m7G tRNA修飾通過激活SHAF4依賴的線粒體氧化磷酸化促進胃癌進展

         m7G tRNA修飾與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。然而，m7G tRNA修飾在胃癌（GC）中的確切功能和分子機制尚不清楚。在本研究中，我們評估了METTL1和WDR4在GC中的表達和功能，并闡明了METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾在促進GC進展中的機制。胃癌組織中m7G甲基轉(zhuǎn)移酶復合蛋白METTL1和WDR4的上調(diào)與患者預后不良顯著相關(guān)。在功能上，METTL1和WDR4在體外和體內(nèi)促進GC進展。在機制上，METTL1敲減降低了m7G修飾tRNA的表達，并減弱了富含氧化磷酸化途徑相關(guān)癌基因的翻譯。此外，METTL1通過促進SDHAF4的翻譯，增強了ETC II的活性，從而加速了GC的代謝和進展。強制表達SDHAF4和化學調(diào)節(jié)ETC II可以逆轉(zhuǎn)METTL1對小鼠GC的影響?？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾在GC進展中的致癌作用和分子機制，表明METTL1/WDR4及其下游信號軸可能是GC治療的潛在靶點。本文于2025年3月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）METTL1和WDR4在GC中升高并與不良預后相關(guān)

         為了探討m7G tRNA修飾在癌癥中的潛在作用，我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了METTL1和WDR4在不同癌癥中的表達。在多種腫瘤中檢測到METTL1和WDR4水平的升高，特別是在胃癌樣本（TCGA-STAD）中（圖1A）。這些發(fā)現(xiàn)在我們臨床隊列中得到驗證，與周圍正常組織相比，胃癌組織中METTL1、WDR4和m7G的表達升高（圖1B和C）。此外，免疫組化染色也證實了與周圍組織相比，腫瘤組織中METTL1和WDR4的表達增加（圖1D）。同時，數(shù)據(jù)庫分析和Co-IP實驗揭示了胃癌中METTL1和WDR4表達水平之間的正相關(guān)關(guān)系，以及它們之間的直接結(jié)合，表明這兩種蛋白質(zhì)之間可能存在功能性的相互作用（圖1E）。為了探索METTL1和WDR4的臨床相關(guān)性，我們分析了Kaplan–Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4表達水平的升高與總生存期（OS）縮短相關(guān)（圖1F）。此外，我們使用包含94個原發(fā)性胃癌組織的組織微陣列進行了免疫組化染色，以評估METTL1/WDR4表達；根據(jù)IHC染色評分，將這些樣本分為低表達和高表達組（圖1G）。Kaplan–Meier生存分析顯示，在我們隊列中，METTL1或WDR4高表達組的OS比低表達組差（圖1H）。這些結(jié)果突顯了METTL1和WDR4在胃癌進展中的臨床重要性。

2）METTL1敲除抑制體外和體內(nèi)GC進展

         為了研究METTL1在胃癌進展中的生物學功能，我們將METTL1及其催化失活突變體（缺乏m7G tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性）引入METTL1表達較低的胃癌細胞（HGC-27和MKN1），并通過qRT-PCR和western blotting評估了其效率（圖2A和B）。我們發(fā)現(xiàn)，野生型METTL1的過表達增強了胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成和抗凋亡能力，而其催化失活突變體則沒有這種效果（圖2C，2E，2G，2I）。作為補充，我們使用兩個短發(fā)夾RNA（shRNAs）來下調(diào)METTL1表達較高的胃癌細胞（AGS和MGC803）中的METTL1。結(jié)果表明，METTL1的敲減抑制了胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成和抗凋亡能力（圖2D，2F，2H，2J）。隨后，我們使用異種移植小鼠模型確認了METTL1在胃癌中的體內(nèi)作用。來自METTL1敲減MKN45細胞的腫瘤生長較慢，其體積和重量顯著低于陰性對照組細胞（圖2K）。此外，免疫組化染色顯示METTL1敲減組的腫瘤組織中Ki-67水平降低，表明METTL1敲減減少了體內(nèi)胃癌的增殖活性（圖2L）。為了研究METTL1對血液轉(zhuǎn)移性胃癌的影響，我們通過將MKN45-shNC或MKN45-shM1細胞注射到裸鼠的尾靜脈中，建立了小鼠肺轉(zhuǎn)移模型。METTL1敲減組在注射后40天的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小顯著低于陰性對照組（圖2M，2N）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1在體外和體內(nèi)促進了胃癌的進展。

