工程化間充質(zhì)干細胞激活血管生成素-1 信號促進糖尿病傷口愈合中的血管生成

         血管功能不全與糖尿病足潰瘍（DFU）的發(fā)病機制和治療效果有關(guān)。雖然間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有治療糖尿病足潰瘍的潛力，但進一步增強促進糖尿病足潰瘍傷口血管生成的能力勢在必行。本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病傷口愈合的整個過程中，血管生成素-1（ANG1）的表達始終處于受損狀態(tài)。工程化 MSC（MSCANG1）在80%的細胞中表現(xiàn)出強大的綠色熒光蛋白（EGFP）表達，并過表達和分泌ANG1蛋白。MSCANG1顯著提高內(nèi)皮細胞的存活率和小管生成能力，促進功能性血管的建立，改善血管滲漏。在 MSCANG1處理的糖尿病傷口中，蛋白激酶 B（Akt）通路的激活和原癌基因酪氨酸激酶 Src（Src）活性的抑制證實了高效的血管生成過程。MSCANG1處理的糖尿病傷口與間充質(zhì)干細胞處理的傷口相比，表皮和真皮重建以及皮膚附屬物再生的速度明顯加快。單純使用間充質(zhì)干細胞治療可促進血管生成和DFU愈合，而使用ANG1對間充質(zhì)干細胞進行工程改造可為這一治療過程帶來實質(zhì)性的額外益處。含有 ANG1 的間充質(zhì)干細胞工程為開發(fā)治療 DFU 的創(chuàng)新策略提供了一條前景廣闊的途徑。該研究于2025年2月發(fā)表在《Stem Cell Research & Therapy》，IF：7.1。

技術(shù)路線： 

1. 糖尿病傷口愈合過程中的血管生成和 ANG1 水平降低

         與正常小鼠相比，糖尿病小鼠的傷口愈合速度明顯較慢，從相同的初始傷口面積開始，在損傷后 7 天、14 天和 21 天觀察到的傷口面積較大就是證明（圖 1A 和 B）。與血管生成在 DFU 的發(fā)展和結(jié)局中起關(guān)鍵作用的認識一致，在損傷后 14 天和 28 天，與正常傷口相比，糖尿病傷口再生組織中含有 CD34 陽性造血細胞和內(nèi)皮細胞的血管樣結(jié)構(gòu)明顯較少（圖 1C 和 D）。這些觀察結(jié)果表明，與正常傷口相比，糖尿病傷口的血管生成不足，愈合延遲。

         研究人員檢測了正常和糖尿病傷口愈合過程中促血管生成因子和抗血管生成因子的時間表達，以確定構(gòu)建工程化MSC的合適候選因子。與糖尿病傷口愈合過程中血管生成減少的現(xiàn)象相一致的是，成纖維細胞生長因子 2（FGF2）、ANG1、表皮生長因子（EGF）等促血管生成因子的表達水平普遍呈下降趨勢、 和轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1）等促血管生成因子的表達水平降低，而芽胞 RTK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑 2（SPRY2）、凝血酶原蛋白 1（TSP1）、kisspeptin-1（KISS1）和 IV 型膠原 a1 鏈（COL4A1）等抗血管生成因子的表達水平同時升高。這些血管生成因子在糖尿病傷口愈合中的相互作用非常復(fù)雜，因為與正常愈合相比，一些促血管生成因子如基質(zhì)金屬肽酶 9（MMP9）被上調(diào)，而抗血管生成因子如基質(zhì)金屬蛋白酶 1 的組織抑制劑（TIMP1）和血小板因子 4（PF4）在糖尿病傷口愈合的后期被下調(diào)（圖 1E）。鑒于血管生成過程中促血管生成因子和抗血管生成因子之間錯綜復(fù)雜的相互作用，這些因子的表達水平在整個愈合過程中顯示出動態(tài)和不同的變化。值得注意的是，在整個糖尿病傷口愈合過程中，促血管生成因子ANG1的表達持續(xù)減少（圖1E），這表明ANG1可能是促進血管生成不足的關(guān)鍵治療靶點，是構(gòu)建用于糖尿病傷口愈合的工程化MSC的最佳候選者。

