治療誘導(dǎo)的衰老癌細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)核糖蛋白1依賴性PD-L1上調(diào)促進(jìn)癌癥進(jìn)展

傳統(tǒng)化療和放療誘導(dǎo)的癌癥衰老以增殖不良、耐藥性和衰老相關(guān)的分泌表型為特征，因?qū)е掳┌Y復(fù)發(fā)和形成免疫抑制性腫瘤微環(huán)境而備受關(guān)注。然而，癌癥衰老與抗腫瘤免疫之間的關(guān)聯(lián)尚未完全明了。在這里，作者證明衰老的癌細(xì)胞會(huì)通過(guò)促進(jìn)PD-L1 的轉(zhuǎn)錄和糖基化來(lái)提高其水平。本研究證明核糖蛋白1 是癌癥衰老過(guò)程中PD-L1 糖基化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。通過(guò)ER-溶酶體相關(guān)降解途徑，核糖體蛋白1可降低PD-L1的升高水平，從而增加衰老癌細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷的敏感性。通過(guò)降低PD-L1 水平并提高細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的活性，核糖體1 的消耗可抑制雄性小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。此外，核糖蛋白1靶向或抗PD-1療法可減少照射腫瘤中衰老癌細(xì)胞的數(shù)量，并通過(guò)激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抑制癌癥復(fù)發(fā)。該研究于2025年1月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：14.7。

在常規(guī)癌癥治療后，當(dāng)腫瘤體積縮小時(shí)，免疫抑制性 TME 很可能會(huì)得到緩解。這就提出了一個(gè)問(wèn)題：衰老的癌細(xì)胞如何才能躲避 T 細(xì)胞的直接攻擊，并在沒(méi)有免疫抑制 TME 的支持下長(zhǎng)期存在？從合成 OT 細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療誘導(dǎo)的衰老癌細(xì)胞不易受到 T 細(xì)胞的監(jiān)視。通過(guò)電離輻射（IR）照射誘導(dǎo)表達(dá) OVA 的 B16F10 小鼠黑色素瘤球體和細(xì)胞衰老，將這些衰老的癌細(xì)胞和球形細(xì)胞與從 OT-1 小鼠脾細(xì)胞擴(kuò)增而來(lái)的 OT 細(xì)胞共同培養(yǎng)。評(píng)估這些腫瘤球體內(nèi)的 T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況（圖 1a），并測(cè)量癌細(xì)胞中的 Caspase-3 活性（圖 1b ）。與對(duì)照組（Cont）相比，表達(dá) OVA 的 B16F10 癌細(xì)胞球體與 IR 誘導(dǎo)的癌癥衰老（IR-CS）相比，OT 細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖 1a_IR-CS），OVA 表達(dá)的 B16F10 細(xì)胞在 OT 細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中顯示出較低的 caspase-3 活性（圖 1b_IR-CS），這表明衰老的癌細(xì)胞已經(jīng)獲得獨(dú)立于 TME 的逃避 T 細(xì)胞監(jiān)控的能力。

眾所周知，癌細(xì)胞會(huì)通過(guò)過(guò)度表達(dá)免疫檢查點(diǎn)蛋白來(lái)逃避 T 細(xì)胞的監(jiān)控29 ，而最近的報(bào)道表明，PD-L1 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞功能障礙可能是衰老過(guò)程中的一個(gè)重要機(jī)制。事實(shí)上，PD-L1 水平在 IR 誘導(dǎo)的衰老球和 H460 細(xì)胞中上調(diào)（圖 1c、d）。進(jìn)一步研究其他類型應(yīng)激誘導(dǎo)的癌細(xì)胞衰老中 PD-L1 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在多柔比星（DNA 損傷應(yīng)激；Doxo-CS）（圖 1e）或 PTEN 缺失（非 DNA 損傷應(yīng)激；PTEN-loss-CS）誘導(dǎo)的癌細(xì)胞衰老中，PD-L1 的表達(dá)顯著增加（圖 1f 和補(bǔ)充圖 1c_PTEN-loss-CS）。此外，在其他類型的癌細(xì)胞中，包括 A549 肺癌、U2OS 骨肉瘤、H1299 肺癌和 HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞中，也觀察到紅外暴露誘導(dǎo)細(xì)胞衰老后 PD-L1 表達(dá)增加（圖 1g）。在 PD-L1 基礎(chǔ)表達(dá)較低（A549 和 U2OS）和較高（H1299 和 HCT116）的細(xì)胞中，IR 都能增加 PD-L1 的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，癌細(xì)胞衰老通常會(huì)提高 PD-L1 水平，使衰老的癌細(xì)胞能夠逃避 T 細(xì)胞的監(jiān)控。

