CARM1介導(dǎo)的OGT精氨酸甲基化通過穩(wěn)定OGT促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌糖酵解

O-GlcNAc糖基化修飾由OGT催化，在調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解中發(fā)揮重要作用。然而，OGT調(diào)控的機(jī)制在很大程度上仍然未知。在這里，我們展示了CARM1在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞中感應(yīng)細(xì)胞外葡萄糖水平的變化。增加的葡萄糖上調(diào)了CARM1和OGT。CARM1在精氨酸348位置甲基化OGT，通過去泛素化酶USP9X的結(jié)合促進(jìn)其穩(wěn)定性。OGT的精氨酸甲基化增加了全局O-GlcNAc糖基化水平，從而促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞中的糖酵解。OGT的精氨酸甲基化還上調(diào)了c-Myc表達(dá)，并在體外和體內(nèi)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖。OGT表達(dá)與人類NSCLC樣本中的CARM1呈正相關(guān)。當(dāng)前的研究結(jié)果揭示了響應(yīng)葡萄糖濃度變化通過精氨酸甲基化穩(wěn)定OGT的機(jī)制。該研究還闡明了CARM1-USP9X-OGT軸在NSCLC糖酵解中的作用，為NSCLC提供了潛在的新靶點(diǎn)或治療策略。本文于2024年12月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

為了探索精氨酸甲基化是否涉及響應(yīng)葡萄糖濃度變化對(duì)OGT的調(diào)節(jié)，我們首先檢測了全局O-GlcNAcylation和與細(xì)胞外葡萄糖變化相關(guān)的精氨酸甲基化。結(jié)果顯示，O-GlcNAcylation和精氨酸甲基化水平與葡萄糖的變化一致相關(guān)（圖1A）。在H1299細(xì)胞中，內(nèi)源性OGT被精氨酸甲基化（圖1B）。OGT的精氨酸甲基化隨著葡萄糖濃度的增加而增加（圖1C），并在葡萄糖耗盡時(shí)以時(shí)間依賴的方式減少（圖1D）。這些結(jié)果表明OGT被精氨酸甲基化修飾，并且這種修飾是依賴于葡萄糖的。然后，我們旨在確定特定于精氨酸甲基化OGT的PRMT，并發(fā)現(xiàn)只有CARM1與OGT強(qiáng)烈相互作用，并且其表達(dá)與葡萄糖的變化一致相關(guān)（圖1E-G）。OGT的精氨酸甲基化與CARM1表達(dá)的上調(diào)相關(guān)（圖1H）。用CARM1抑制劑TP064處理以劑量依賴的方式減少了OGT的精氨酸甲基化（圖1I），而在體外暴露于外源性CARM1以劑量依賴的方式增加了OGT的精氨酸甲基化（圖1J）。這些結(jié)果表明CARM1催化了OGT的精氨酸甲基化。

為了確定OGT的精氨酸甲基化位點(diǎn)，我們進(jìn)行了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。確定了六個(gè)甲基化精氨酸殘基（Arg 42/113/321/348/420/973）。為了確定主要的精氨酸甲基化位點(diǎn)，將這六個(gè)精氨酸殘基替換為賴氨酸，并轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞。結(jié)果顯示，OGT R348K和OGT R973K突變體減少了OGT的精氨酸甲基化（圖2A）。為了確定CARM1介導(dǎo)的OGT精氨酸甲基化的特定靶點(diǎn)，我們生成了帶有GST標(biāo)簽的OGT缺失突變體（圖2B）。GST下拉實(shí)驗(yàn)顯示，OGT的TPR結(jié)構(gòu)域突變體與CARM1有強(qiáng)烈的相互作用（圖2C）。R348位點(diǎn)位于TPR結(jié)構(gòu)域中，而R973位點(diǎn)則不在此結(jié)構(gòu)域，這表明CARM1在R348位點(diǎn)催化OGT的精氨酸甲基化。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了體外甲基化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示OGT R348K的精氨酸甲基化程度顯著低于OGT野生型（WT）（圖2D）。此外，TP064處理減少了OGT WT的精氨酸甲基化，但對(duì)OGT R348K突變體沒有影響（圖2E）。此外，葡萄糖饑餓處理減少了OGT WT的精氨酸甲基化，但對(duì)OGT R348K突變體沒有影響（圖2F）。這些結(jié)果表明CARM1在R348位點(diǎn)對(duì)OGT進(jìn)行了精氨酸甲基化。

