m7G tRNA修飾通過激活SHAF4依賴的線粒體氧化磷酸化促進(jìn)胃癌進(jìn)展

         m7G tRNA修飾與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。然而，m7G tRNA修飾在胃癌（GC）中的確切功能和分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們評(píng)估了METTL1和WDR4在GC中的表達(dá)和功能，并闡明了METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在促進(jìn)GC進(jìn)展中的機(jī)制。胃癌組織中m7G甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合蛋白METTL1和WDR4的上調(diào)與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。在功能上，METTL1和WDR4在體外和體內(nèi)促進(jìn)GC進(jìn)展。在機(jī)制上，METTL1敲減降低了m7G修飾tRNA的表達(dá)，并減弱了富含氧化磷酸化途徑相關(guān)癌基因的翻譯。此外，METTL1通過促進(jìn)SDHAF4的翻譯，增強(qiáng)了ETC II的活性，從而加速了GC的代謝和進(jìn)展。強(qiáng)制表達(dá)SDHAF4和化學(xué)調(diào)節(jié)ETC II可以逆轉(zhuǎn)METTL1對(duì)小鼠GC的影響?？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在GC進(jìn)展中的致癌作用和分子機(jī)制，表明METTL1/WDR4及其下游信號(hào)軸可能是GC治療的潛在靶點(diǎn)。本文于2025年3月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）METTL1和WDR4在GC中升高并與不良預(yù)后相關(guān)

         為了探討m7G tRNA修飾在癌癥中的潛在作用，我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了METTL1和WDR4在不同癌癥中的表達(dá)。在多種腫瘤中檢測到METTL1和WDR4水平的升高，特別是在胃癌樣本（TCGA-STAD）中（圖1A）。這些發(fā)現(xiàn)在我們臨床隊(duì)列中得到驗(yàn)證，與周圍正常組織相比，胃癌組織中METTL1、WDR4和m7G的表達(dá)升高（圖1B和C）。此外，免疫組化染色也證實(shí)了與周圍組織相比，腫瘤組織中METTL1和WDR4的表達(dá)增加（圖1D）。同時(shí)，數(shù)據(jù)庫分析和Co-IP實(shí)驗(yàn)揭示了胃癌中METTL1和WDR4表達(dá)水平之間的正相關(guān)關(guān)系，以及它們之間的直接結(jié)合，表明這兩種蛋白質(zhì)之間可能存在功能性的相互作用（圖1E）。為了探索METTL1和WDR4的臨床相關(guān)性，我們分析了Kaplan–Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4表達(dá)水平的升高與總生存期（OS）縮短相關(guān)（圖1F）。此外，我們使用包含94個(gè)原發(fā)性胃癌組織的組織微陣列進(jìn)行了免疫組化染色，以評(píng)估METTL1/WDR4表達(dá)；根據(jù)IHC染色評(píng)分，將這些樣本分為低表達(dá)和高表達(dá)組（圖1G）。Kaplan–Meier生存分析顯示，在我們隊(duì)列中，METTL1或WDR4高表達(dá)組的OS比低表達(dá)組差（圖1H）。這些結(jié)果突顯了METTL1和WDR4在胃癌進(jìn)展中的臨床重要性。

2）METTL1敲除抑制體外和體內(nèi)GC進(jìn)展

         為了研究METTL1在胃癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能，我們將METTL1及其催化失活突變體（缺乏m7G tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性）引入METTL1表達(dá)較低的胃癌細(xì)胞（HGC-27和MKN1），并通過qRT-PCR和western blotting評(píng)估了其效率（圖2A和B）。我們發(fā)現(xiàn)，野生型METTL1的過表達(dá)增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成和抗凋亡能力，而其催化失活突變體則沒有這種效果（圖2C，2E，2G，2I）。作為補(bǔ)充，我們使用兩個(gè)短發(fā)夾RNA（shRNAs）來下調(diào)METTL1表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞（AGS和MGC803）中的METTL1。結(jié)果表明，METTL1的敲減抑制了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成和抗凋亡能力（圖2D，2F，2H，2J）。隨后，我們使用異種移植小鼠模型確認(rèn)了METTL1在胃癌中的體內(nèi)作用。來自METTL1敲減MKN45細(xì)胞的腫瘤生長較慢，其體積和重量顯著低于陰性對(duì)照組細(xì)胞（圖2K）。此外，免疫組化染色顯示METTL1敲減組的腫瘤組織中Ki-67水平降低，表明METTL1敲減減少了體內(nèi)胃癌的增殖活性（圖2L）。為了研究METTL1對(duì)血液轉(zhuǎn)移性胃癌的影響，我們通過將MKN45-shNC或MKN45-shM1細(xì)胞注射到裸鼠的尾靜脈中，建立了小鼠肺轉(zhuǎn)移模型。METTL1敲減組在注射后40天的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小顯著低于陰性對(duì)照組（圖2M，2N）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1在體外和體內(nèi)促進(jìn)了胃癌的進(jìn)展。

