青蒿素通過KIT/PI3K/AKT通路抑制黑色素瘤根治術后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移

         癌癥根治性手術是黑色素瘤的主要治療方式，但幾乎所有惡性黑色素瘤患者術后都會出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終死亡。這一臨床困境迫切需要更好的術后治療藥物。青蒿素是一種安全有效的抗瘧藥物，已在臨床上使用數(shù)十年。然而，目前尚無關于青蒿素對腫瘤切除后黑色素瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移影響的研究。在本研究中，作者在 Balb/c 裸鼠上建立了術后腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)亞臨床劑量的青蒿素能顯著抑制腫瘤切除后小鼠的黑色素瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長其生存時間。在 B16 和 A375 細胞系的體外實驗中也得到了類似結(jié)果。進一步實驗證實，青蒿素通過 c-KIT/PI3K/AKT 信號通路在體外和體內(nèi)抑制根治術后的黑色素瘤。作者的研究結(jié)果支持青蒿素在惡性黑色素瘤術后治療中的潛在應用價值。該文章于 2025 年 1 月發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF：8.2。

研究技術路線：

主要實驗結(jié)果：

1、青蒿素聯(lián)合根治性手術抑制黑色素瘤體內(nèi)生長

         作者首先闡述了青蒿素在體內(nèi)抑制黑色素瘤的效果。通過切除 B16 黑色素瘤細胞誘導的原發(fā)性皮下黑色素瘤，建立了術后模型（圖 1A）。癌癥根治性手術后，將小鼠分為 5 組，包括陰性對照組（NC）、每天 13.3mg/kg 青蒿素組（Art-13.3mg/kg 組）、每天 40mg/kg 青蒿素組（Art-40mg/kg 組）、每天 40mg/kg 青蒿素 3 次組（Art-40mg/kg×3 組）和順鉑組作為陽性對照，并進行相應處理。隨后測量上述處理后小鼠的黑色素瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移情況和生存時間。結(jié)果顯示，40mg/kg 青蒿素組、40mg/kg×3 青蒿素組和順鉑組顯著減小了復發(fā)性腫瘤的大小。40mg/kg 青蒿素組的效果與陽性對照順鉑相似，而 40mg/kg×3 青蒿素組效果最佳（圖 1B）。生存分析還表明，Art-40mg/kg 組和 Art-40mg/kg×3 組的小鼠比 NC 組的小鼠生存時間更長（圖 1C）。當小鼠因腫瘤負擔死亡或達到實驗終點時，作者解剖小鼠檢查是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，青蒿素抑制了肺轉(zhuǎn)移（圖 1D-E）。

圖 1 青蒿素抑制了黑色素瘤的生長、復發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長了生存時間。

         同時，作者使用另一種黑色素瘤細胞系 A375 來驗證結(jié)果。在后續(xù)實驗中，作者發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢，即青蒿素顯著減小了復發(fā)性腫瘤的大?。▓D 1F-G），并延長了建模小鼠的預期壽命（圖 1H）。

         綜上所述，青蒿素可以抑制黑色素瘤在癌癥根治性切除后的生長、復發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長生存時間，其亞臨床劑量的抗黑色素瘤效果與順鉑相似，甚至更好。

2、青蒿素抑制黑色素瘤體外生長、遷移和侵襲

         作者還使用 B16 和 A375 細胞系證實了青蒿素在體外抑制黑色素瘤的效果。對 B16 細胞進行 MTT 檢測，計算不同濃度青蒿素作用下的細胞活力（圖 2A），得出青蒿素的半數(shù)抑制濃度（IC50）為 214.89μM。因此，在后續(xù)的一些實驗中，作者選擇 200μM 的青蒿素處理 B16 細胞。進行集落形成實驗以驗證青蒿素可以顯著降低 B16 細胞的增殖能力（圖 2B-C）。此外，作者通過對 B16 細胞系進行劃痕實驗，檢測不同組別的遷移能力（圖 2D）。結(jié)果表明，與 NC 組相比，青蒿素（濃度超過 50μM）可以顯著縮短 B16 細胞的遷移距離（圖 2E）。隨后進行 Transwell 遷移和侵襲實驗，對穿過聚酯（PET）膜的細胞進行成像和計數(shù)（圖 2F），這也表明青蒿素可以抑制黑色素瘤的遷移（圖 2G）和侵襲（圖 2H）。

圖 2 青蒿素抑制了 B16 和 A375 細胞的增殖、遷移和侵襲。

         在 A375 細胞系上也獲得了類似的效果。劃痕實驗表明青蒿素可以顯著抑制細胞遷移（圖 2I-J）。Transwell 遷移實驗和 Transwell 侵襲實驗進一步證實，青蒿素顯著降低了細胞的遷移和侵襲能力。MTT 檢測表明青蒿素也抑制了 A375 細胞的增殖（圖 2K），集落形成實驗也證明了類似的趨勢。

