三陰性乳腺癌的治療新思路：PEAK1與CAMK2的信號調控與藥物干預

         PEAK假激酶家族，包括PEAK-1-3，在幾種預后不良的人類癌癥中發(fā)揮致癌作用，包括三陰性乳腺癌（TNBC）。然而，由于假激酶缺乏催化活性，治療靶向是具有挑戰(zhàn)性的。為了解決這個問題，我們篩選了PEAK1效應物，并鑒定了鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶2（CAMK2）D和CAMK2G。PEAK1通過PLC-γ- 1/Ca2+信號傳導和直接結合CAMK2促進TNBC細胞中CAMK2的激活。反過來，CAMK2磷酸化PEAK1以增強與PEAK2的關聯(lián)，這對PEAK1的致癌信號傳導至關重要。為了實現(xiàn)PEAK1/CAMK2的藥理學靶向，我們重新使用了第二代CAMK2抑制劑RA306。RA306抑制PEAK1增強的TNBC細胞在體外的遷移和侵襲，并顯著減弱TNBC異種移植物的生長和轉移，其方式與PEAK1消融相一致?？偟膩碚f，這些研究確定了PEAK1是一個關鍵的細胞信號傳導紐帶，整合Ca2+和酪氨酸激酶信號，并確定CAMK2是PEAK1下游的治療“可操作”靶標。

機制示意圖：

主要研究結果：

1. 用BiCAP表征PEAK1和PEAK2二聚體特異性相互作用組

         為了表征PEAK1和PEAK2同型二聚體的相互作用組，以及PEAK1/PEAK2異源二聚體，我們應用了雙分子互補親和純化結合串聯(lián)質譜（BiCAP-MS/MS）。特異性二聚體復合物被親和純化，并通過LC-MS/MS以數(shù)據(jù)獨立的獲取模式鑒定相關蛋白（圖1A-C）。Grb2是一種特性良好的PEAK1結合了PEAK1同型二聚體和PEAK1/PEAK2異源二聚體，但不結合PEAK2同型二聚體，這與我們之前的結果一致，PEAK1將Grb2與PEAK216連接起來。兩個蛋白磷酸酶1 （PP1）家族成員PPP1CA和PPP1CC先前在傳統(tǒng)的基于免疫親和力的MS/MS篩選中被鑒定為PEAK1相互作用物。然而，它們對PEAK1和PEAK2的選擇性尚不清楚。在這里，與Grb2一樣，它們被鑒定為PEAK1同型二聚體和PEAK1/PEAK2異源二聚體的相互作用物，PP1家族的另一個成員PPP1CB與PEAK1同型二聚體相關。最近的一篇論文報道了14-3-3蛋白在調節(jié)PEAK3效應募集和生物活性方面的關鍵調控作用，多個14-3-3亞型結合了同型二聚體和異源二聚體。進一步鑒定的相互作用物包括RAC1鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF） FARP1和MAPK途徑拮抗劑SPRY4，它們對PEAK2同型二聚體具有選擇性。此外，Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶2 （CAMK2）D和G與PEAK1和PEAK2同型二聚體以及PEAK1/PEAK2異源二聚體相關，而CAMK2B則被PEAK2同型二聚體和PEAK1/PEAK2異源二聚體募集（圖1A-C）。對每個PEAK復合物的相互作用組進行生物信息學分析，以確定富集的途徑/過程，確定了包括CAMK2酶在內的鈣相關途徑被富集（特別是PEAK1和PEAK2同型復合物的“突觸后信號傳導”，以及所有3種復合物的“肌層”和“心臟信號傳導”）。

         總的來說，這些數(shù)據(jù)為PEAK1/2復合物的結合選擇性提供了重要的見解，并確定了特定的CAMK2家族成員作為這些假激酶支架的相互作用物。

2. CAMK2與PEAK1和PEAK2相互作用的表征

         為了確認特定CAMK2家族成員與PEAK1和PEAK2的關聯(lián)，我們將重點放在CAMK2D和CAMK2G上，因為這些激酶與BiCAP-MS/MS分析的所有同型和異型PEAK復合物相關。這些CAMK2s與內源性PEAK1和PEAK2的相互作用在MDA-MB-231乳腺癌細胞中通過近端結扎試驗進行了研究（圖1D-F）。使用這種技術，可以檢測到PEAK1與CAMK2D或G之間的相互作用，并且當使用siRNA敲除PEAK1時，PEAK1與CAMK2D或G之間的相互作用顯著減少（圖1D-E）。PEAK2與CAMK2D或G之間的相互作用也觀察到類似的結果（圖1D-F）。這些數(shù)據(jù)表明，在體內，CAMK2D和G在內源性表達水平上與PEAK1和PEAK2相互作用。

