ELK3-CYFIP2軸介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重塑調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移和自然殺傷細(xì)胞反應(yīng)

         三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性、高轉(zhuǎn)移性疾病，預(yù)后較差。E26轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子（ELK3）在TNBC中高度表達(dá)，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子。由于TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移遷移和免疫逃避是成功轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，因此揭示其潛在機(jī)制并開發(fā)有效的免疫治療策略迫在眉睫。本研究通過RNA測序分析和分子實(shí)驗(yàn)，確定并驗(yàn)證與TNBC細(xì)胞遷移和附著相關(guān)的ELK3下游靶基因。致癌基因ELK3直接抑制細(xì)胞質(zhì)FMR1相互作用蛋白2（CYFIP2）的表達(dá)，而CYFIP2是肌動(dòng)蛋白聚集的抑制因子。進(jìn)一步的分子和藥理學(xué)分析證實(shí)，ELK3-CYFIP2 軸在 TNBC 細(xì)胞系中具有雙重作用：（1）通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的積累控制絲狀體介導(dǎo)的遷移和粘附；（2）通過調(diào)節(jié)接觸部位的肌動(dòng)蛋白積累調(diào)節(jié)對(duì) NK 細(xì)胞的敏感性。Kaplan-Meier分析表明，ELK3-CYFIP2軸與TNBC患者的存活率有關(guān)，ELK3抑制CYFIP2的轉(zhuǎn)錄。因此，ELK3-CYFIP2軸在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白方面起著關(guān)鍵作用，強(qiáng)調(diào)了它在控制TNBC癌細(xì)胞遷移和NK細(xì)胞反應(yīng)方面的重要性。該研究于2025年2月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. ELK3 的表達(dá)與 TNBC 細(xì)胞的絲狀突起有關(guān)

         絲狀體是從細(xì)胞表面延伸出來的細(xì)長的指狀突起，在癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)此，高度轉(zhuǎn)移的 MDA-MB-231 細(xì)胞在體外表現(xiàn)出許多類似絲狀體的結(jié)構(gòu)。鑒于 ELK3-knockdown（ELK3KD）MDA-MB-231 細(xì)胞失去其轉(zhuǎn)移特性，作者質(zhì)疑 ELK3KD 細(xì)胞是否具有較少的絲狀體。為證實(shí)這一點(diǎn)，暫時(shí)恢復(fù)ELK3KD MDA-MB-231或Hs578T細(xì)胞中的ELK3表達(dá)。不出所料，用類黃嘌呤染色觀察肌動(dòng)蛋白絲時(shí)發(fā)現(xiàn)，ELK3KD 細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出更少的細(xì)胞表面突起；然而，恢復(fù) ELK3 表達(dá)后，細(xì)胞表面表現(xiàn)出更多的突起（圖 1A 左）。在另一種 TNBC 細(xì)胞系 Hs578T 細(xì)胞中也觀察到類似的模式（圖 1A 右）。圖 1A 中的定量分析表明，ELK3 表達(dá)與每個(gè) MDA-MB-231 和 Hs578T 細(xì)胞絲狀突起的數(shù)量和平均長度之間存在顯著相關(guān)性（圖 1B-C）。

2. ELK3 在 TNBC 中發(fā)揮著 CYFIP2 轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能

         絲狀結(jié)構(gòu)由 WAVE 復(fù)合物（即 WASF，又稱 WAVE）、NCKAP1、ABI 和 BRICK1（或其同源物）以及連接膜和細(xì)胞骨架的 CYFIP 組成。由于ELK3在TNBCs中起轉(zhuǎn)錄抑制作用，通過分析MDA-MB-231細(xì)胞、ELK3KD細(xì)胞和ELK3-rescued ELK3KD細(xì)胞的RNA測序數(shù)據(jù)，評(píng)估編碼各WAVE成分的基因中哪些基因與ELK3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