3）METTL1/WDR4調(diào)控GC中tRNA m7G修飾、tRNA表達和全局mRNA翻譯

         為了探究METTL1/WDR4在胃癌中致癌作用的分子機制，我們進行了Northwestern印跡分析，以評估METTL1和WDR4敲減的AGS細胞中tRNA的m7G信號。結(jié)果表明，METTL1或WDR4的敲減降低了tRNA的m7G修飾（圖3A）。隨后，我們分析了METTL1敲減和陰性對照AGS細胞中全局tRNA m7G修飾的情況，并識別出在可變環(huán)中具有"VRRGGTY"基序序列的21種m7G修飾的tRNA（圖3B–D）。我們發(fā)現(xiàn)METTL1敲減導致這些識別出的tRNA的m7G信號和表達顯著降低，表現(xiàn)為較低的切割評分（圖3E）。此外，METTL1敲減顯著減少了大多數(shù)m7G修飾的tRNA的表達，而未修飾的tRNA不受影響（圖3F和G）。m7G Northwestern和Northern印跡分析也確認了在METTL1敲減的胃癌細胞中，幾種代表性的m7G修飾的tRNA表達下調(diào)（圖3I）。相反，野生型METTL1的過表達（而非其催化失活突變體）上調(diào)了全局tRNA m7G修飾和幾種代表性的m7G修飾的tRNA的表達水平（圖3H），驗證了METTL1通過其m7G甲基轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)tRNA修飾和表達。WDR4在胃癌細胞中的敲減或過表達產(chǎn)生了類似的效果（圖3H和I）。總的來說，這些結(jié)果證明了METTL1和WDR4在tRNA m7G修飾和表達中的關(guān)鍵作用。我們進一步研究了METTL1/WDR4介導的tRNA m7G修飾是否可以調(diào)節(jié)胃癌細胞中的mRNA翻譯。puromycin攝入分析顯示METTL1的耗竭減少了胃癌細胞的整體mRNA翻譯效率（TE）（圖3J）。此外，野生型METTL1的重新表達（而非其突變體）在METTL1敲減的AGS和MGC803細胞中恢復了mRNA翻譯效率（圖3J），表明METTL1在mRNA翻譯調(diào)節(jié)中的作用依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了METTL1/WDR4介導的tRNA m7G修飾在調(diào)節(jié)胃癌中mRNA翻譯的重要作用。

4）METTL1/WDR4以m7G相關(guān)密碼子依賴的方式促進線粒體氧化磷酸化相關(guān)mRNA的翻譯

         為了確定由METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾調(diào)控的關(guān)鍵下游mRNA，我們在METTL1敲減和對照AGS細胞上進行了核糖體核酸復合物測序（RNC-seq），以識別翻譯效率差異的mRNA。我們的分析發(fā)現(xiàn)，有871個mRNA的翻譯效率降低（下調(diào)），而1179個mRNA的翻譯效率增加（上調(diào)）（圖4A）。隨后，我們進行了密碼子頻率分析。與翻譯效率增加的mRNA相比，翻譯效率降低的mRNA具有更高比例的由m7G介導的tRNA解碼的密碼子（圖4B）。接下來，我們使用RNC-seq數(shù)據(jù)進行了GO和通路富集分析。翻譯效率低的mRNA在氧化磷酸化（OXPHOS）相關(guān)的生物學過程和與線粒體電子傳遞鏈（ETC）相關(guān)的通路中顯著富集，這些過程和通路被認為是癌癥進展的關(guān)鍵（圖4C）。為了確認METTL1或WDR4的耗竭會破壞胃癌中的能量代謝，我們評估了ATP水平并進行了細胞外氧消耗（EOC）測定。野生型METTL1的過表達顯著增強了胃癌細胞中的ATP合成和EOC，而METTL1的敲減則產(chǎn)生了相反的效果（圖4D–G）。此外，METTL1或WDR4耗竭的胃癌細胞中的總細胞ROS產(chǎn)生和線粒體ROS水平顯著上調(diào)，而在野生型METTL1或WDR4過表達時則下調(diào)（圖4H，4J）。同時，MitoTracker Green染色實驗顯示，METTL1敲減導致AGS和MGC803細胞中線粒體形態(tài)異常，表現(xiàn)為線粒體變小、變圓、碎片化，正常的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受損（圖4L）。接下來，我們發(fā)現(xiàn)METTL1或WDR4的過表達會增加線粒體膜電位水平，而METTL1或WDR4的敲減則產(chǎn)生了相反的效果（圖4M，4N）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1以一種依賴于m7G相關(guān)密碼子的方式增強了與線粒體氧化磷酸化相關(guān)的基因的翻譯。