圖1 通過BiCAP-MS/MS鑒定特定CAMK2亞型為peak - 1/2相互作用物

3. PEAK1對CAMK2活性的調控

         已知的PEAK1在乳腺癌中的過表達，使我們質疑PEAK1/CAMK2相互作用的功能后果。隨著細胞內Ca2+的增加，Ca2+/calmodulin （CaM）與CAMK2調控片段的結合導致調控片段從激酶結構域釋放、激酶激活和T286的磷酸化（CAMK2D和G中的T287）。在T286磷酸化存在的情況下，CAMK2調控片段不能再介導自抑制，CAMK2的活性是Ca2+/CaM自主的。在MDA-MB-231 TNBC細胞中，PEAK1的敲低不影響CAMK2D和G的表達水平，但顯著降低了它們的激活，這是通過T287位點的磷酸化確定的（圖2A，B）。此外，這些細胞中PEAK1的過表達顯著增強了這兩種CAMK2亞型的激活（圖2C，D）。在MDA-MB-468 TNBC細胞中，也觀察到PEAK1對CAMK2D/G活性的正向調節(jié)（補充圖2）。一種膜透性Ca2+螯合劑阻斷Ca2+對CaM的激活，顯著降低了CAMK2 T287的基礎磷酸化，并完全阻斷了PEAK1對CAMK2激活的作用，表明PEAK1介導的CAMK2激活依賴于Ca2+（圖2E，F）。

         根據(jù)這一結果，我們確定PEAK1是否可以調節(jié)Ca2+水平，從而間接調節(jié)CAMK2的激活。Fluo-4成像的應用顯示，在穩(wěn)態(tài)下，PEAK1過表達顯著增強了細胞內Ca2+水平（圖2G，H）。關于PEAK1調節(jié)Ca2+信號傳導的機制，已知的峰作為特定酪氨酸激酶的調節(jié)劑和/或底物的作用，使我們確定PEAK1過表達是否影響酪氨酸磷酸化，從而激活PLC- γ1。導致IP3的產生，從而觸發(fā)細胞內儲存的Ca2+釋放。事實上，PEAK1敲低降低了PLCγ-1 Y783的酪氨酸磷酸化（圖2I），而PEAK1過表達增強了該位點的PLCγ-1酪氨酸磷酸化（圖2J）。然而，鑒于PEAK1是一種假激酶，PLC γ-1的磷酸化必須由PEAK1下游的真正酪氨酸激酶介導。由于PEAK1是TNBC27中一個突出的Src家族激酶（SFK）信號網絡的成員，而PLCγ1是SFKs28的已知底物，我們假設SFK可能介導了這一作用。為了支持這一假設，用高選擇性SFK抑制劑eCF50629處理MDA-MB-231 TNBC細胞阻斷了peak1增強的PLC-γ-1酪氨酸磷酸化。然而，對BiCAP數(shù)據(jù)集的查詢沒有揭示特異性SFK或PLC-γ-1與任何PEAK復合物的關聯(lián)，強烈表明調節(jié)機制不涉及直接結合。

圖2 PEAK1介導的CAMK2活性在三陰性乳腺癌細胞中的調節(jié)

4. PEAK1/2與CAMK2相互作用的結構要求

         為了確定PEAK1和PEAK2的哪些區(qū)域介導了與CAMK2D和G的相互作用，我們利用了先前描述的PEAK1和PEAK216的缺失突變體，這些突變體刪除了n端區(qū)域（ΔN-term）， N1 α-螺旋（ΔN1）以及假激酶結構域和螺旋J-M的組合（ΔCterm），以及僅包含極端n端區(qū)域（1-324個氨基酸）的突變體（n項）（圖3A）。在WT、ΔN1和ΔCterm PEAK1中，可以證明flag標記的PEAK1與內源性CAMK2D共免疫沉淀，但在ΔNterm PEAK1突變體中則沒有（圖3B）。然而，單獨的Nterm區(qū)域沒有與CAMK2D關聯(lián)，這表明它是與這些CAMK2s相互作用所必需的，但不是充分的（圖3B）。此外，由于N1和Cterm區(qū)域是PEAK1與PEAK216進行同型結合和異型相互作用所必需的，這些數(shù)據(jù)還表明，PEAK1與這些CAMK2s結合不需要二聚化。接下來，我們生成了一系列缺失突變體，以更窄地定義PEAK1上的CAMK2結合區(qū)（圖3C）。與CAMK2D的關聯(lián)在Δ261-324突變體中丟失（圖3D）。此外，刪除跨越261-300或301-324氨基酸的較小區(qū)域也會消除CAMK2D關聯(lián)（圖3D）。氨基酸301-324的缺失也顯著降低了CAMK2G的關聯(lián)（圖3E）。