在證實(shí)了CARM1在R348位點(diǎn)甲基化OGT之后，我們檢查了精氨酸甲基化的作用。我們首先顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，OGT和CARM1一致地上調(diào)，并且敲減CARM1抑制了OGT的上調(diào)（圖3A，B）。類似地，隨著饑餓時(shí)間的增加，OGT和CARM1同時(shí)下調(diào)，而過表達(dá)CARM1抑制了OGT的下調(diào)（圖3C，D）。敲減CARM1下調(diào)了OGT蛋白表達(dá)（圖3E），而mRNA水平幾乎沒有變化（圖3E）。此外，TP064處理下調(diào)了OGT蛋白表達(dá)（圖3F）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明CARM1介導(dǎo)的OGT精氨酸甲基化負(fù)責(zé)其穩(wěn)定性。

OGT通過蛋白酶體降解，這使我們假設(shè)CARM1通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)OGT的穩(wěn)定性。用蛋白酶體抑制劑MG132處理逆轉(zhuǎn)了CARM1敲減對(duì)OGT的抑制效應(yīng)（圖3G），并且CARM1敲減在存在蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）的情況下減少了OGT的半衰期（圖3H）。此外，用TP064處理以劑量依賴的方式增加了H1299細(xì)胞中OGT的泛素化（圖3I）。這些結(jié)果支持CARM1通過減少其泛素化來穩(wěn)定OGT的觀點(diǎn)。因此，我們檢查了OGT R348K的甲基化是否有助于OGT的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)OGT R348K突變體中的泛素化水平高于OGT野生型（WT）和OGT R348F（模擬持續(xù)甲基化狀態(tài)）突變體（圖3J）。這些結(jié)果表明CARM1介導(dǎo)的OGT R348精氨酸甲基化促進(jìn)了OGT的穩(wěn)定。

去泛素化在蛋白質(zhì)穩(wěn)定中起著重要作用。我們鑒定了幾個(gè)USPs家族成員（USP7, USP9X, USP10, USP15），它們可以與OGT結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)，在敲減USP9X后，OGT的下調(diào)最為明顯。敲減USP9X顯著降低了OGT的蛋白水平，而mRNA水平幾乎沒有變化（圖4A）。MG132逆轉(zhuǎn)了USP9X敲減對(duì)OGT的抑制效應(yīng)（圖4B）。此外，USP9X敲減縮短了OGT的半衰期（圖4C），并且USP9X敲減后OGT的泛素化增加（圖4D）。OGT R348K突變體顯示比OGT WT更高的泛素化水平，并且敲減USP9X增加了OGT WT的泛素化，但對(duì)OGT R348K突變體沒有影響（圖4E）。這些結(jié)果表明USP9X是OGT的去泛素化酶，并通過OGT R348精氨酸甲基化穩(wěn)定OGT。接下來，我們檢查了OGT的精氨酸甲基化如何通過USP9X影響其穩(wěn)定性的機(jī)制。我們首先通過內(nèi)源性共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了USP9X在H1299細(xì)胞中與OGT結(jié)合（圖4G）。GST下拉實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，OGT的TPR結(jié)構(gòu)域突變體與USP9X有強(qiáng)烈的相互作用（圖4F）。去泛素化酶USP9X與OGT的相互作用在OGT R348K突變體中減弱（圖4H）。此外，TP064處理顯著削弱了OGT WT與USP9X之間的結(jié)合相互作用，但對(duì)OGT R348K沒有影響（圖4I）。這些結(jié)果確認(rèn)了CARM1對(duì)OGT R348的精氨酸甲基化通過促進(jìn)與USP9X的結(jié)合來穩(wěn)定OGT。

