ALOX15、POR、NCOA4、GOT1、NFS1 和 CISD2;圖 2C）。同樣，參與合成含不飽和脂肪酸的磷脂的基因（SCD、ACSL3、ACACA、ACACB、ACSL4、LPCAT3 和 MBOAT2）沒有表現(xiàn)出任何顯著變化（圖 2C）。有趣的是，化療耐藥中性粒細(xì)胞中 MBOAT1 水平急劇降低，MBOAT1 是一種參與 PL-MUFA 產(chǎn)生的磷脂修飾酶（圖 2D），免疫印跡證實(shí)了這一點(diǎn)（圖 2E）。MBOAT1 是一種溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶，可催化 MUFA 向溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨酸或溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移。耐化療的中性粒細(xì)胞中 MBOAT1 水平的變化與磷脂脂肪酸組成一致，PL-PUFA 明顯優(yōu)于 PL-MUFA。為了闡明 MBOAT1 在鐵死亡細(xì)胞死亡中的作用，我們在 CD34 + 髓系祖細(xì)胞分化為中性粒細(xì)胞之前過表達(dá)或沉默 MBOAT1。然后，如前所述，將祖細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞與通過離體外植體測定獲得的化療敏感或化療耐藥腫瘤組織的 CM 一起孵育。用化療耐藥性乳腺腫瘤而不是化療敏感的乳腺腫瘤進(jìn)行調(diào)節(jié)，觸發(fā)了野生型祖細(xì)胞衍生的中性粒細(xì)胞的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。通過 qRT-PCR 和免疫印跡證實(shí)祖細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞中 MBOAT1 過表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證祖細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞在調(diào)節(jié)前的活力。值得注意的是，與用對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的中性粒細(xì)胞相比，MBOAT1 過表達(dá)減輕了脂質(zhì)過氧化，并逆轉(zhuǎn)了受化療耐藥腫瘤條件的祖細(xì)胞衍生的中性粒細(xì)胞的鐵死亡脆弱性（圖 2F 和 G）。此外，MBOAT1 過表達(dá)的中性粒細(xì)胞的磷脂譜發(fā)生改變，與對照編輯的中性粒細(xì)胞相比，油?；膊康?/span> PE 增加，PE-AA 減少（圖 2H）。相比之下，在 MBOAT1 沉默后，受化療敏感腫瘤條件的祖細(xì)胞衍生的中性粒細(xì)胞變得易患鐵死亡（圖 2I）。這些結(jié)果表明，MBOAT1 缺陷破壞了磷脂產(chǎn)生的平衡，有利于產(chǎn)生含 PUFA 的磷脂而不是 PL-MUFAs，使化療耐藥性中性粒細(xì)胞極易患鐵死亡。