3、基于 RNA 測序和高通量分析篩選青蒿素作用通路

         在確定青蒿素在體內(nèi)和體外均具有抗黑色素瘤作用后，作者通過 RNA 測序分析進一步探究其作用機制。利用術后模型，作者獲取了一些組織，根據(jù)分組將其命名為原位組（手術前的原發(fā)性腫瘤）、復發(fā) - NC 組（N_recur 組，NC 組術后復發(fā)性腫瘤）、復發(fā) - Art 組（T_recur 組，青蒿素治療組術后復發(fā)性腫瘤）和肺轉(zhuǎn)移組（Metast 組）。通過火山圖展示 N_recur 組和 T_recur 組之間（圖 3A）、原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移之間（圖 3B）的差異表達基因。同時，體外處理的差異基因也在火山圖中展示，包括 B16-NC 組和 B16-Art 組（圖 3C）。然后，基于上述差異基因進行 KEGG 通路分析，并展示每次分析中排名前 20 的通路（圖 3D-F）。包括 PI3K-AKT 通路在內(nèi)的幾個通路參與了所有三項分析，這表明這些通路可能與黑色素瘤轉(zhuǎn)移以及體內(nèi)外青蒿素治療均相關。

圖 3 基于 RNA 測序和高通量分析篩選青蒿素作用通路

4、進一步篩選青蒿素抑制黑色素瘤的潛在靶點

         為了確定與青蒿素相關的重要通路，作者繪制了維恩圖，展示組織和細胞系中青蒿素相關通路的交集（圖 4A）。用氣泡圖展示了 11 個交集通路（圖 4B），其中 PI3K/AKT 信號通路包含的基因數(shù)量最多。因此，作者選擇該通路作為青蒿素可能激活的潛在通路。作者進一步找出了青蒿素參與 PI3K-AKT 通路的確切差異基因（圖 4C-D），這表明 KIT 在體內(nèi)外均下調(diào)，提示 KIT 是青蒿素的一個重要靶點。RT-qPCR 檢測證明青蒿素顯著降低了 B16 黑色素瘤細胞系中 KIT 的表達（圖 4E）。為了證實 KIT 在黑色素瘤中的關鍵作用，作者基于 TCGA 數(shù)據(jù)庫中的 468 例黑色素瘤患者進行生存分析，確定 KIT 是與黑色素瘤患者預后呈負相關的重要生物標志物（圖 4F）。

圖 4 高通量分析篩選青蒿素的作用靶點

5、青蒿素靶向 c-KIT/PI3K/AKT 信號通路

         作者在體內(nèi)外將青蒿素應用于黑色素瘤，然后進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，以確認 c-KIT 是青蒿素的靶點（圖 5A）。結(jié)果顯示，青蒿素顯著劑量依賴性地降低 c-KIT 表達（圖 5B）。它還減弱了 PI3K（ser244/249）、AKT（Thr 308）和 NFKB（ser536）的磷酸化（圖 5C-E），這表明青蒿素可能調(diào)節(jié)由 c-KIT 誘導的 PI3K/AKT 信號通路。

圖 5 青蒿素激活 c-KIT 誘導的通路

         作者還研究了青蒿素調(diào)節(jié)的上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標志物的表達（圖 5F）。結(jié)果表明，青蒿素顯著降低了 Snail、N - 鈣粘蛋白和波形蛋白的表達，同時增加了 E - 鈣粘蛋白的表達（圖 5G-J），支持青蒿素能夠抑制 EMT，進而抑制黑色素瘤的遷移和侵襲。

         在體內(nèi)研究中也獲得了類似結(jié)果，從術后模型收集組織樣本進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，包括手術前的原發(fā)性腫瘤、NC 組術后復發(fā)性腫瘤、Art 組術后復發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移組織。與復發(fā) - NC 組相比，復發(fā) - Art 組中 c-KIT、磷酸化 AKT、N - 鈣粘蛋白和波形蛋白的表達顯著降低（圖 5K-O）。

         這些結(jié)果表明，青蒿素可以通過磷酸化級聯(lián)反應激活 KIT 誘導的 PI3K-AKT 通路，從而抑制黑色素瘤。

6、c-KIT 基因敲除模擬青蒿素的作用效果

         為了研究 c-KIT 的作用，作者使用 gRNA-Cas9 技術敲除 B16 細胞中的 c-KIT，隨后探究 c-KIT 敲除組（B16-KIT-gRNA）與野生型對照組（B16-NC）之間的差異。集落形成實驗表明，敲除 c-KIT 顯著抑制了 B16 細胞系的細胞生長（圖 6A-B）。MTT 檢測也顯示出類似的趨勢（圖 6C）。進行劃痕實驗研究 c-KIT 敲除對細胞遷移的影響，結(jié)果表明敲除 c-KIT 顯著抑制了 B16 細胞的遷移（圖 6D-E）。