先前的研究表明，放療和化療可在治療后早期因 DNA 損傷和其他細(xì)胞應(yīng)激而提高 PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平。與之前的報(bào)道一致，PD-L1 mRNA 水平在紅外照射后兩天內(nèi)逐漸增加3 到 6 倍。值得注意的是，在紅外暴露后的第四天，當(dāng)細(xì)胞衰老變得明顯時(shí)，PD-L1 mRNA 水平激增至 80 倍（見(jiàn)圖 1h）。這意味著 PD-L1 mRNA 的增加可能在衰老晚期更為明顯，而不僅僅是紅外暴露的結(jié)果。為研究獨(dú)立于紅外誘導(dǎo)的 PD-L1 mRNA 上調(diào)而擴(kuò)大 PD-L1 表達(dá)的潛在機(jī)制，作者在內(nèi)源性 PD-L1 基因敲除條件下使用 pCI-neo-PD-L1 野生型（WT）-Flag 質(zhì)粒。該質(zhì)粒的啟動(dòng)子不受紅外誘導(dǎo)應(yīng)激的影響，因此可以驗(yàn)證細(xì)胞衰老對(duì) PD-L1 的翻譯后調(diào)控（圖 1i）。有趣的是，癌癥衰老會(huì)顯著提高外源性 PD-L1 的水平，而 PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控卻不會(huì)影響這一水平。此外，在用環(huán)己亞胺（CHX）處理的衰老癌細(xì)胞中，PD-L1 蛋白的半衰期明顯延長(zhǎng)（圖 1j），這表明癌癥衰老可能會(huì)增強(qiáng) PD-L1 蛋白的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后調(diào)控可能協(xié)同導(dǎo)致衰老癌細(xì)胞中的 PD-L1 水平升高。

PD-L1 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)經(jīng)由 ER 和高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜。在功能上，由于與 PD-1 的結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞膜上，因此大量與膜結(jié)合的 PD-L1 對(duì) T 細(xì)胞抑制至關(guān)重要。作者仔細(xì)研究PD-L1在IR-CS、Doxo-CS和PTEN缺失-CS細(xì)胞中的胞內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，衰老癌細(xì)胞的ER、高爾基體和細(xì)胞膜上的PD-L1信號(hào)明顯增加（圖2a；白色箭頭表示ER的位置，黃色箭頭表示細(xì)胞膜的位置，青色箭頭表示高爾基體的位置），表明衰老癌細(xì)胞中上調(diào)的PD-L1在細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜。流式細(xì)胞分析證實(shí)，衰老細(xì)胞中與膜結(jié)合的 PD-L1 數(shù)量大幅增加（圖 2b_IR-CS）。為測(cè)量細(xì)胞膜上能夠與其受體 PD-1 結(jié)合的功能性 PD-L1 的數(shù)量，使用重組 PD-1-FC 蛋白進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，衰老癌細(xì)胞中 PD-L1 與 PD-1-FC 的結(jié)合率明顯更高（圖 2c_PD-1-FC 綠色）。這些結(jié)果表明，癌細(xì)胞衰老可以激活上調(diào)的 PD-L1 的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而大大提高細(xì)胞表面功能性 PD-L1 的水平。

最近的報(bào)道表明，細(xì)胞衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)糖基化譜發(fā)生顯著變化，因此重點(diǎn)研究癌細(xì)胞衰老與 PD-L1 糖基化之間的關(guān)系。為確定衰老癌細(xì)胞中 PD-L1 糖基化的關(guān)鍵調(diào)控因子，作者研究了紅外誘導(dǎo)衰老癌細(xì)胞產(chǎn)生的微陣列數(shù)據(jù)集中糖基轉(zhuǎn)移酶及其輔助因子的表達(dá)譜。該數(shù)據(jù)集與之前被鑒定為與 PD-L138 有潛在相互作用的 N-糖基化相關(guān)因子進(jìn)行交叉比對(duì)。在紅外誘導(dǎo)衰老的H460細(xì)胞中，35個(gè)N-糖基化相關(guān)因子的表達(dá)量升高，其中9個(gè)與之前被認(rèn)為與PD-L1相互作用的候選因子相吻合（圖2d）。這九個(gè)候選因子的表達(dá)變化通過(guò)熱圖可視化（圖 2e），并通過(guò) qRT-PCR 驗(yàn)證（圖 2f）。值得注意的是，9 個(gè)候選者中的 4 個(gè) STT3B、DDOST、RPN1 和 RPN2 是 OST-B 復(fù)合物的組成成分，與 OST-A 復(fù)合物相比，OST-B 復(fù)合物對(duì)某些類型的未折疊或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)具有更高的親和力，這意味著 OST-B 復(fù)合物表達(dá)的增加促進(jìn)糖基化過(guò)程，以應(yīng)對(duì)癌細(xì)胞衰老過(guò)程中的應(yīng)激條件。