         雖然在ELK3KD細(xì)胞中CYFIP2和WASF3的表達(dá)受到抑制，但挽救ELK3在ELK3KD細(xì)胞中的表達(dá)并沒有顯著抑制WASF3/WAVE3的表達(dá)。這表明，ELK3可能并不像調(diào)控CYFIP2那樣直接調(diào)控WASF3/WAVE3?；谶@一點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注 CYFIP2，因?yàn)樵?span> RNA 測序數(shù)據(jù)中，它與 ELK3 的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)（圖 2A）。CYFIP2 是肌動(dòng)蛋白聚合的負(fù)調(diào)控因子，可抑制絲狀體的形成。與圖 2A 中顯示的結(jié)果一致，定量分析顯示，在 ELK3KD 的 MDA-MB-231 和 Hs578T 細(xì)胞中，CYFIP2 mRNA 和蛋白上調(diào)，而當(dāng) ELK3 恢復(fù)后，它們的表達(dá)量減少（圖 2B，C）。在CYFIP2的啟動(dòng)子上靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的地方發(fā)現(xiàn)一個(gè)ELK3結(jié)合基團(tuán)（圖1）。為證明CYFIP2是ELK3在TNBCs中的直接下游靶點(diǎn)，采用熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，使用編碼熒光素酶的構(gòu)建體，該構(gòu)建體攜帶CYFIP2啟動(dòng)子區(qū)域的bp -1450至+50。如圖 2D 所示，ELK3 顯著抑制 CYFIP2 啟動(dòng)子的活性。通過 ChIP 檢測證實(shí) ELK3 與 CYFIP2 啟動(dòng)子的直接結(jié)合，結(jié)果顯示 Flag-ELK3 與相應(yīng)的基團(tuán)結(jié)合（圖 2E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ELK3在TNBCs中發(fā)揮著CYFIP2轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能。

3. ELK3-CYFIP2軸通過調(diào)節(jié)絲狀突起調(diào)控TNBC的轉(zhuǎn)移特性

         為進(jìn)一步探索ELK3-CYFIP2軸在TNBCs中的生物學(xué)功能，作者了評(píng)估抑制CYFIP2對(duì)ELK3KD TNBCs轉(zhuǎn)移特性的影響。通過將 siRNA 轉(zhuǎn)染 ELK3KD MDA-MB-231 和 Hs578T 細(xì)胞，成功抑制CYFIP2（圖 3A）。值得注意的是，CYFIP2的抑制導(dǎo)致ELK3KD MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的細(xì)胞表面突起重新出現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞的絲狀突起平均數(shù)量和平均長度的增加就是證明（圖3B-D）。

         此外，抑制 ELK3KD 的 MDA-MB-231 和 Hs578T 細(xì)胞中的 CYFIP2 可增強(qiáng)其遷移能力，而 ELK3 的抑制會(huì)削弱這種能力（圖 3E）。當(dāng) CYFIP2 被抑制時(shí)，在 ELK3KD 細(xì)胞中觀察到的低細(xì)胞粘附性增加（圖 3F）。這些結(jié)果表明，ELK3-CYFIP2軸調(diào)節(jié)TNBCs的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移特性，包括絲狀體的形成、遷移和粘附。