圖 6 gRNA-Cas9 技術敲除 c-KIT 顯著抑制黑色素瘤

         對兩組進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（圖 6F）。結(jié)果證實，與 B16-NC 組相比，B16-KIT-gRNA 組中 c-KIT 的表達顯著降低（圖 6G）。正如預期的那樣，c-KIT 的下游靶點 AKT（Thr308）的磷酸化被 c-KIT 敲除顯著下調(diào)（圖 6H）。同時，B16-KIT-gRNA 組中的 EMT 生物標志物 N - 鈣粘蛋白和波形蛋 白減少（圖 6I-J）。

         這些結(jié)果表明，敲除 c-KIT 可能通過抑制 c-KIT/AKT 信號通路來抑制黑色素瘤的生長和遷移。

7、c-KIT 過表達減弱青蒿素的抗黑色素瘤作用

         為了進一步闡明 c-KIT 的作用，作者用過表達 KIT 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 B16 細胞。進行了挽救實驗，包括三組：陰性對照組（NC）、青蒿素治療組（Art）和青蒿素治療加 KIT 過表達組（Art + KIT_OE）。

         首先，進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗驗證 KIT/PI3K/AKT 通路（圖 7A）。結(jié)果顯示，青蒿素降低了 c-KIT 的表達、磷酸化水平，以及 c-KIT 下游靶點 PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，而過表達 c-KIT 則逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7B-E）。MTT 檢測顯示，c-KIT 過表達逆轉(zhuǎn)了青蒿素對 B16 細胞的抗增殖作用（圖 7F）。劃痕實驗表明，青蒿素抑制了 B16 細胞的遷移，而 c-KIT 過表達逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7G-H）。B16 細胞的 Transwell 遷移和侵襲實驗也得到了類似的結(jié)果，表明 c-KIT 過表達逆轉(zhuǎn)了青蒿素的作用（圖 7I-K）。

圖 7 青蒿素通過 c-KIT 相關通路抑制黑色素瘤，而 KIT 過表達（OE）的挽救實驗逆轉(zhuǎn)了這些效果

8、PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 抑制 B16 和 A375 黑色素瘤細胞系的增殖、遷移和侵襲，并模擬青蒿素的作用

         為了檢驗抑制 PI3K/AKT 通路是否能模擬青蒿素的作用，作者使用了 PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002。MTT 檢測、劃痕實驗和 Transwell 實驗表明，PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 與青蒿素一樣抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲（圖 8A-F）。在另一種黑色素瘤細胞系 A375 中也獲得了類似的結(jié)果（圖 8G-L）。這些結(jié)果表明，PI3K/AKT 通路是體外抑制黑色素瘤細胞系 A375 和 B16 的關鍵靶點。

圖 8 PI3K/AKT 抑制劑 LY294002 降低 B16 和 A375 黑色素瘤細胞系的增殖、遷移和侵襲能力

9、AKT 激活劑減弱青蒿素在 B16 和 A375 黑色素瘤細胞系中的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用

         作者還使用 AKT 激活劑 SC79 進一步驗證 AKT 在青蒿素體外抗癌作用中的作用，在 B16 和 A375 細胞系中均進行了實驗。實驗設置了三組細胞：陰性對照組（NC）、青蒿素組（Art）和青蒿素加 SC79 組（ART+SC79）。MTT 檢測、劃痕實驗和 Transwell 實驗表明，青蒿素抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲，而 AKT 激活劑減弱了青蒿素在 B16 細胞和 A375 細胞中的這些作用（圖 9）。這些結(jié)果進一步證實了 Akt 在青蒿素對 B16 和 A375 細胞系抗癌作用中的作用。

圖 9 AKT 激活劑 SC79 減弱青蒿素在 B16 和 A375 黑色素瘤細胞中的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用

10、c-KIT 過表達促進黑色素瘤生長，而 PI3K/AKT 抑制劑 LY294002 逆轉(zhuǎn)其作用

         作者進一步進行了一系列挽救實驗，以證明 B16 黑色素瘤細胞系中 c-KIT 與 PI3K/AKT 之間的調(diào)節(jié)關系。蛋白質(zhì)免疫印跡顯示，c-KIT 過表達顯著提高了 AKT 的磷酸化水平，而 LY294002 即使在 c-KIT 過表達的情況下也降低了 AKT 的磷酸化水平。然后，一系列體外實驗表明，c-KIT 過表達顯著促進了黑色素瘤的增殖、遷移和侵襲，而 LY294002 逆轉(zhuǎn)了這些趨勢。這些結(jié)果證實，c-KIT 可以通過 AKT 磷酸化調(diào)節(jié)黑色素瘤。