為評(píng)估每個(gè)候選基因?qū)λダ霞?xì)胞中PD-L1轉(zhuǎn)錄和蛋白穩(wěn)定性的影響，用靶向9個(gè)候選基因的siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞，然后暴露于IR誘導(dǎo)衰老。雖然去除了所有候選基因并不會(huì)影響 IR-CS 升高的 PD-L1 mRNA 水平（圖 2g），但沉默 OST-B 復(fù)合物成分明顯降低IR 誘導(dǎo)的 PD-L1 蛋白水平的升高（圖 2h）。特別是，沉默 STT3B 和 RPN1 可顯著降低 PD-L1 水平（圖 2h，RPN1 和 STT3B）。沉默 RPN1 和 DDOST 顯示出明顯的條帶移動(dòng)，這意味著糖基化異常（圖 2h，DDOST 和 RPN1 的紅色箭頭）。就 RPN2 而言，雖然其沉默降低 PD-L1 的水平，但并沒(méi)有改變 PD-L1 的帶移、穩(wěn)定性和膜水平（圖 2h）。

為研究 RPN1 在衰老癌細(xì)胞中作為 PD-L1 糖基化和穩(wěn)定的潛在關(guān)鍵調(diào)控因子的作用，利用癌癥基因組圖譜（TCGA）的數(shù)據(jù)集進(jìn)行一項(xiàng)硅分析。分析的重點(diǎn)是腫瘤和抗腫瘤免疫相關(guān)因素，使用基于 R 軟件包的程序 TIMER2.040-42 進(jìn)行。首先使用 Gene_DE 模塊比較TCGA 所有腫瘤中腫瘤和匹配正常組織的 RPN1 mRNA 表達(dá)水平（圖 3a）。結(jié)果表明，與正常組織相比，RPN1 mRNA水平在乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌和肺癌等不同類型的癌癥中都明顯升高。隨后研究了 PD-L1 和 RPN1 水平與癌癥衰老標(biāo)志物之間的相關(guān)性，這些標(biāo)志物在衰老時(shí)轉(zhuǎn)錄水平升高，包括基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-2/3、白細(xì)胞介素 (IL)-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白 (IGFBP)3/5/7、CDKN1A (p21) 和趨化因子 (C-C motif) 配體 (CCL5)43（圖 3b）。有趣的是，熱圖上顯示的斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)值表明，大多數(shù)癌癥，尤其是乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）、結(jié)直腸腺癌（COAD）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、胰腺癌（PAAD）和前列腺癌（PRAD）等主要癌癥存在正相關(guān)。這些結(jié)果意味著 RPN1、PD-L1 調(diào)控和癌細(xì)胞衰老之間可能存在密切關(guān)系。

最后，使用細(xì)胞組成估算模塊生成一個(gè)熱圖表，列出了所有 TCGA 腫瘤中 RPN1 表達(dá)水平與 CD8⁺ T 細(xì)胞比例之間的 Spearman 相關(guān)性。為提高分析的準(zhǔn)確性，還分析了干擾素（IFN）-β和缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α，已知這兩種因子分別與腫瘤中的 CD8⁺ T 細(xì)胞免疫正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，與眾所周知的抗腫瘤免疫抑制因子 HIF-1α 相似，RPN1 的表達(dá)與各種腫瘤類型中的腫瘤浸潤(rùn) CD8⁺ T 細(xì)胞群呈顯著負(fù)相關(guān)（圖 3c）?？紤]到圖 1 和圖 2 中顯示的結(jié)果，對(duì) TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析的這些發(fā)現(xiàn)表明，RPN1 可能是導(dǎo)致癌癥衰老過(guò)程中 PD-L1 穩(wěn)定的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能對(duì)腫瘤發(fā)生過(guò)程和抗腫瘤免疫產(chǎn)生有害影響。