5）METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾通過增強GC中ETC II活性促進氧化磷酸化和惡性進展

         ETC對腫瘤生長至關(guān)重要。我們的RNC-seq結(jié)果顯示，METTL1敲減影響了呼吸電子傳遞和ETC相關(guān)復合物的組裝（圖4C）。因此，我們推測METTL1通過調(diào)節(jié)ETC活性促進胃癌的OXPHOS和惡性進展。我們發(fā)現(xiàn)METTL1或WDR4敲減顯著降低了ETC II的活性，而對其他復合物的活性沒有影響（圖5A）。此外，西方印跡分析顯示，METTL1敲減降低了ETC II中的關(guān)鍵蛋白SDHB的表達水平，但對其他復合物中的關(guān)鍵蛋白表達沒有影響（圖5B）。相反，METTL1過表達增強了SDHB的表達（圖5B）。METTL1敲減阻礙了延胡索酸的產(chǎn)生并導致琥珀酸的積累，而METTL1過表達則產(chǎn)生了相反的效果，進一步表明METTL1增強了ETC II的活性（圖5C）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1可能增強了胃癌細胞中ETC II的活性。隨后，我們使用ETC II抑制劑α-生育酚（α-Toc；50μM）來抑制METTL1過表達的HGC-27和MKN1細胞中ETC II活性。我們發(fā)現(xiàn)METTL1過表達會增加胃癌細胞中的ATP水平、EOC、增殖和轉(zhuǎn)移能力，而ETC II抑制劑則產(chǎn)生了相反的效果。值得注意的是，用α-生育酚抑制ETC II的活性消除了METTL1過表達在胃癌細胞中引起的ATP水平、EOC、增殖和轉(zhuǎn)移的增強效果（圖5D–F）。這些結(jié)果證明了ETC II在介導METTL1在胃癌中的功能中的關(guān)鍵作用。

         ETC II由四個亞單位蛋白組成（SDHA、SDHB、SDHC和SDHD）。METTL1影響了SDHA和SDHB的表達，但并未影響SDHC或SDHD（圖5G）。我們在METTL1敲減的胃癌細胞中單獨過表達SDHA和SDHB，以及共同過表達兩者進行了拯救實驗。SDHA或SDHB的重新表達部分恢復了METTL1敲減的胃癌細胞中的ETC II活性、ATP水平、增殖和轉(zhuǎn)移能力，而同時過表達SDHA和SDHB則產(chǎn)生了更強的效果（圖5H，5I）。此外，我們評估了METTL1敲減對SDHA和SDHB mRNA水平和翻譯效率的影響。結(jié)果顯示，METTL1敲減后，SDHA和SDHB mRNA的水平及其翻譯效率沒有顯著變化（圖5J），這表明SDHA和SDHB不是直接由METTL1介導的m7G tRNA修飾調(diào)控的。考慮到SDHA和SDHB蛋白表達減少的主要原因是泛素化水平增加，我們接著檢查了METTL1敲減的胃癌細胞中SDHA和SDHB的泛素化水平。結(jié)果顯示，METTL1敲減可以促進它們的泛素化水平，并減弱SDHA和SDHB之間的相互作用和結(jié)合（圖5K和S6E）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明METTL1通過增強胃癌中依賴SDHA和SDHB的ETC II活性，促進氧化磷酸化和惡性進展。