Figure 2 MBOAT1 重塑了化療耐藥中性粒細(xì)胞的磷脂譜和鐵死亡脆弱性

3. 鐵亡中性粒細(xì)胞是有效的免疫抑制劑

為了評估中性粒細(xì)胞鐵死亡對腫瘤微環(huán)境的影響，我們對乳腺癌患者的連續(xù)腫瘤切片進(jìn)行了多重免疫熒光染色。值得注意的是，在 4-HNE+ 中性粒細(xì)胞比例較高的腫瘤中，CD8 T 細(xì)胞的密度明顯低于中性粒細(xì)胞比例較低的腫瘤（補(bǔ)充圖 S3A）。然而，基質(zhì)細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、DC、內(nèi)皮細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 細(xì)胞）的瘤內(nèi)數(shù)量在 4-HNE+ 中性粒細(xì)胞比例低或高比例的乳腺腫瘤之間沒有顯著差異。此外，我們收集了腫瘤樣本以分離中性粒細(xì)胞并制備腫瘤裂解物以及配對的血液樣本，從中產(chǎn)生 DC，并從化療耐藥或化療敏感患者中純化 CD8 T 細(xì)胞（圖 3A）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)化療耐藥中性粒細(xì)胞中 4-HNE 的表達(dá)升高。在與自體 CD8 T 細(xì)胞共培養(yǎng)之前，用腫瘤裂解物脈沖 DC 以產(chǎn)生腫瘤特異性 CTL。通過 IFN-γ ELISPOT 測定和腫瘤抗原肽/MHC-I 五聚體染色驗(yàn)證生成的 CTL 對腫瘤抗原的識別。然后將腫瘤來源的中性粒細(xì)胞與 CTLs 共培養(yǎng)，并評估其增殖和細(xì)胞死亡。有趣的是，化療耐藥性中性粒細(xì)胞對 CD8 T 細(xì)胞的死亡沒有顯著影響，但顯著減弱了 CD8 T 細(xì)胞的增殖（圖 3B）。在化療敏感的 TIN 中未觀察到這種效果（圖 3B）。此外，化療耐藥性腫瘤來源的中性粒細(xì)胞在很大程度上抑制了 CTL 產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶 B（圖 3C）。用鐵死亡抑制劑而不是細(xì)胞凋亡或壞死抑制劑預(yù)處理中性粒細(xì)胞，有效地逆轉(zhuǎn)了化療耐藥中性粒細(xì)胞對抗腫瘤 CTLs 增殖和細(xì)胞因子釋放的抑制作用。與此一致，對 468 名乳腺癌患者隊(duì)列的腫瘤樣本序列切片進(jìn)行免疫熒光分析，顯示鐵死亡中性粒細(xì)胞與顆粒酶 B+ CD8 T 淋巴細(xì)胞之間存在顯著的負(fù)相關(guān)（圖 3E 和 F）。此外，在 MMTV-PyMT 自發(fā)致瘤小鼠的腫瘤中也觀察到 4-HNE+ 中性粒細(xì)胞。同樣，在鐵死亡中性粒細(xì)胞比例高的區(qū)域，與鐵死亡中性粒細(xì)胞較少的區(qū)域相比，顆粒酶 B+ CD8 T 淋巴細(xì)胞的密度顯著降低。

為了闡明中性粒細(xì)胞如何損害 CTL 功能，使用了非接觸式共培養(yǎng)系統(tǒng)。消除直接接觸并未消除化療耐藥中性粒細(xì)胞對 CTL 的抑制作用。分離化療耐藥中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)基成分，并在淋巴細(xì)胞上進(jìn)行測試，以確定其免疫作用。通過納米顆粒追蹤分析驗(yàn)證的 CM 的細(xì)胞外囊泡耗盡（EV-d）部分對 CTL 增殖和顆粒酶 B 的產(chǎn)生表現(xiàn)出顯著的抑制活性（圖 3G）。為了確定 EV-d 部分內(nèi)影響 T 細(xì)胞功能的分子基礎(chǔ)，從 EV-d 部分去除了蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。蛋白質(zhì)或脂質(zhì)而不是核酸的消除有效地降低了化療耐藥中性粒細(xì)胞 EV-d 組分的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)能力（圖 3H）。這表明化療耐藥中性粒細(xì)胞的免疫抑制作用歸因于可溶性蛋白質(zhì)介質(zhì)和脂質(zhì)的釋放。我們使用 ELISA 測量了敏感和耐藥中性粒細(xì)胞在 CM 中表現(xiàn)出 T 細(xì)胞調(diào)節(jié)活性的各種細(xì)胞因子和可溶性因子的水平。與化療敏感的中性粒細(xì)胞相比，化療耐藥中性粒細(xì)胞的 PGE2 和 IDO 在 CM 中顯著升高（圖 3I）。免疫熒光染色和免疫印跡證實(shí)了這一點(diǎn)，結(jié)果顯示化療耐藥中性粒細(xì)胞中存在豐富的 IDO。IDO 是 Trp 轉(zhuǎn)化為 Kyn 的限速酶。培養(yǎng) 24 小時后，從化療敏感和化療耐藥的中性粒細(xì)胞中分離出 CM。值得注意的是，與化療敏感中性粒細(xì)胞的 CM 不同，來自化療耐藥中性粒細(xì)胞的 CM 表現(xiàn)出顯著的 IDO 酶活性，其將 Trp 轉(zhuǎn)化為 Kyn 的能力證明了這一點(diǎn)。此外，PGE2 是免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)分子。當(dāng)我們抑制 CTLs 中的 PGE2 受體 EP2 和 EP4 時，化療耐藥中性粒細(xì)胞對 CTL 增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用顯著降低。此外，用 IDO （1-MT）、COX1 和 COX2 抑制劑（COXi、酮咯酸和羅非昔布）對化療耐藥中性粒細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，大大阻礙了對 CTL 中 IFNγ、穿孔素和顆粒酶 B 擴(kuò)增和產(chǎn)生的抑制作用（圖 3J-L）。此外，將 CTLs 與化療耐藥中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)會損害 CTLs 對腫瘤細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，而用 1-MT 和 COXi 處理可有效逆轉(zhuǎn)這種活性（圖 3M）。然而，由于化療耐藥性中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)過氧化跡象，我們檢查了氧化脂質(zhì)對 CD8 T 細(xì)胞活性的潛在影響。將氧化的 PE-AAs 施用到腫瘤特異性 CD8 T 細(xì)胞中顯著損害了它們的增殖和細(xì)胞因子合成，表明氧化脂質(zhì)參與化療耐藥性中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明，亞鐵性中性粒細(xì)胞通過 PGE2、IDO 和過氧化物脂質(zhì)促進(jìn)強(qiáng)大的免疫抑制。