PD-L1 有四個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：如圖 4a（上圖）所示，PD-L1 有四個(gè) N-糖基化位點(diǎn)：N35、N192、N200 和 N21917,24。通過(guò)比較 WT PD-L1 與其非糖基化形式 4NQ（N35Q、N192Q、N200Q 和 N219Q）PD-L1，可以看出這些位點(diǎn)高度糖基化（圖 4a）。暴露于 IR-CS 后，完全糖基化的 WT PD-L1 （50-55 kDa）水平顯著增加。轉(zhuǎn)染 RPN1 siRNA 會(huì)導(dǎo)致 WT PD-L1 水平下降，并出現(xiàn)明顯的糖基化異常帶移動(dòng)。用一種廣譜 N-糖基化抑制劑妥尼霉素處理后，WT PD-L1 的條帶轉(zhuǎn)移到與缺乏 N-糖基化的 4NQ 突變體（34 kDa）相對(duì)應(yīng)的大小，這證實(shí)了妥尼霉素完全抑制 PD-L1 的 N-糖基化。值得注意的是，在所有測(cè)試的實(shí)驗(yàn)條件下，都沒(méi)有出現(xiàn)低于 4NQ 突變體大小的條帶。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染 RPN1 siRNA 對(duì) 4NQ PD-L1 沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明，由于 RPN1 的缺失，PD-L1 的條帶轉(zhuǎn)移是由異常的 N-糖基化引起的，這進(jìn)一步表明 RPN1 與 PD-L1 的 N-糖基化過(guò)程有關(guān)。

為驗(yàn)證這一點(diǎn)，對(duì) PD-L1 進(jìn)行聚糖結(jié)構(gòu)分析。純化的 N-聚糖經(jīng)色譜分離，并使用 nanoLC/Q-TOF MS 系統(tǒng)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，RPN1 基因敲除后，PD-L1 的總體聚糖水平下降，進(jìn)一步說(shuō)明 RPN1 基因耗竭影響的是總聚糖水平（圖 4b），而不是改變 PD-L1 的特定末端聚糖結(jié)構(gòu)（圖 4c-g）。雖然 RPN1 并不具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，但其重要作用在于促進(jìn)底物多肽與 OST 復(fù)合物催化域的配位和定位，從而提高蛋白質(zhì)糖基化的效率和精確度。結(jié)合之前的這些報(bào)道，這些研究結(jié)果支持以下結(jié)論：RPN1 主要影響 N-糖基化的早期階段，促進(jìn)預(yù)組裝的聚糖在翻譯后立即結(jié)合到 PD-L1 多肽中。

為研究 RPN1 缺失對(duì)癌癥衰老的影響，通過(guò)衰老相關(guān)的 β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性檢測(cè)（圖 5a）研究用三種不同的靶向 RPN1 siRNA 處理的細(xì)胞的衰老表型。這些 RPN1 siRNAs 能有效降低 PD-L1 水平（圖 5b），但對(duì) IR 誘導(dǎo)的衰老本身沒(méi)有影響（圖 5a）。此外，RPN1 的消耗有效中和了在 Doxo-CS 和 PTEN 缺失-CS 細(xì)胞中觀察到的 PD-L1 表達(dá)的增加（圖 5c_Doxo-CS 和 5d_PTEN-loss-CS）。此外，還檢測(cè)了人類癌細(xì)胞系中的 PD-L1 蛋白水平（圖 5e），并分析了在 PD-L1 基礎(chǔ)水平較高（H1975 和 BT549）或較低（H460、A549 和 HCC827）的癌細(xì)胞系中敲除或過(guò)表達(dá) RPN1 的效果（圖 5f、g）。即使在沒(méi)有衰老的情況下，敲除 RPN1 也會(huì)降低 PD-L1 水平（圖 5f），而過(guò)表達(dá) RPN1 則會(huì)提高 PD-L1 水平（圖 5g），這表明 RPN1 在應(yīng)激和正常條件下對(duì) PD-L1 的穩(wěn)定都至關(guān)重要。在 IR-CS 中消耗 RPN1 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面 PD-L1 水平下降（圖 5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，黃色箭頭表示細(xì)胞膜位置；以及圖 5j）以及 PD-L1 與 ER 標(biāo)記共定位（圖 5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，黃色箭頭表示細(xì)胞膜位置；以及圖 5j）。5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，白色箭頭表示 ER 的位置）和高爾基體（圖 5i_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，青色箭頭表示高爾基體的位置）。