圖3 繪制CAMK2在PEAK1上的結合區(qū)

         盡管PEAK1和PEAK2具有相似的整體結構域結構，但n端擴展，包括CAMK2結合所需的PEAK1區(qū)域（氨基酸261-324），保守性較差，表明PEAK2的CAMK2結合機制可能不同。與這一假設相一致的是，雖然PEAK2 ΔNterm突變體顯著降低了CAMK2D與PEAK2的關聯(lián)，但在ΔN1和ΔCterm突變體中觀察到的影響最大，它們分別顯著且?guī)缀跬耆诉@種關聯(lián)。由于N1和Cterm區(qū)域是PEAK2進行同型和異型結合所必需的，這些數(shù)據(jù)表明PEAK2與這些CAMK2s的相互作用需要PEAK2二聚化。為了支持這一模型，PEAK2中的三個點突變消除了二聚化，都導致與CAMK2D的關聯(lián)減弱。這與PEAK1形成對比，在PEAK1中，二聚化受損的ΔN1和ΔCterm突變體保留了與CAMK2s的關聯(lián)。此外，PEAK1敲低并沒有破壞PEAK2與CAMK2D的關聯(lián)，這表明PEAK2與CAMK2D的相互作用不是通過PEAK1介導的，這與BiCAP的數(shù)據(jù)一致（圖1B）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)突出了PEAK1和PEAK2與CAMK2關聯(lián)的不同結構要求，在PEAK1的情況下，來自離散n端區(qū)域的貢獻更大，而在PEAK2的情況下，則需要二聚化。

圖4 PEAK1中保守CAMK2相互作用基序（CIM）的特征

5. PEAK1通過保守基序直接結合CAMK2，促進CAMK2活化和PEAK1磷酸化

         由于PEAK1 Δ301-324突變體缺乏CAMK2關聯(lián)（圖3D，E），我們確定了該突變體對CAMK2激活的影響。有趣的是，該突變體激活CAMK2D/G的能力明顯受損，這是通過T287位點的磷酸化來確定的（圖3F，G），這表明peak1介導的CAMK2激活除了需要Ca2+信號外，還需要兩種蛋白的結合（圖2E，F）。

         最近的一份報告描述了CAMK2如何通過結合伙伴R/K-X-X-h-x-R/K-X-X- s /T-h中的保守序列基序與底物結合伙伴相互作用（其中，h代表疏水殘基），該基序結合在CAMK2激酶域上的單個連續(xù)位點上。它還揭示了保守的CAMK2相互作用基序（CIM）的結合與激酶結構域調控段對CAMK2的自抑制相競爭，這解釋了某些底物（如GluN2B）將CAMK2鎖定在活性構象中的能力。值得注意的是，Rac GDP/GTP交換因子TIAM1顯示出保守基序的假底物版本（帶有a而不是S/T），但仍然能夠結合并促進其在其他位點上的磷酸化。為了確定PEAK1是否可能通過這種機制與CAMK2相互作用，我們在PEAK1的n端區(qū)域搜索保守基序。我們首先構建了跨不同物種的多序列比對，隨后對其進行MEME分析以確定保守的基序。該分析表明，PEAK1氨基酸297-307與典型結合基序非常相似，但在0位（氨基酸306）有一個丙氨酸，與TIAM1觀察到的結果一致（圖4A）。

         氨基酸297-307之間存在CIM，這與261-300和301-324氨基酸缺失導致的結合中斷（圖3D， E）以及Δ301-324突變體未能激活CAMK2（圖3F，G）一致。為了確定是否有與PEAK1 CIM結合CAMK2對應的合成肽，我們采用了等溫量熱法。這些數(shù)據(jù)顯示了一個高親和力的相互作用，平均解離常數(shù)（KD）為635 nM（圖4B），與TIAM1相互作用區(qū)域（1.1 μM）相當。使用AlphaFold對PEAK1/CAMK2相互作用進行建模預測（pLDDT 90.7，pTM 0.899）， PEAK1 CIM與其他已知的相互作用因子一樣，在CAMK2激酶結構域的相同表面上相互作用，PEAK1 R303（-3位置）和R297（-9）之間形成了關鍵的鹽橋，與CAMK2中的谷氨酸殘基（圖4C-F）。此外，L301被容納在CAMK2的疏水囊中（圖4E）。我們還注意到PEAK1 D308、D310、D311和D314在CAMK2表面上預測形成的鹽橋和靜電相互作用（圖4F）。值得注意的是，雖然該建模是對CAMK2A進行的，但結合位點在所有CAMK2亞型中都是保守的。