6）SDAHAF4是METTL1在GC中增強ETC II活性的關(guān)鍵靶點

         鑒于METTL1并未影響胃癌細胞中SDHA或SDHB的翻譯效率，我們分析了RNC-seq數(shù)據(jù)，以確定由METTL1介導的m7G tRNA修飾直接調(diào)控的、與ETC II活性相關(guān)的關(guān)鍵靶基因。我們發(fā)現(xiàn)，參與細胞呼吸和線粒體ETC復合物II組裝的SDHAF4基因含有高豐度的m7G tRNA解碼密碼子。因此，我們假設(shè)SDHAF4是METTL1在胃癌中增強ETC II活性的關(guān)鍵靶基因。SDHAF4的翻譯效率在METTL1敲減的細胞中降低，而其mRNA水平保持不變，表明METTL1/WDR4通過m7G tRNA修飾調(diào)控SDHAF4的表達（圖6A）。此外，METTL1或WDR4耗竭時，胃癌細胞和異種移植腫瘤中的SDHAF4蛋白水平降低（圖6B，6C）為了加強我們的結(jié)論，即METTL1介導的m7G tRNA修飾通過調(diào)控SDHAF4的翻譯和表達增強了胃癌中ETC II的活性和惡性進展，我們在METTL1過表達的HGC-27細胞中使用了針對SDHAF4的siRNA，并通過西方印跡定量蛋白水平（圖6D）。SDHAF4的敲減顯著抑制了METTL1過表達引起的ATP水平、EOC、ETC II活性和細胞增殖、遷移和侵襲能力的增加（圖6E–G）。相應地，METTL1敲減的MKN1細胞中恢復SDHAF4表達挽救了這些因素（圖6E，6H，6I）。在皮下異種移植模型中，接受MKN45-shM1#1細胞治療的小鼠腫瘤進展比接受MKN45-shNC細胞治療的小鼠慢。值得注意的是，SDHAF4的過表達減弱了METTL1敲減對腫瘤進展的抑制效果（圖6J）。此外，METTL1敲減降低了Ki-67、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達，而過表達SDHAF4則逆轉(zhuǎn)了METTL1敲減對Ki-67、SDHA和SDHB表達的抑制效果（圖6K）。同樣，METTL1敲減組的肺轉(zhuǎn)移顯著減少，而在體內(nèi)重新過表達SDHAF4部分恢復了這些特性（圖6L）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明SDHAF4對于METTL1增強胃癌中依賴SDHA和SDHB的ETC II活性和惡性進展至關(guān)重要。

7）靶向METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸可能是一種很有前景的GC治療策略

         最后，我們評估了針對METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸的治療是否可以作為胃癌的潛在治療方法，以及這個軸是否對胃癌患者具有臨床意義。METTL1的過表達顯著加速了胃癌的進展，而α-生育酚對腫瘤生長表現(xiàn)出抑制效果，表明α-生育酚可能是高METTL1表達的胃癌患者的可行治療選擇（圖7A）。免疫組化證實，METTL1過表達時Ki-67、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達增加，而α-生育酚治療逆轉(zhuǎn)了這一效果（圖7B）。在肺轉(zhuǎn)移模型中，METTL1在體內(nèi)顯著促進了肺轉(zhuǎn)移，而α-生育酚治療減輕了這種效果（圖7C）。Kaplan–Meier分析顯示，SDHAF4、SDHA和SDHB水平與胃癌患者的預后不良呈正相關(guān)（圖7D–F）。METTL1、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達水平之間存在正相關(guān)（圖7G–I）。此外，免疫組化染色驗證了這一發(fā)現(xiàn)（圖7J）?？偟膩碚f， METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸在胃癌生長和轉(zhuǎn)移中廣泛參與，這表明針對這個軸的治療可能作為胃癌治療的充滿希望的治療策略。

結(jié)論：

         我們的研究闡明了METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾在胃癌進展中的致癌作用。此外，我們通過綜合的體外、體內(nèi)和臨床樣本數(shù)據(jù)揭示了通過m7G tRNA修飾在胃癌中調(diào)控特定mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子機制。這些發(fā)現(xiàn)為針對胃癌開發(fā)治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

實驗方法：

         qPCR，Northern，northwestern，western blotting，IHC，TRAC-seq，RNC- seq。

參考文獻：

         Xu X, Huang Z, Han H, Yu Z, Ye L, Zhao Z, Qian Y, Li Y, Zhao R, Zhang T, Liu Y, Cai J, Lin S, Zhai E, Chen J, Cai S. N7-methylguanosine tRNA modification promotes gastric cancer progression by activating SDHAF4-dependent mitochondrial oxidative phosphorylation. Cancer Lett. 2025 Apr 10;615:217566. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217566.