為確定 RPN1 缺失在衰老癌細(xì)胞免疫抑制活性中的作用，作者檢測(cè)了 PD-1 結(jié)合、T 細(xì)胞浸潤(rùn)和 T 細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷活性。RPN1 的耗竭降低膜結(jié)合 PD-L1 的 IR-CS 增強(qiáng)水平（圖 5j），并持續(xù)減少 PD-1 蛋白與細(xì)胞表面的結(jié)合（圖 5k）。去掉 RPN1 后，OT-1 細(xì)胞對(duì) B16F10-OVA 球形細(xì)胞的浸潤(rùn)率（圖 5l）和 OT-1 細(xì)胞對(duì) B16F10-OVA 癌細(xì)胞的殺傷活性（圖 5m）均明顯恢復(fù)，而 IR-CS 則抑制這些活性。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，RPN1 在通過(guò)增加細(xì)胞膜上的 PD-L1 水平使衰老癌細(xì)胞逃避 T 細(xì)胞監(jiān)控方面發(fā)揮重要作用。

具有完整糖基結(jié)構(gòu)的 PD-L1 通過(guò)細(xì)胞內(nèi) ER 至高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。相反，異?；蛭刺腔?/span> PD-L1 則通過(guò)與 ERAD 相關(guān)的蛋白酶體降解和/或溶酶體降解途徑降解。為確定 RPN1 在 PD-L1 蛋白的平衡調(diào)節(jié)中的作用，作者進(jìn)行了 CHX 追逐試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在用 CHX 處理的 IR 誘導(dǎo)的衰老癌細(xì)胞中，RPN1 的耗竭明顯降低PD-L1 蛋白的穩(wěn)定性（圖 6a）。溶酶體抑制劑氯喹（CQ）逆轉(zhuǎn)了衰老癌細(xì)胞中 RPN1 缺失引起的 PD-L1 下調(diào)，而蛋白酶體抑制劑 MG132 對(duì) PD-L1 蛋白水平?jīng)]有明顯影響（圖 6b）。這表明，RPN1耗竭對(duì)PD-L1水平的影響可能涉及溶酶體降解途徑，而不是ERAD。

PD-L1 通過(guò)內(nèi)吞作用在細(xì)胞膜上循環(huán)；在這一過(guò)程中，功能失調(diào)的 PD-L1 通過(guò)溶酶體途徑在形成的內(nèi)體中降解。Rab5和Rab11是內(nèi)吞和內(nèi)質(zhì)體形成過(guò)程中不可或缺的物質(zhì)，它們的敲除不能恢復(fù)去除RPN1的衰老細(xì)胞中的PD-L1水平（圖6c），這意味著RPN-1調(diào)控的途徑可能與另一種不同于循環(huán)過(guò)程的溶酶體降解機(jī)制有關(guān)。最近的研究表明，某些異常蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入溶酶體，并通過(guò) ER 溶酶體相關(guān)降解（ERLAD）途徑被消除。值得注意的是，IR-CS 增加了序列相似性 134 家族成員 B（FAM134B）（圖 6c）的水平，FAM134B 是一種結(jié)合 LC3 的 ER 吞噬受體，是 ERLAD 的關(guān)鍵組成部分。當(dāng)去除 FAM134B 時(shí)，去除 RPN1 的衰老細(xì)胞中降低的 PD-L1 水平得到恢復(fù)（圖 6c）。與此相一致的是，免疫熒光（IF）染色也顯示，CQ 處理 RPN1 缺失的衰老細(xì)胞后，PD-L1 與 FAM134B（圖 6d）或 LC3B（圖 6e）的共定位增強(qiáng)。此外，在 CQ 存在的情況下，RPN1 缺失顯著增加 PD-L1 與溶酶體標(biāo)志物溶酶體相關(guān)膜蛋白 1（LAMP1）的共定位，表明 PD-L1 在溶酶體中的積累（圖 6f白色區(qū)域）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在衰老癌細(xì)胞中，RPN1 的消耗通過(guò) ERLAD 途徑介導(dǎo) PD-L1 的降解，進(jìn)一步證明 RPN1 在調(diào)節(jié) PD-L1 蛋白平衡中的關(guān)鍵作用（圖 6g）。