Figure 3 鐵死亡中性粒細(xì)胞是強(qiáng)烈的免疫抑制因子

4. 腫瘤中性粒細(xì)胞鐵死亡與化療耐藥腫瘤中富集的獨(dú)特 CD4 T 細(xì)胞亞群有關(guān)

為了鑒定 TME 中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié) MBOAT1 和中性粒細(xì)胞鐵死亡的細(xì)胞，我們從化療耐藥腫瘤中純化了各種細(xì)胞類型，并將它們與外周血衍生的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)。值得注意的是，只有與化療耐藥 TME 的 CD4 T 淋巴細(xì)胞相互作用，而不是與上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、DC、內(nèi)皮細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞或 NK 細(xì)胞的相互作用，才會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞對鐵死亡的相當(dāng)易感性，并下調(diào) MBOAT1。然而，在化療敏感的中性粒細(xì)胞中未觀察到這些影響。

為了鑒定參與中性粒細(xì)胞鐵死亡的 CD4 T 淋巴細(xì)胞亞群，我們對化療敏感和化療耐藥乳腺腫瘤的 CD4 T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)。在 CD4 T 細(xì)胞中鑒定出 6 個亞群：C0_IF144L、C1_TCF7、C2_IL1B、C3_FOXP3、C4_IFNG 和 C5_PISD（圖 4A）。CD4 T 細(xì)胞的 C2_IL1B 亞組以 IL1B 和 CXCL3 表達(dá)升高為特征，在化療敏感患者中很少見，但在化療耐藥患者中占 CD4 T 淋巴細(xì)胞的很大一部分（4.5% vs. 22.7%；圖 4B-D）。一致地，來自另外 18 名患者的 CD4 T 細(xì)胞的大量 RNA-seq顯示，與來自化療敏感腫瘤的 CD4 T 細(xì)胞相比，浸潤化療耐藥惡性腫瘤表現(xiàn)出 IL1B 和 CXCL3 的表達(dá)明顯更高（圖 4E），通過蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與化療敏感病例相比，IL1β和 CXCL3 描繪了在化療耐藥乳腺癌中顯著富集的 CD4 T 細(xì)胞亞群（圖 4F）。

使用細(xì)胞因子捕獲磁珠，我們從化療耐藥乳腺腫瘤中純化了 IL1β+ CXCL3+ CD4 T 細(xì)胞，如流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的那樣，并將它們與外周中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)。隨后，我們在暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞的中性粒細(xì)胞中觀察到顯著的細(xì)胞死亡，但在暴露于成對的 IL1β + CXCL3 + 耗盡（IL1β+ CXCL3+-d） CD4 T 細(xì)胞的中性粒細(xì)胞中沒有觀察到顯著的細(xì)胞死亡，這被鐵死亡抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖 4G）。一致地，與 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出脂質(zhì)過氧化和 CD71 表達(dá)的顯著增加（圖 4H）并強(qiáng)烈抑制 CTL 增殖和溶細(xì)胞活性（圖 4I）。此外，暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞后，在中性粒細(xì)胞中檢測到 MBOAT1 下調(diào)。臨床上，與敏感腫瘤相比，IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞在化療耐藥腫瘤中顯著富集（圖 4J）。此外，在乳腺癌標(biāo)本中觀察到 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞與鐵死亡中性粒細(xì)胞之間存在顯著的正相關(guān)（圖 4K）。這些數(shù)據(jù)表明，在化療耐藥乳腺癌微環(huán)境中富集的 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤中性粒細(xì)胞的脂質(zhì)重塑和鐵死亡。