圖1. 糖尿病傷口愈合過程中 ANG1 信號傳導(dǎo)和血管生成受阻

2. 構(gòu)建穩(wěn)定表達 ANG1 的可追蹤間充質(zhì)干細胞

         設(shè)計并構(gòu)建一種慢病毒質(zhì)粒，其中含有通過 t2A 連接子連接的 ANG1 和 GFP 基因（圖 2A），并對慢病毒感染的間充質(zhì)干細胞（MSCANG1）進行這兩種外源蛋白穩(wěn)定表達的評估。GFP 免疫染色表明，MSCANG1 的 GFP 熒光水平與感染了 GFP 慢病毒（MSCGFP）的間充質(zhì)細胞相當（圖 2B 和 C）。在 MSCANG1 和 MSCGFP 群體中，表達 GFP 的細胞平均比例約為 80%（圖 2B 和 C），這表明工程化MSC能強有力地表達外源基因，適合進行后續(xù)實驗。WB 分析顯示，與 MSCGFP 細胞相比，MSCANG1 細胞裂解物和 條件培養(yǎng)基（CM） 中 ANG1 的表達水平大幅提高（圖 2F），證實了血管生成因子 ANG1 的成功表達和分泌。工程MSCs 的CM中 ANG1 的含量呈時間性增加，進一步證實 ANG1 蛋白是從 MSCANG1 細胞中釋放出來并逐漸在 CM 中積累（圖 2G）。

         隨后研究了ANG1對糖尿病傷口移植工程化MSC存活的影響。通過使用 GFP 免疫染色追蹤移植細胞觀察到 MSCANG1 在移植到糖尿病傷口 7 天后表現(xiàn)出與 MSCGFP 細胞相似的存活模式（圖 2D 和 E）。這表明間充質(zhì)干細胞中 ANG1 的產(chǎn)生不會影響間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)存活。

圖2. 構(gòu)建穩(wěn)定表達 ANG1（MSCANG1）的工程化MSC并確定其特征

3. MSCANG1 促進 HUVEC 的存活、腎小管生成和 akt 激活

         考慮到間充質(zhì)干細胞主要通過旁分泌機制發(fā)揮治療作用，作者用工程化MSC的CM處理HUVEC，評估MSCANG1對內(nèi)皮細胞的影響。與對照組相比，用 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 的細胞數(shù)明顯增加（圖 3A），Annexin V 和 PI 陽性的凋亡細胞減少（圖 3B 和 C），這表明 MSCGFP 對 HUVEC 的存活有適度的保護作用。此外，與 MSCGFP-CM 相比，MSCANG1-CM 進一步提高HUVECs 的存活率，強調(diào)了 ANG1 和間充質(zhì)干細胞對內(nèi)皮細胞存活的協(xié)同作用（圖 3A-C）。這種效應(yīng)通過鈣黃綠素-AM和PI染色得到證實。與 Ctrl 或 MSCGFP-CM 處理的 HUVECs 相比，MSCANG1-CM 處理的 HUVECs 表現(xiàn)出明顯更多的鈣素-AM 染色活細胞和更少的 PI 染色死細胞（圖 3D-F）。ANG1 蛋白的應(yīng)用對 HUVECs 的存活產(chǎn)生類似的保護作用（圖 S2），進一步突出 ANG1 的保護作用。內(nèi)皮細胞具有在體外形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)的能力，這反映了它們在體內(nèi)的血管生成潛能。同樣，用 MSCGFP-CM 處理可增強 HUVECs 中毛細血管樣結(jié)構(gòu)的形成，而用 MSCANG1-CM 處理可進一步顯著增強這種效應(yīng)（圖 3G 和 H）。

         Akt 通路與內(nèi)皮細胞的存活和血管生成能力密切相關(guān)。通過 WB 分析觀察到與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 相比，MSCANG1-CM 處理的 HUVEC 中內(nèi)皮細胞上 ANG1 的特異性受體 Tie2 的磷酸化和活化增加（圖 3I 和 J）。此外，在 MSCANG1-CM 處理的 HUVEC 中觀察到 Akt 磷酸化水平升高，這證明 MSCANG1 通過 Tie2 顯著增強 Akt 的活化（圖 3I 和 J）。值得注意的是，用 MSCGFP-CM 處理的 HUVEC 也表現(xiàn)出 Tie2 和 Akt 蛋白的輕微活化，這與 MSCGFP-CM 適度改善內(nèi)皮細胞存活和血管生成能力的觀察結(jié)果一致。