4. ELK3-CYFIP2軸通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白積聚影響TNBC對(duì)NK細(xì)胞的敏感性

         乳腺癌細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白積聚可誘導(dǎo)細(xì)胞抵抗 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在與 NK-92MI 細(xì)胞共培養(yǎng)的 MDA-MB-231 對(duì)照細(xì)胞和 ELK3KD 細(xì)胞中觀察融合GFP 的肌動(dòng)蛋白，發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞與 ELK3KD 細(xì)胞接觸部位的肌動(dòng)蛋白堆積突出（圖 4A）。對(duì)與 NK 細(xì)胞接觸部位顯示 GFP 融合肌動(dòng)蛋白聚集的癌細(xì)胞進(jìn)行定量，進(jìn)一步證實(shí) ELK3KD 細(xì)胞與 NK 細(xì)胞接觸后肌動(dòng)蛋白聚集減少的觀察結(jié)果（圖 4B）。此外，ELK3KD 細(xì)胞被 NK 細(xì)胞殺死的時(shí)間明顯縮短（圖 4C），表明肌動(dòng)蛋白反應(yīng)影響細(xì)胞毒性。為證實(shí) TNBCs 中的 ELK3-CYFIP2 軸是否參與針對(duì) NK 細(xì)胞的免疫反應(yīng)過程中的肌動(dòng)蛋白積累，將 siCYFIP2 轉(zhuǎn)染到 ELK3KD TNBCs 中。抑制 CYFIP2 增加了 ELK3KD 細(xì)胞與 NK 細(xì)胞接觸時(shí)的肌動(dòng)蛋白堆積（圖 4D-E）。同樣，圖 4F 顯示轉(zhuǎn)染 siCYFIP2 的 ELK3KD-TNBC 中 NK 細(xì)胞毒性明顯降低。這些結(jié)果突顯了 ELK3-CYFIP2 軸通過肌動(dòng)蛋白聚集在這些癌細(xì)胞對(duì) NK 細(xì)胞的免疫敏感性中的作用。

5. 藥物抑制肌動(dòng)蛋白重塑對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞對(duì) NK 細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響

         上述數(shù)據(jù)表明，ELK3KD細(xì)胞與NK細(xì)胞接觸部位的肌動(dòng)蛋白組裝因CYFIP2的表達(dá)上調(diào)而受損，從而增加它們對(duì)NK細(xì)胞的敏感性。根據(jù)CYFIP2誘導(dǎo)WAVE復(fù)合物失穩(wěn)的報(bào)道，作者推測，在ELK3KD TNBCs中，作用于WAVE下游的Arp2/3受損。為進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，接下來研究在對(duì)NK細(xì)胞免疫敏感的情況下，ELK3KD細(xì)胞是否對(duì)肌動(dòng)蛋白重塑化學(xué)抑制劑有反應(yīng)。

         CK-666 通過抑制 Arp2/3 破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和肌動(dòng)蛋白重塑（圖 5A），對(duì) ELK3KD MDA-MB-231 和 Hs578T 細(xì)胞對(duì) NK 細(xì)胞的免疫反應(yīng)沒有影響，但顯著增強(qiáng)對(duì)照細(xì)胞的敏感性（圖 5B）。延時(shí)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CK-666抑制NK細(xì)胞接觸部位對(duì)照細(xì)胞的絲狀突起，而ELK3KD MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)這種化學(xué)物質(zhì)沒有反應(yīng)（圖5C）。定量分析證實(shí)，CK-666 對(duì) ELK3KD 細(xì)胞肌動(dòng)蛋白對(duì) NK 細(xì)胞接觸的反應(yīng)沒有影響（圖 5D）。與CK-666對(duì)MDA-MB-231和ELK3KD細(xì)胞肌動(dòng)蛋白積累的影響一致，CK-666縮短NK細(xì)胞殺死MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞的時(shí)間，但不影響殺死ELK3KD細(xì)胞的時(shí)間（圖5E）。接下來評(píng)估CK-666 對(duì)癌細(xì)胞與 NK-92MI 細(xì)胞接觸部位肌動(dòng)蛋白相對(duì)堆積的影響。CK-666處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的GFP融合肌動(dòng)蛋白積累減少，而ELK3KD細(xì)胞則無明顯變化（圖5F-G）。這些結(jié)果表明，在TNBCs的ELK3KD中，Arp2/3已經(jīng)失去活性，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白積累減少，對(duì)NK細(xì)胞的易感性增強(qiáng)。