與此一致，免疫熒光染色顯示 MMTV-PyMT 自發(fā)性致瘤小鼠腫瘤中存在 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞，并且 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞的比例與鐵死亡中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。我們從小鼠腫瘤中分離出 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞，并將它們與來自骨髓的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)。同樣，在中性粒細(xì)胞與 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出脂質(zhì)過氧化的顯著升高，并且容易發(fā)生細(xì)胞死亡，這被鐵死亡抑制劑抑制。此外，暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞的小鼠中性粒細(xì)胞中 MBOAT1 表達(dá)存在明顯缺陷。

Figure 4 腫瘤中性粒細(xì)胞鐵死亡與化療耐藥腫瘤中富集的 CD4 T 細(xì)胞的獨(dú)特亞群有關(guān)

5. 鐵死亡誘導(dǎo)的 CD4 T 細(xì)胞通過 IL1β/IL1R1/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使腫瘤中性粒細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡

為了研究 IL1β + CXCL3 + CD4 T 細(xì)胞（以下簡稱鐵死亡誘導(dǎo) CD4 T 細(xì)胞（Fer-CD4））沉淀中性粒細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，我們在非接觸 Transwell 系統(tǒng)中將它們與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)。分離 Fer-CD4 T 細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的共培養(yǎng)刺激了中性粒細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡（補(bǔ)充圖 S6A），與它們的 IL1β-CXCL3-對應(yīng)物（非 Fer-CD4 T 細(xì)胞）相反，表明 Fer-CD4 T 細(xì)胞以接觸非依賴性方式促進(jìn)中性粒細(xì)胞鐵死亡。鑒于乳腺癌患者腫瘤中 CD4 T 細(xì)胞和鐵死亡中性粒細(xì)胞中 IL1β和 CXCL3 表達(dá)之間的相關(guān)性（圖 4K），我們研究了 IL1β和 CXCL3 在化療耐藥乳腺癌中中性粒細(xì)胞鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用。值得注意的是，在非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)中中和 IL1β而不是 CXCL3 抑制了 Fer-CD4 T 細(xì)胞誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和中性粒細(xì)胞鐵死亡（圖 5A 和 B）。qRT-PCR、免疫印跡和免疫熒光顯示 IL1R1 在中性粒細(xì)胞中的表達(dá)，在與 Fer-CD4 T 細(xì)胞相互作用后進(jìn)一步增加（圖 5C）。這與 IL1β刺激 IL1R1 表達(dá)，從而形成正反饋回路的報(bào)告一致。同樣，小鼠中性粒細(xì)胞表達(dá) Il1r1（編碼小鼠 IL1R1），其在暴露于 Fer-CD4 T 細(xì)胞時上調(diào)。為了闡明 IL1R1 在中性粒細(xì)胞鐵死亡中的作用，在細(xì)胞分化為中性粒細(xì)胞之前，使用 shRNA 敲低 CD34+ 中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞中的 IL1R1。與 Fer-CD4 T 細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)祖細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)過氧化，并發(fā) MBOAT1 缺陷，其被 IL1R1 沉默逆轉(zhuǎn)（圖 5D 和 E）。

為了確定導(dǎo)致中性粒細(xì)胞鐵死亡的信號通路，使用了免疫印跡、免疫熒光和不同信號通路的抑制劑。免疫印跡顯示 NF-κB/p65 的磷酸化增加，而不是 MAPK/p38 或 PI3K/Akt（圖 5F），而免疫熒光顯示 p65 在與 Fer-CD4 T 細(xì)胞結(jié)合的中性粒細(xì)胞中核易位。此外，NF-κB 抑制劑（JSH23）而不是 MAPK/p38 （SB202190）或 PI3K （LY294002）抑制劑的給藥恢復(fù)了 MBOAT1 表達(dá)并抑制了 Fer-CD4 T 細(xì)胞觸發(fā)的中性粒細(xì)胞鐵死亡（圖 5G）。此外，施用 IL1β中和抗體或 IL1R1 拮抗劑（Anakinra）可防止 Fer-CD4 T 細(xì)胞誘導(dǎo) NF-κB 磷酸化（圖 5H）、p65 核轉(zhuǎn)位（圖 5I）和 MBOAT1 缺陷（圖 5J）中。這些結(jié)果表明，Fer-CD4 T 細(xì)胞激活 TIN 中的 IL1R1/NF-κB 信號傳導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。一致地，在 468 名乳腺癌患者的隊(duì)列中，腫瘤內(nèi) Fer-CD4 T 細(xì)胞的豐度與較短的總生存期和無病生存期相關(guān)（圖 5K），這與乳腺癌亞型無關(guān)。