圖3. MSCANG1促進 HUVECs 的存活、腎小管生成和 Akt 活化

4. MSCANG1 促進 HUVEC 的功能成熟

         ANG1在血管生成過程中對血管穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整性起著關(guān)鍵作用。為評估工程化MSC對內(nèi)皮細胞完整性的影響，用工程化MSC的CM培養(yǎng)HUVECs，并通過量化穿透細胞的熒光染料Dextran-FITC來評估HUVECs單層的通透性（圖4A）。值得注意的是，與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 培養(yǎng)的 HUVECs 相比，與 MSCANG1-CM 培養(yǎng)的 HUVECs 的 Dextran-FITC 穿透性明顯降低（圖 4B），這表明 ANG1 能有效減少內(nèi)皮屏障滲漏，從而促進血管完整性。

         VE-Cadherin是內(nèi)皮細胞間粘附連接的關(guān)鍵成分，負責(zé)鈣依賴性細胞粘附，在維持血管完整性方面起著關(guān)鍵作用。觀察結(jié)果表明，與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理的 HUVECs 相比，MSCANG1-CM 培養(yǎng)后 HUVECs 細胞邊界的 VE-cadherin 表達上調(diào)（圖 4C 和 D）。WB 分析還表明，在這些經(jīng) MSCANG-CM 處理的 HUVEC 中，VE-cadherin 的表達明顯增加（圖 4E 和 F）。此外，Src的磷酸化與細胞連接處 VE-cadherin穩(wěn)定性降低有關(guān)。與 Ctrl 和 MSCGFP-CM 處理相比，MSCANG1-CM 處理導(dǎo)致 HUVECs 中磷酸化 Src 水平降低（圖 4E 和 F）。

         先前的研究結(jié)果表明，naive 間充質(zhì)干細胞具有一定的血管生成潛能，與此相一致，MSCGFP-CM 處理也適度改善 HUVECs 的通透性、增加 VE-cadherin表達并降低了 Src 磷酸化（圖 4A-F）?？傊?，間充質(zhì)干細胞中外源性 ANG1 的表達可通過促進內(nèi)皮細胞的功能性成熟進一步提高其血管生成能力。

圖4. MSCANG1促進血管粘連蛋白的表達和血管完整性，并抑制 Src的激活

5. MSCANG1 移植促進糖尿病傷口愈合中的血管生成

         移植各種工程化MSC 14天后，通過檢測血管的存在和成熟情況，評估糖尿病傷口愈合過程中的血管生成情況。CD34和α-SMA（一種周細胞標記物）的雙重免疫染色顯示，與對照組和移植MSCGFP的傷口組織相比，移植MSCANG1的傷口組織內(nèi)層的CD34+細胞和外層的α-SMA+細胞的血管樣結(jié)構(gòu)明顯增加（圖5A和B）。WB 分析進一步證實，在 MSCANG1 移植的糖尿病傷口再生組織中，CD34 表達升高（圖 5C 和 D）。

         傷口愈合過程中涉及的多種分子信號通路最終都匯聚到 Akt 的激活上，在糖尿病傷口愈合中普遍觀察到 Akt 激活受損。在本研究中，WB 分析顯示，在 MSCANG1 移植的糖尿病傷口中，Tie2 受體和下游 Akt 通路顯著磷酸化（圖 5E 和 F），表明 ANG1/Tie2/Akt 通路的激活是 MSCANG1 促進糖尿病傷口愈合的血管生成機制的基礎(chǔ)。