由于OGT的精氨酸甲基化會(huì)影響OGT的穩(wěn)定性，我們進(jìn)一步研究它是否會(huì)影響O-GlcNAcylation。我們發(fā)現(xiàn)CARM1的抑制降低了O-GlcNAcylation水平（圖5A， B）。與OGT WT和R348F突變體相比，OGT R348K突變體的O-GlcNAcylation水平顯著降低（圖5C）。TP064處理顯著降低了OGT WT中的O-GlcNAcylation，但在OGT R348K突變體中沒有（圖5D）。我們還研究了OGT甲基化對(duì)糖酵解的影響。結(jié)果顯示，與OGT WT和R348F突變體相比，OGT R348K突變體的乳酸產(chǎn)生和ECAR減少（圖5E， F）。TP064抑制CARM1顯著降低了OGT WT中的乳酸產(chǎn)生和ECAR，而OGT R348K突變體沒有表現(xiàn)出顯著變化（圖5G， H）。這些結(jié)果表明，CARM1對(duì)OGT R348的精氨酸甲基化促進(jìn)了NSCLC中的糖酵解。

研究表明，OGT可以通過增強(qiáng)c-Myc的穩(wěn)定性來促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們發(fā)現(xiàn)，與OGT野生型（WT）和R348F突變體相比，OGT R348K突變體中的c-Myc表達(dá)水平顯著較低（圖6A）。OGT WT中的c-Myc表達(dá)顯著高于OGT R348K突變體，且TP064處理顯著下調(diào)了OGT WT中的c-Myc表達(dá)，而OGT R348K突變體的變化不明顯（圖6B）。然后我們檢查了OGT精氨酸甲基化對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與OGT WT和R348F突變體相比，OGT R348K突變體的細(xì)胞增殖率較低（圖6C, F）。此外，抑制CARM1在OGT WT中比在R348K突變體中引起的增殖抑制更為顯著（圖6D, E）。為了評(píng)估OGT精氨酸甲基化在體內(nèi)對(duì)NSCLC的作用，將H1299-shOGT 3’-UTR-WT/R348K/R348F細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。結(jié)果顯示，注射OGT R348K突變體細(xì)胞的裸鼠的腫瘤大小和重量低于注射OGT WT和R348F突變體細(xì)胞的裸鼠（圖6G, H）。這些結(jié)果確認(rèn)了OGT的精氨酸甲基化修飾促進(jìn)了NSCLC的增殖。為了探討OGT和CARM1的臨床相關(guān)性，在人類NSCLC樣本中進(jìn)行了免疫組化染色。CARM1和OGT在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（圖6I–K）。數(shù)據(jù)分析顯示，OGT與CARM1之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6L）。在NSCLC中，CARM1表達(dá)與OGT表達(dá)呈正相關(guān)。

我們展示了CARM1能夠感應(yīng)細(xì)胞外葡萄糖的增加，并在R348位點(diǎn)甲基化OGT，通過促進(jìn)USP9X的結(jié)合來穩(wěn)定OGT。這導(dǎo)致了糖酵解的增加和c-Myc的上調(diào)，從而在體外和體內(nèi)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖。CARM1介導(dǎo)的OGT甲基化是NSCLC進(jìn)展所必需的，去除這種修飾可能為NSCLC的治療提供一種新策略。

質(zhì)譜分析、real-time PCR、Western blotting、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、體外甲基化測定、CCK8、克隆形成試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、細(xì)胞共培養(yǎng)、裸鼠皮下注射模型、免疫組化染色、免疫組化分析

Lin L, Yuan Q, Gu J, Bai G, Cong X, Hu Q, Hou J, Jin X, Liu X, Huang B, Zhang Y, Lu J. CARM1-mediated OGT arginine methylation promotes non-small cell lung cancer glycolysis by stabilizing OGT. Cell Death Dis. 2024 Dec 23;15(12):927. doi: 10.1038/s41419-024-07313-1