Figure 5 鐵死亡誘導(dǎo)的 CD4 T 細(xì)胞通過 IL1β/IL1R1/NF-κB 信號傳導(dǎo)使腫瘤中性粒細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡

6. 中性粒細(xì)胞和 Fer-CD4 T 細(xì)胞之間的串?dāng)_維持了廣泛的中性粒細(xì)胞鐵死亡

最近的研究表明，鐵死亡的傳播性質(zhì)會導(dǎo)致大規(guī)模細(xì)胞死亡。與此一致，我們在腫瘤核心中觀察到中性粒細(xì)胞積累和大量鐵死亡。因此，我們很感興趣地研究腫瘤中心內(nèi)是否存在維持和放大中性粒細(xì)胞鐵死亡的過程。scRNA-seq 數(shù)據(jù)的基因本體分析顯示，白細(xì)胞吸引信號通路，尤其是中性粒細(xì)胞趨化性相關(guān)通路，在 C2_IL1B 細(xì)胞中上調(diào)（圖 6A）。同樣，來自化療耐藥腫瘤的 CD4 T 細(xì)胞在大量 RNA-seq 中表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞募集途徑的表達(dá)升高（圖 6B）。這些數(shù)據(jù)表明 Fer-CD4 T 細(xì)胞也具有中性粒細(xì)胞趨化和聚集的潛力。為了闡明 Fer-CD4 T 細(xì)胞在中性粒細(xì)胞募集中的作用，使用 Boyden Transwell 室進(jìn)行趨化性測定（圖 6C）。我們發(fā)現(xiàn)，與非 Fer-CD4 T 細(xì)胞相比，Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM 顯著增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞的遷移能力（圖 6D）。同樣，來自腫瘤的小鼠 Fer-CD4 T 細(xì)胞顯示出吸引骨髓來源的中性粒細(xì)胞的能力。在微載玻片趨化性實(shí)驗(yàn)中，中性粒細(xì)胞在纖連蛋白預(yù)包被的μ載玻片上主動遷移到 Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM，而在存在來自非 Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM 的情況下，它們的移動更加不穩(wěn)定（圖 6E）。一致地，細(xì)胞骨架染色顯示，用 Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM 處理的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的 F-肌動蛋白重排，具有極化分布，主要位于細(xì)胞的前緣，而那些用來自非 Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM 處理的中性粒細(xì)胞具有分散的 F-肌動蛋白染色（圖 6F）。此外，采用離體腫瘤切片遷移測定來評估中性粒細(xì)胞向 TME 的募集。在計(jì)算浸潤性中性粒細(xì)胞的數(shù)量之前，將新鮮切除的乳腺癌切片與預(yù)先標(biāo)記的自體 PB 衍生的中性粒細(xì)胞疊加。在這項(xiàng)研究中，來自高水平 Fer-CD4 T 細(xì)胞浸潤患者的腫瘤切片吸引了明顯更多的自體中性粒細(xì)胞（圖 6G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Fer-CD4 T 細(xì)胞有效地將中性粒細(xì)胞募集到 TME 中，補(bǔ)充了因死亡而減少的 TME 中性粒細(xì)胞庫，并在它們附近積累了中性粒細(xì)胞。