圖5 PEAK1 CIM在CAMK2激活中的作用

         為了測試PEAK1 CIM中關鍵殘基對CAMK2激活的重要性，我們生成了R303（-3），L301（-5）和R297（-9）位置（稱為AAA）的丙氨酸替換和R303和R297（EE）的谷氨酸替換的PEAK1突變體。EE突變體的過表達顯著增強了細胞內Ca2+水平（圖5A，B），兩個突變體都顯著增加了plc γ - 1酪氨酸磷酸化（圖5C，D）。然而，兩個突變體都失去了激活CAMK2的能力，這是通過T287磷酸化確定的（圖5E-G）。這些數(shù)據(jù)表明，雖然PEAK1激活CAMK2的能力是鈣依賴性的（圖2E，F），但PEAK1增強的Ca2+不足以增加CAMK2 T287磷酸化，并且還需要與CAMK2直接關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)也支持了Alphafold模型的有效性。

         CAMK2與TIAM1結合導致TIAM131的持續(xù)磷酸化。為了確定PEAK1是否是CAMK2的底物，我們使用了RA306，這是一種由賽諾菲開發(fā)的用于慢性心血管適應癥的“新一代”CAMK2抑制劑，它對CAMK2D和G的選擇性優(yōu)于其他亞型。RA306在MDA-MB-231細胞中表現(xiàn)出對CAMK2的“靶向”活性（補充圖7A），并顯著抑制PEAK1絲氨酸/蘇氨酸磷酸化（圖6A，B）。此外，重組CAMK2在體外顯示出對PEAK1的激酶活性，這可以用pAkt底物抗體檢測到，該抗體也能識別CAMK2最小的磷酸化基元（RXXS/T）或pSer/Thr抗體（圖6C）。有趣的是，當使用PEAK1 AAA和EE CIM突變體作為底物時，PEAK1的磷酸化顯著降低，這表明CAMK2有效磷酸化PEAK1需要兩種蛋白通過PEAK1 CIM相互作用（圖6C）。

圖6 CAMK2磷酸化PEAK1調控PEAK1相互作用組

6. CAMK2磷酸化PEAK1調控PEAK1相互作用組

         為了表征CAMK2介導的磷酸化對PEAK1支架電位的影響，我們在體內比較了野生型（WT） PEAK1與AAA和EE CIM突變體的相互作用組。我們之所以采用這種方法，是因為它更有選擇性地解決了CAMK2介導的PEAK1磷酸化的影響，而RA306治療將對CAMK2介導的細胞磷酸化產生更普遍的抑制。適配器Crk-L和Grb2分別通過SH3和SH2結構域介導的相互作用與PEAK1結合。由于14-3-3與客戶蛋白的結合典型地依賴于磷酸化，這表明CIM突變體損傷CAMK2激活導致PEAK1在14-3-3結合位點的磷酸化降低。接下來，我們分析了PEAK1與PEAK2的異型關聯(lián)，這是信號輸出的關鍵決定因素，PEAK1促進細胞遷移和致癌信號傳遞需要與PEAK2結合。重要的是，盡管在MDA-MB-231 TNBC細胞中可以很容易地檢測到野生型PEAK1與PEAK2的異型關聯(lián)，但在CIM突變體中這種異型關聯(lián)明顯降低（圖6D）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，CAMK2介導的PEAK1磷酸化是PEAK1介導的蛋白-蛋白相互作用和信號傳導的關鍵調節(jié)因子。

7. PEAK1/CAMK2信號是TNBC的治療“可操作”靶點

         CAMK2和PEAK1相互調節(jié)的發(fā)現(xiàn)使我們質疑這些蛋白的表達如何與乳腺癌患者的生存相關。有趣的是，PEAK1和CAMK2D的高表達與較差的總生存率顯著相關，而PEAK1/CAMK2G的高表達則沒有明顯的趨勢。為了進一步了解PEAK1和CAMK2/G在乳腺癌中的聯(lián)合作用，我們研究了它們與遠端無轉移生存（DMFS）的關系。然而，這只能通過來自某些公開可用數(shù)據(jù)集的薈萃隊列（見方法）和PEAK1/CAMK2G組合來實現(xiàn)。接下來，我們描述了PEAK1/CAMK2信號傳導對TNBC細胞生物學終點的影響。之前我們報道過，在MDA-MB-231細胞中，CRISPR介導的PEAK1 KO顯著降低了低附著板中錨定依賴性增殖和腫瘤球形成。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明PEAK1和CAMK2都有助于TNBC中的增殖信號傳導。