11、雙氫青蒿素和青蒿琥酯在癌癥根治術后抑制黑色素瘤體內(nèi)生長

         作者還檢測了兩種青蒿素衍生物雙氫青蒿素（DHA）和青蒿琥酯（AS）在癌癥根治術后對黑色素瘤的體內(nèi)抑制作用。與青蒿素的實驗類似，對動物進行相應處理，并測量小鼠的黑色素瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存時間。圖 10A 顯示，DHA 和 AS 在 4 周內(nèi)顯著減小了復發(fā)性腫瘤的大小。AS 的治療效果更好（圖 10B）。圖 10C-D 顯示，DHA 和 AS 抑制了黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。生存分析表明，DHA 和 AS 顯著延長了術后模型中小鼠的生存時間（圖 10E）。MTT 檢測也證實了 AS 的體外作用，證明 AS 顯著抑制了 B16 細胞系的生長（圖 10F）。

圖 10 雙氫青蒿素（DHA）和青蒿琥酯（AS）在癌癥根治術后體外和體內(nèi)抑制黑色素瘤生長

         作者進一步比較了青蒿素及其衍生物在體內(nèi)外的治療效果和可能的副作用。此前，作者已經(jīng)分別證明了 ART、DHA 和 AS 在術后模型中的作用?，F(xiàn)在，作者在同一批小鼠模型中比較了它們對抑制復發(fā)性黑色素瘤的效果。同樣，所有藥物（包括 ART、DHA 和 AS）均以 40mg/kg 的劑量腹腔注射給術后小鼠，以 10% DMSO 作為陰性對照（NC）。與 NC 組相比，DHA 和 AS 呈現(xiàn)出相似的趨勢，在抑制術后黑色素瘤復發(fā)方面比 ART 更顯著，但 ART 與 DHA/AS 之間的差異無統(tǒng)計學意義。術后所有組小鼠體重變化均無顯著差異，這表明 ART 或其衍生物引起的副作用是可耐受的。體外 MTT 檢測顯示，與順鉑陽性對照相比，DHA 和 AS 在 B16 細胞系中具有相似的抗增殖作用，且優(yōu)于 ART。另一方面，ART（200μM）和順鉑（100μM）聯(lián)合使用比單獨使用 ART 能進一步抑制黑色素瘤生長，這表明 ART 和順鉑之間存在協(xié)同作用。

12、青蒿素在癌癥根治術后抑制乳腺癌和肺癌體內(nèi)生長

         為了研究青蒿素在癌癥根治術后對其他癌癥的抗癌作用，作者在類似實驗中使用了乳腺癌和肺癌模型。作者用 MB231 細胞系建立了乳腺癌術后腫瘤模型，用 A549 細胞系建立了肺癌術后腫瘤模型（圖 11A）。作者檢測了 MB231 誘導的腫瘤模型在術后 3 周不同組別的復發(fā)性腫瘤大小。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，青蒿素在 4 周內(nèi)顯著減小了復發(fā)性腫瘤的大?。▓D 11B）。在肺癌細胞系 A549 誘導的術后模型中也證實了類似的結(jié)果（圖 11C-D）。此外，體外 MTT 檢測也表明，青蒿素在體外抑制了 MB231 細胞系和 A549 細胞系的生長（圖 11E-F）。

圖 11 青蒿素在體外和術后小鼠模型中也抑制乳腺癌和肺癌生長

結(jié)論：

         青蒿素可以抑制黑色素瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，并延長小鼠模型中癌癥根治手術后生存壽命。青蒿素通過 c-KIT/PI3K/AKT 通路在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗黑色素瘤作用，這支持了其在癌癥患者術后治療中的潛在治療效果。

 實驗方法：

         RNA 測序、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、MTT檢測、集落形成實驗、劃痕實驗、transwell實驗、qRT - PCR、Western blot、HE 染色、小鼠皮下腫瘤模型及基于皮下腫瘤模型的術后腫瘤模型

參考文獻：

         Zhou Z, Farhan M, Xing X, Zhou W, Lin R, Zeng S, Li M, Zheng W. Artemisinin Suppressed Melanoma Recurrence and Metastasis after Radical Surgery through the KIT/PI3K/AKT Pathway. Int J Biol Sci. 2025 Jan 1;21(1):75-94. doi: 10.7150/ijbs.97341. PMID: 39744440; PMCID: PMC11667813.