接下來，我們檢查了 Fer-CD4 T 細(xì)胞中的趨化因子表達(dá)模式。scRNA 測序顯示，C2_IL1B 細(xì)胞表達(dá)的 CXCL3、CXCL8（編碼 IL8）和 S100A9 水平升高（圖 6H）。qRT-PCR 和 ELISA 證實(shí)，Fer-CD4 T 細(xì)胞產(chǎn)生的 CXCL3、IL8 和 S100A9 量明顯高于非 Fer-CD4 T 淋巴細(xì)胞（圖 6I）。為了確定中性粒細(xì)胞趨化性的關(guān)鍵因素，我們使用中和抗體抑制了 Fer-CD4 T 細(xì)胞 CM 中的各種細(xì)胞因子和趨化因子。CXCL3、IL8 或 S100A9 的中和顯著抑制了中性粒細(xì)胞遷移到 Transwell 系統(tǒng)的下腔（圖 6J）和中性粒細(xì)胞骨架重塑（圖 6K）。抑制 CXCL3 對這兩個過程都產(chǎn)生了最大的影響，導(dǎo)致下腔中鐵死亡中性粒細(xì)胞顯著減少（圖 6L）。這些結(jié)果表明，通過分泌一系列趨化因子，包括 CXCL3、IL8 和 S100A9，腫瘤浸潤性 Fer-CD4 T 細(xì)胞吸引并聚集在腫瘤核心中的中性粒細(xì)胞，促進(jìn)連續(xù)和局部的中性粒細(xì)胞鐵死亡。

為了確定鐵死亡中性粒細(xì)胞對 CD4 T 細(xì)胞的影響，在 CD3/CD28 Dynabeads 存在下，將初始 CD4 T 細(xì)胞與來自 Fer-CD4 T 細(xì)胞的 CM 預(yù)處理產(chǎn)生的鐵死亡中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)。有趣的是，與亞鐵死亡中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)顯著抑制了 CD4 T 細(xì)胞產(chǎn)生 IFNγ和 IL4并顯著減輕了 CD4 T 細(xì)胞增殖；然而，它顯著刺激了 IL1β和 CXCL3 的合成（圖 6M）。這表明鐵死亡中性粒細(xì)胞反過來可以促進(jìn) Fer-CD4 T 細(xì)胞的分化。這些數(shù)據(jù)揭示了 Fer-CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的相互反饋調(diào)節(jié)。Fer-CD4 T 細(xì)胞通過 IL1β啟動中性粒細(xì)胞鐵死亡，并通過 CXCL3、IL8 和 S100A9 補(bǔ)充中性粒細(xì)胞水平。反過來，鐵死亡中性粒細(xì)胞促進(jìn) Fer-CD4 T 細(xì)胞的發(fā)育，產(chǎn)生正反饋回路。這種 CD4 T 細(xì)胞-中性粒細(xì)胞串?dāng)_使腫瘤核心中持續(xù)和廣泛的中性粒細(xì)胞鐵死亡成為可能，為腫瘤提供針對 CD8 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的持續(xù)保護(hù)。

Figure 6 中性粒細(xì)胞和 Fer-CD4 T 細(xì)胞之間的串?dāng)_維持了廣泛的中性粒細(xì)胞鐵死亡

7. 破壞 Fer-CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的串?dāng)_可增強(qiáng)抗腫瘤免疫力和化療敏感性

為了評估在體內(nèi)破壞中性粒細(xì)胞和 Fer-CD4 T 細(xì)胞之間有害相互作用的策略的治療潛力，我們將 Cd4-Il1b^Δ轉(zhuǎn)基因小鼠（其中 IL1β + CD4 T 淋巴細(xì)胞耗盡）與自發(fā)致瘤 MMTV-PyMT 小鼠雜交。當(dāng)可觸及的腫瘤發(fā)生時，給予化療藥物。IL1β+ CD4 T 細(xì)胞的耗竭顯著提高了化療效果，并有效延緩了乳腺腫瘤的生長（圖 7A），誘導(dǎo)了大量腫瘤細(xì)胞死亡（圖 7B）。腫瘤樣本的免疫熒光分析顯示，與 ADM 處理的野生型小鼠相比，化療治療的 Cd4-Il1b^Δ小鼠的腫瘤浸潤 CTL 密度顯著增加，而瘤內(nèi) CD4 T 細(xì)胞的數(shù)量未觀察到明顯變化。此外，IL1β+ CD4 T 細(xì)胞的缺失顯著降低了 TIN 中的脂質(zhì)過氧化和 CD71 表達(dá)（圖 7C）。此外，在化療處理的 Cd4-Il1b^Δ小鼠中，腫瘤浸潤的 CD8 T 細(xì)胞不僅密度增加，而且細(xì)胞溶解細(xì)胞因子的合成增加，包括穿孔素和顆粒酶 B（圖 7D）。免疫熒光成像進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)（圖 7E）。同樣，IL1β中和抗體的給藥不影響 CD4 T 細(xì)胞的存活或增殖與化療聯(lián)合使用顯著減緩了腫瘤生長。此外，觀察到中性粒細(xì)胞脂質(zhì)過氧化減少，CTL 細(xì)胞因子產(chǎn)生增加。