為驗(yàn)證RPN1 對(duì)放療后腫瘤組織中PD-L1 表達(dá)和T 細(xì)胞活化的影響，使用免疫功能正常的合成小鼠腫瘤模型進(jìn)行體內(nèi)研究。用轉(zhuǎn)染Cont siRNA（Cont si）或RPN1 siRNA（RPN1 si）的CT26 細(xì)胞接種BALB/c 小鼠。第10 天，小鼠暴露于12 Gy 劑量的紅外照射。然后，如示意圖所示，通過(guò)瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染給藥Cont si 或RPN1 si（圖7a_圖底）。暴露于紅外線后，腫瘤大小明顯縮小，第一周內(nèi)縮小達(dá)50%。然而，到照射后第二周結(jié)束時(shí)，腫瘤又開(kāi)始生長(zhǎng)，幾乎恢復(fù)到原來(lái)的大小。這一趨勢(shì)在所有樣本中都是一致的（圖7a_右上圖，紅線）。然而，值得注意的是，RPN1 si 處理組的腫瘤大小持續(xù)縮小，在整個(gè)觀察期間都沒(méi)有再生長(zhǎng)的跡象（圖7a_ 右下圖，藍(lán)線）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，盡管未接受輻照的Cont si 組和RPN1 si 組的腫瘤大小沒(méi)有明顯差異，但接受IR 處理的Cont si 組的腫瘤明顯比RPN1 si 組小很多（圖7a_右下圖，藍(lán)線）。

與作者提出的機(jī)制一致，IR-CS能顯著提高腫瘤樣本中PD-L1 和RPN1 的水平（圖7d、e）。此外，RPN1 si 處理抑制了IR-CS 誘導(dǎo)的PD-L1 表達(dá)上調(diào)（圖7d、e）。與我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5 和圖6）一致，腫瘤裂解液的免疫印跡顯示，在暴露于IR 的腫瘤中，PD-L1和RPN1 之間存在明顯的正相關(guān)性（圖7f ）。與這些結(jié)果一致的是，RPN1的耗竭明顯增加CD8⁺ T 細(xì)胞在IR-CS 下腫瘤組織中的浸潤(rùn)和活性（如顆粒酶B 的表達(dá)所示；GB）（圖7g-i），這反過(guò)來(lái)又促進(jìn)了衰老腫瘤組織的凋亡（圖7j）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證基于T 細(xì)胞的RPN1 靶向療法的療效，作者測(cè)量了IR 與Cont si 或RPN1 si 瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合后的腫瘤生長(zhǎng)和長(zhǎng)期存活率，無(wú)論是否有CD8 T 細(xì)胞耗竭。結(jié)果是，瘤內(nèi)RPN1 基因耗竭抑制了IR 治療后的癌癥復(fù)發(fā)（圖7k_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + IgG），并大大提高動(dòng)物的存活率（圖7l_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + IgG）。與本研究機(jī)制研究一致，用抗CD8 mAb 治療進(jìn)行CD8 ⁺ T 細(xì)胞耗竭有效地中和了 RPN1 靶向治療的益處（圖7k_RPN1 si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + α-CD8 mAb 和圖7l_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS ⁺ α-CD8 mAb）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，抑制RPN1 的表達(dá)可以抑制放療誘導(dǎo)的衰老腫瘤中PD-L1 的增加，從而有可能通過(guò)增強(qiáng)抗腫瘤免疫力來(lái)防止癌癥復(fù)發(fā)。

圖 7 中的結(jié)果表明，通過(guò)瘤內(nèi) siRNA 遞送應(yīng)用 RPN1 靶向治療可激活腫瘤組織內(nèi)的 T 細(xì)胞免疫并下調(diào) PD-L1。為評(píng)估 RPN1 靶向療法對(duì)衰老癌細(xì)胞的影響，作者分析 SA-β-Gal 活性和 p21 表達(dá)水平，這是癌癥衰老的既定標(biāo)志物。暴露于紅外的腫瘤樣本顯示出 SA-β-Gal 活性和 p21 表達(dá)水平的明顯增加，而用 RPN1 si 治療的腫瘤樣本則顯示出紅外誘導(dǎo)的這些參數(shù)的顯著降低（圖 8a-c）。腫瘤裂解液的免疫印跡分析顯示，在紅外暴露的腫瘤中，p21 和 RPN1 之間存在明顯的正相關(guān)性（圖 8d）。總之，這些結(jié)果表明，衰老的癌細(xì)胞很可能因 RPN1 缺失引起的 PD-L1 損失而被 T 細(xì)胞免疫所消滅。