         接下來，我們探討了PEAK1/CAMK2在細胞遷移/侵襲中的作用。CAMK2D或G的敲低均阻斷了PEAK1過表達對細胞遷移和侵襲的影響（圖7A、B）， RA306處理阻斷了PEAK1在MDA-MB-231和-468細胞中促進的遷移（圖7C）和PEAK1在MDA-MB-231細胞中促進的侵襲。此外，Δ301-324 PEAK1突變體不能結合或激活CAMK2（圖3D-G），也不能增強TNBC細胞的遷移和侵襲（圖7D）。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，在調節(jié)PEAK1的細胞遷移和侵襲過程中，需要CAMK2的表達和/或激活，以及PEAK1/CAMK2的結合。

圖7 CAMK2在PEAK1調控的TNBC生物學中的作用

         然后，我們在TNBC腫瘤生長和轉移的體內模型中評估了RA306。先前，我們證明PEAK1基因敲除可顯著抑制原位MDA-MB-231 TNBC異種移植物的生長和肺轉移。為了檢測RA306，我們使用了該細胞系的高轉移變體MDA-MB-231-HM33，因此我們可以很容易地檢測原發(fā)腫瘤的轉移擴散。此外，我們通過CRISPR編輯生成PEAK1缺失的MDA-MB-231-HM細胞，比較RA306與PEAK1敲除的效果以及這兩種操作的聯(lián)合效果。在異種移植物中可以檢測到RA306的靶向活性，PEAK1消融也降低了CAMK2的激活。RA306治療顯著損害了原發(fā)腫瘤的生長（圖7E）。重要的是，生長抑制程度與PEAK1基因敲除后觀察到的相似，并且將RA306與基因敲除結合并沒有進一步增強這種抑制程度，這強烈表明RA306治療和PEAK1敲除針對相同的致癌信號軸（圖7E）。此外，我們還允許一個單獨的原發(fā)性腫瘤隊列生長到相同的平均大小，切除它們，然后監(jiān)測轉移。引人注目的是，RA306阻斷轉移的程度與PEAK1敲除相似（圖7F）。由于PEAK1 KO或RA306治療影響細胞增殖、遷移和侵襲，但不影響細胞凋亡（圖7），因此對原發(fā)腫瘤生長的影響可能是通過減少增殖介導的，而轉移性生長的減少必須與原發(fā)腫瘤大小無關，反映了轉移到肺部的能力下降和/或在繼發(fā)部位的增殖減少?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)確定RA306是針對TNBC和潛在的其他人類癌癥的PEAK1/CAMK2軸的潛在治療策略。

結論

         本研究通過確定致癌假激酶PEAK1作為CAMK2的前饋激活劑和第二代CAMK2D/G抑制劑RA306作為阻斷TNBC和其他PEAK1參與的癌癥（如胰腺癌）的PEAK1/CAMK2信號傳導的合適靶向藥物來解決這些問題。重要的是，RA306避免了中樞神經系統(tǒng)的副作用，并表現(xiàn)出良好的口服生物利用度，突出了其腫瘤再利用的潛力。此外，相互激活的PEAK1/CAMK2復合體的鑒定表明，這兩種蛋白可以作為預測性生物標志物，指導患者分層進行抗CAMK2治療?？偟膩碚f，我們的工作確定了激酶超家族之間意想不到的相互作用，這對我們理解正常和疾病狀態(tài)下的細胞信號傳導以及PEAK1和CAMK2的精確靶向具有重要意義。

參考文獻：

         Yang, X., Ma, X., Zhao, T. et al. Activation of CAMK2 by pseudokinase PEAK1 represents a targetable pathway in triple negative breast cancer. Nat Commun 16, 1871 (2025).

實驗方法：

         細胞系和組織培養(yǎng)、細胞裂解、免疫沉淀和免疫印跡、PEAK1敲除細胞的產生、轉染、BiCAP純化、基于質譜的蛋白質組學分析、蛋白質表達和純化、肽合成、等溫滴定量熱法、PEAK1（291-320）的比較建模：CAMK2、PEAK1 n端跨物種多序列比對、接近結扎試驗（PLA）、鈣含量測定、增殖試驗、Transwell遷移/侵襲試驗、體外激酶測定，腫瘤組織均質。