此外，當(dāng)使用 Ly6G 抗體從 Cd4-Il1bΔ轉(zhuǎn)基因小鼠中消除中性粒細(xì)胞時，中性粒細(xì)胞耗竭對腫瘤生長沒有明顯的加性影響，表明 Fer-CD4 T 細(xì)胞調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能。為了進(jìn)一步闡明 Fer-CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間相互調(diào)控的重要性，構(gòu)建了 Mrp8-Il1r1^Δ轉(zhuǎn)基因小鼠，其中 IL1R1+ 中性粒細(xì)胞被刪除。值得注意的是，消除 IL1R1 + 中性粒細(xì)胞顯著抑制了腫瘤生長并誘導(dǎo)了廣泛的腫瘤細(xì)胞死亡，增強(qiáng)了化療的療效（圖 7F）。一致地，流式細(xì)胞術(shù)顯示中性粒細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化水平較低，而 CTL 中殺瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平較高，包括穿孔素和顆粒酶 B（圖 7G）。值得注意的是，消除 IL1R1 + 中性粒細(xì)胞導(dǎo)致瘤內(nèi) Fer-CD4 T 細(xì)胞密度降低。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，破壞 Fer-CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的正反饋回路是抑制中性粒細(xì)胞鐵死亡、逆轉(zhuǎn)免疫抑制和增強(qiáng)化療敏感性的有效治療策略。

Figure 7 打破 Fer-CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的串?dāng)_增強(qiáng)了抗腫瘤免疫力和化療敏感性

結(jié)論

值得注意的是，我們的結(jié)果揭示了化療耐藥 TME 中 TIN 中鐵死亡的正反饋擴(kuò)增回路，與 CD4 T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的相互作用密切相關(guān)。具體來說，Fer-CD4 T 細(xì)胞通過 IL1β/NF-κB/MBOAT1 信號傳導(dǎo)引發(fā)中性粒細(xì)胞鐵死亡，并通過 CXCL3、IL8 和 S100A9 吸引和聚集中性粒細(xì)胞，維持 TME 中大部分的鐵死亡中性粒細(xì)胞。反過來，鐵死亡中性粒細(xì)胞促進(jìn)了 Fer-CD4 T 細(xì)胞的分化。因此，大量且持久的鐵死亡中性粒細(xì)胞群體對抗腫瘤免疫產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制作用，從而抵消化療誘導(dǎo)的免疫益處。因此，破壞鐵死亡的擴(kuò)增回路可能是恢復(fù)抗腫瘤免疫和增強(qiáng)治療反應(yīng)的關(guān)鍵方法。

實(shí)驗(yàn)方法：

從腫瘤組織中分離原代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)，bulk RNA 測序，qRT-PCR 檢測，細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞死亡檢測，電子顯微鏡，脂質(zhì)過氧化的測量，免疫熒光染色，脂質(zhì)組學(xué)分析，蛋白質(zhì)印跡分析，腫瘤條件性中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)和短發(fā)夾 RNA 介導(dǎo)的沉默，CRISPR 介導(dǎo)的基因敲除，中性粒細(xì)胞分化，外周血免疫細(xì)胞分離，產(chǎn)生腫瘤特異性 DC 和 T 細(xì)胞，ELISPOT 檢測，細(xì)胞毒性檢測，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，IDO 酶活性的測量，單細(xì)胞 RNA-seq 和數(shù)據(jù)處理，基于細(xì)胞因子分泌的 CD4 淋巴細(xì)胞分離，Boyden 趨化性測定，Microslide 趨化性測定，離體腫瘤切片遷移測定，小鼠研究，TUNEL 測定，統(tǒng)計(jì)分析。

參考文獻(xiàn)：

Zeng W, Zhang R, Huang P, Chen M, Chen H, Zeng X, Liu J, Zhang J, Huang D, Lao L. Ferroptotic Neutrophils Induce Immunosuppression and Chemoresistance in Breast Cancer. Cancer Res. 2025 Feb 1;85(3):477-496. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-1941. PMID: 39531510; PMCID: PMC11786957.