為進(jìn)一步探索這一假設(shè)，在IR-CS動(dòng)物模型中分析給予抗PD -1治療性抗體后的衰老癌細(xì)胞群。將CT26細(xì)胞植入BALB/c小鼠體內(nèi)，于接種后第13天進(jìn)行12 Gy的照射，抗PD -1治療性抗體通過(guò)腹腔注射給藥?？紤]到適合分析的腫瘤大小和較高的CTL活性，我們?cè)诘诙谓o予抗PD -1抗體后1天進(jìn)行了采樣。有趣的是，與rpn1靶向治療的結(jié)果相似，抗PD -1治療性抗體治療組的SA-β-Gal活性（圖8f）和p21表達(dá)水平（圖8g）降低，同時(shí)腫瘤內(nèi)CTL活性增加（圖8h-j）。這些結(jié)果支持通過(guò)PD-L1/ PD -1特異性療法，T細(xì)胞免疫可以有效地靶向和消除輻射誘導(dǎo)的衰老癌細(xì)胞。

最后，通過(guò)4個(gè)月以上的長(zhǎng)期觀察，評(píng)估T細(xì)胞免疫與ICB清除衰老癌細(xì)胞的相關(guān)性及其治療價(jià)值。將CT26細(xì)胞植入BALB/c小鼠體內(nèi)，于接種后第11天進(jìn)行12 Gy的照射。如圖所示（圖8k_底部），通過(guò)腹腔注射給予抗PD -1治療性抗體和抗CD8耗竭性抗體。與IR單藥治療組相比，IR聯(lián)合PD-1阻斷組顯示出更有效的腫瘤抑制和更長(zhǎng)的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（圖8k， 1 α-PD-1 mAb + IR- cs + IgG），并且聯(lián)合治療的這些益處被CD8⁺ T細(xì)胞清除抵消（圖8k， 1 α-PD-1 mAb + IR- cs + α-CD8 mAb）。這些結(jié)果清楚地表明，清除PD - l1陽(yáng)性衰老癌細(xì)胞可以通過(guò)T細(xì)胞免疫抑制癌癥復(fù)發(fā)，從而增強(qiáng)治療效果。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，常規(guī)療法可以通過(guò)解除抑制T細(xì)胞的TME來(lái)恢復(fù)腫瘤內(nèi)CTL活性。然而，治療誘導(dǎo)的衰老癌細(xì)胞的PD-L1表達(dá)增加；這就創(chuàng)造了一個(gè)“保護(hù)傘”，可以潛在地保護(hù)殘留的癌細(xì)胞不受CTL監(jiān)視。少數(shù)存活的殘余癌細(xì)胞可以增殖并重新建立抑制T細(xì)胞的TME，導(dǎo)致復(fù)發(fā)。因此，通過(guò)RPN1靶向和/或PD-L1/ PD -1靶向治療靶向這些表達(dá)PD-L1的衰老癌細(xì)胞可能成為一種有希望的方法，以提高治療效果和預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)（圖8m）。

TCGA數(shù)據(jù)分析、質(zhì)譜分析、qRT-PCR、Western blotting、RNA干擾、免疫共沉淀、GST pull-down、體外甲基化測(cè)定、基因組DNA提取和基因分型PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光、PD-1結(jié)合實(shí)驗(yàn)、三維球體形成、T細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)、T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、裸鼠皮下注射模型、輻照腫瘤模型、免疫組化

Hwang HJ, Kang D, Shin J, Jung J, Ko S, Jung KH, Hong SS, Park JE, Oh MJ, An HJ, Yang WH, Ko YG, Cha JH, Lee JS. Therapy-induced senescent cancer cells contribute to cancer progression by promoting ribophorin 1-dependent PD-L1 upregulation. Nat Commun. 2025 Jan 3;16(1):353. doi: 10.1038/s41467-024-54132-1. PMID: 39753537; PMCID: PMC11699195