         為評估再生傷口組織中血管的完整性和成熟度，研究人員檢測了內(nèi)皮間連接蛋白 VE-Cadherin 的表達。CD34 和 VE-Cadherin 免疫染色顯示，與對照組和 MSCGFP 處理的傷口相比，MSCANG1 處理的傷口顯示出更多的 CD34 和 VE-Cadherin 陽性血管樣結(jié)構(gòu)（圖 6A 和 B）。WB 分析進一步驗證了 MSCANG1 處理的傷口中 VE-Cadherin 表達的升高（圖 6C 和 D）。此外，WB 分析顯示，與對照組和 MSCGFP 處理的傷口相比，MSCANG1 處理的傷口中 Src 表達減少（圖 6C 和 D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSCANG1 能有效抑制 Src 活性，從而促進其下游效應(yīng)物 VE-Cadherin 的表達。

         綜上所述，這些結(jié)果表明，MSCANG1 可通過與 Tie2 受體結(jié)合，顯著激活 Akt 通路并抑制 Src 活性，從而在糖尿病傷口愈合過程中促進血管生成并改善血管完整性。

圖5. MSCANG1促進血管生成并激活糖尿病傷口愈合中的 Tie2/Akt 通路

圖6. MSCANG1促進糖尿病傷口愈合中 VE-Cadherin 的表達并抑制 Src 的激活

6. MSCANG1 植入加速糖尿病傷口愈合

         作者接著研究 MSCANG1 接種是否能促進糖尿病傷口愈合的過程。與觀察到的 MSCANG1 促進傷口組織血管生成的情況一致，在移植后 7、14 和 21 天，與對照組或 MSCGFP 相比，移植 MSCANG1 的傷口面積明顯較?。▓D 7A 和 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，工程化的 MSCANG1 能明顯加快傷口愈合。

         上皮恢復(fù)對重建傷口屏障至關(guān)重要，這是傷口愈合過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。利用血色素和伊紅（HE）染色以及上皮標記物 K14 的免疫染色觀察到，與對照組和 MSCGFP 移植的傷口相比，移植 MSCANG1 的糖尿病傷口在移植后 14 天顯示出最窄的上皮間隙（EG）（圖 7C、D 和 F）。移植后第 28 天，所有傷口都被上皮覆蓋，與對照組相比，移植 MSCGFP 和 MSCANG1 的傷口真皮厚度（THK）顯著增加（圖 7C、D 和 G）。值得注意的是，接種 MSCGFP 和 MSCANG1 的傷口真皮厚度沒有明顯差異（圖 7C 和 G），這表明 MSCANG1 處理不會誘導(dǎo)真皮成纖維細胞過度增殖。

         血管生成在皮膚附屬物的功能再生中起著關(guān)鍵作用。通過對再生毛囊的標記物 K14 和 K17 進行雙重免疫染色觀察到，在 MSCANG1 移植后 14 天和 28 天，糖尿病傷口過渡區(qū)的 K14 和 K17 定位于毛囊（圖 7E 和 H）?？傊?，這些研究結(jié)果表明，MSCANG1 可通過促進表皮和真皮重建以及促進皮膚附屬物再生來加速糖尿病傷口愈合。

圖7. MSCANG1治療促進糖尿病傷口愈合過程

結(jié)論

         綜上所述，本研究表明，在糖尿病傷口愈合過程中，ANG1明顯缺乏。MSCANG1 對內(nèi)皮細胞的存活、遷移和功能性緊密連接的形成有顯著影響。此外， MSCANG1 促進血管生成，其間Akt 的激活和 Src 活性的抑制起著關(guān)鍵作用。間充質(zhì)干細胞與 ANG1 的工程設(shè)計為治療結(jié)果提供實質(zhì)性的協(xié)同優(yōu)勢，并為開發(fā)治療 DFU 的創(chuàng)新策略提供一條前景廣闊的途徑。

實驗方法

         細胞培養(yǎng)，細胞轉(zhuǎn)染，細胞活力評估，管形成實驗，體外滲透性試驗，正常和糖尿病創(chuàng)面模型的制備，動物處理和傷口面積評估，免疫組化，qRT-PCR，Western blot

參考文獻

         Deng Q, Du F, Pan S, Xia Y, Zhu Y, Zhang J, Li C, Yu S. Activation of angiopoietin-1 signaling with engineering mesenchymal stem cells promoted efficient angiogenesis in diabetic wound healing. Stem Cell Res Ther. 2025 Feb 21;16(1):75. doi: 10.1186/s13287-025-04207-7. PMID: 39985096; PMCID: PMC11846275.