6. ELK3-CYFIP2軸在TNBC對(duì)NK細(xì)胞免疫監(jiān)視的反應(yīng)和TNBC患者的生存中發(fā)揮作用

         為確定ELK3-CYFIP2軸是否調(diào)控TNBC的轉(zhuǎn)移能力以及體內(nèi)的NK反應(yīng)，對(duì)注射GFP表達(dá)對(duì)照細(xì)胞、ELK3KD細(xì)胞或CYFIP2沉默的ELK3KD MDA-MB-231細(xì)胞的小鼠進(jìn)行外滲分析。向免疫缺陷的 NSG 小鼠靜脈注射總計(jì) 1×106 個(gè)癌細(xì)胞，1 小時(shí)后再注射 3×106 個(gè) NK-92MI 細(xì)胞（圖 6A）。3 天后檢查肺部是否存在 GFP 陽性細(xì)胞。在各組小鼠肺組織的冰凍切片中觀察到 GFP 陽性癌細(xì)胞（圖 6B）。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與對(duì)照組 MDA-MB-231 細(xì)胞相比，注射了 ELK3KD 細(xì)胞的小鼠檢測到的 GFP 陽性細(xì)胞較少，而 CYFIP2 沉默的 ELK3KD 細(xì)胞檢測到的 GFP 陽性細(xì)胞水平與對(duì)照組細(xì)胞相似。值得注意的是，當(dāng)向已注射對(duì)照細(xì)胞或 CYFIP2 沉默的 ELK3KD 細(xì)胞的小鼠注射 NK-92MI 細(xì)胞時(shí)，GFP 陽性細(xì)胞的數(shù)量保持不變；但在注射 ELK3KD 細(xì)胞的小鼠中，GFP 陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肺部的 GFP 陽性細(xì)胞進(jìn)行量化（圖 6C）。在每組小鼠的肺組織中都觀察到一致的GFP陽性癌細(xì)胞，這表明ELK3-CYFIP2軸影響MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)體內(nèi)NK細(xì)胞抗癌活性的反應(yīng)。

         最后，使用KM Plotter在線工具研究ELK3和CYFIP2在TNBC細(xì)胞系和患者中表達(dá)的臨床意義。根據(jù)CYFIP2/ELK3的比例，TNBC患者（n = 392）被分為 “高 ”和 “低 ”兩組。Kaplan-Meier 圖顯示，“低 ”組患者的生存期明顯短于 “高 ”組患者（圖 6D）。此外，ELK3 的表達(dá)與 CYFIP2 的表達(dá)呈微弱但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的負(fù)相關(guān)（圖 6E）。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，ELK3-CYFIP2軸具有與TNBC患者生存相關(guān)的生物學(xué)活性。

結(jié)論

         綜上所述，本研究有力地支持這樣一種觀點(diǎn)，即ELK3-CYFIP2軸是驅(qū)動(dòng)TNBC轉(zhuǎn)移的肌動(dòng)蛋白重塑調(diào)節(jié)因子，它同時(shí)影響癌細(xì)胞的遷移和對(duì)NK細(xì)胞的免疫敏感性，以ELK3-CYFIP2軸為靶點(diǎn)有望成為對(duì)抗轉(zhuǎn)移性TNBC的治療策略。具體來說，抑制該軸可以阻礙癌細(xì)胞的遷移和粘附，同時(shí)提高對(duì)NK細(xì)胞的免疫敏感性。破壞這一通路有望為 TNBC 患者制定更有效的治療策略鋪平道路。

實(shí)驗(yàn)方法

         細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞遷移，細(xì)胞粘附試驗(yàn)，qRT-PCR，熒光素酶實(shí)驗(yàn)，Western blot，ChIP，CFSE/7-AAD 檢測，免疫組化，延時(shí)觀察癌細(xì)胞在 NK 細(xì)胞存在下的肌動(dòng)蛋白堆積情況

參考文獻(xiàn)

         Choi SH, Jang HJ, Park JD, Ryu KS, Maeng E, Cho S, Park H, Jung HY, Park KS. ELK3-CYFIP2 axis-mediated actin remodeling modulates metastasis and natural killer cell responses in triple-negative breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Feb 10;44(1):48. doi: 10.1186/s13046-025-03309-7. PMID: 39930469; PMCID: PMC11808954.