3）METTL1/WDR4調(diào)控GC中tRNA m7G修飾、tRNA表達(dá)和全局mRNA翻譯

         為了探究METTL1/WDR4在胃癌中致癌作用的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了Northwestern印跡分析，以評(píng)估METTL1和WDR4敲減的AGS細(xì)胞中tRNA的m7G信號(hào)。結(jié)果表明，METTL1或WDR4的敲減降低了tRNA的m7G修飾（圖3A）。隨后，我們分析了METTL1敲減和陰性對(duì)照AGS細(xì)胞中全局tRNA m7G修飾的情況，并識(shí)別出在可變環(huán)中具有"VRRGGTY"基序序列的21種m7G修飾的tRNA（圖3B–D）。我們發(fā)現(xiàn)METTL1敲減導(dǎo)致這些識(shí)別出的tRNA的m7G信號(hào)和表達(dá)顯著降低，表現(xiàn)為較低的切割評(píng)分（圖3E）。此外，METTL1敲減顯著減少了大多數(shù)m7G修飾的tRNA的表達(dá)，而未修飾的tRNA不受影響（圖3F和G）。m7G Northwestern和Northern印跡分析也確認(rèn)了在METTL1敲減的胃癌細(xì)胞中，幾種代表性的m7G修飾的tRNA表達(dá)下調(diào)（圖3I）。相反，野生型METTL1的過表達(dá)（而非其催化失活突變體）上調(diào)了全局tRNA m7G修飾和幾種代表性的m7G修飾的tRNA的表達(dá)水平（圖3H），驗(yàn)證了METTL1通過其m7G甲基轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)tRNA修飾和表達(dá)。WDR4在胃癌細(xì)胞中的敲減或過表達(dá)產(chǎn)生了類似的效果（圖3H和I）?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明了METTL1和WDR4在tRNA m7G修飾和表達(dá)中的關(guān)鍵作用。我們進(jìn)一步研究了METTL1/WDR4介導(dǎo)的tRNA m7G修飾是否可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的mRNA翻譯。puromycin攝入分析顯示METTL1的耗竭減少了胃癌細(xì)胞的整體mRNA翻譯效率（TE）（圖3J）。此外，野生型METTL1的重新表達(dá)（而非其突變體）在METTL1敲減的AGS和MGC803細(xì)胞中恢復(fù)了mRNA翻譯效率（圖3J），表明METTL1在mRNA翻譯調(diào)節(jié)中的作用依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了METTL1/WDR4介導(dǎo)的tRNA m7G修飾在調(diào)節(jié)胃癌中mRNA翻譯的重要作用。

4）METTL1/WDR4以m7G相關(guān)密碼子依賴的方式促進(jìn)線粒體氧化磷酸化相關(guān)mRNA的翻譯

         為了確定由METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)控的關(guān)鍵下游mRNA，我們在METTL1敲減和對(duì)照AGS細(xì)胞上進(jìn)行了核糖體核酸復(fù)合物測序（RNC-seq），以識(shí)別翻譯效率差異的mRNA。我們的分析發(fā)現(xiàn)，有871個(gè)mRNA的翻譯效率降低（下調(diào)），而1179個(gè)mRNA的翻譯效率增加（上調(diào)）（圖4A）。隨后，我們進(jìn)行了密碼子頻率分析。與翻譯效率增加的mRNA相比，翻譯效率降低的mRNA具有更高比例的由m7G介導(dǎo)的tRNA解碼的密碼子（圖4B）。接下來，我們使用RNC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO和通路富集分析。翻譯效率低的mRNA在氧化磷酸化（OXPHOS）相關(guān)的生物學(xué)過程和與線粒體電子傳遞鏈（ETC）相關(guān)的通路中顯著富集，這些過程和通路被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵（圖4C）。為了確認(rèn)METTL1或WDR4的耗竭會(huì)破壞胃癌中的能量代謝，我們評(píng)估了ATP水平并進(jìn)行了細(xì)胞外氧消耗（EOC）測定。野生型METTL1的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞中的ATP合成和EOC，而METTL1的敲減則產(chǎn)生了相反的效果（圖4D–G）。此外，METTL1或WDR4耗竭的胃癌細(xì)胞中的總細(xì)胞ROS產(chǎn)生和線粒體ROS水平顯著上調(diào)，而在野生型METTL1或WDR4過表達(dá)時(shí)則下調(diào)（圖4H，4J）。同時(shí)，MitoTracker Green染色實(shí)驗(yàn)顯示，METTL1敲減導(dǎo)致AGS和MGC803細(xì)胞中線粒體形態(tài)異常，表現(xiàn)為線粒體變小、變圓、碎片化，正常的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受損（圖4L）。接下來，我們發(fā)現(xiàn)METTL1或WDR4的過表達(dá)會(huì)增加線粒體膜電位水平，而METTL1或WDR4的敲減則產(chǎn)生了相反的效果（圖4M，4N）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1以一種依賴于m7G相關(guān)密碼子的方式增強(qiáng)了與線粒體氧化磷酸化相關(guān)的基因的翻譯。

5）METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾通過增強(qiáng)GC中ETC II活性促進(jìn)氧化磷酸化和惡性進(jìn)展

         ETC對(duì)腫瘤生長至關(guān)重要。我們的RNC-seq結(jié)果顯示，METTL1敲減影響了呼吸電子傳遞和ETC相關(guān)復(fù)合物的組裝（圖4C）。因此，我們推測METTL1通過調(diào)節(jié)ETC活性促進(jìn)胃癌的OXPHOS和惡性進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)METTL1或WDR4敲減顯著降低了ETC II的活性，而對(duì)其他復(fù)合物的活性沒有影響（圖5A）。此外，西方印跡分析顯示，METTL1敲減降低了ETC II中的關(guān)鍵蛋白SDHB的表達(dá)水平，但對(duì)其他復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)沒有影響（圖5B）。相反，METTL1過表達(dá)增強(qiáng)了SDHB的表達(dá)（圖5B）。METTL1敲減阻礙了延胡索酸的產(chǎn)生并導(dǎo)致琥珀酸的積累，而METTL1過表達(dá)則產(chǎn)生了相反的效果，進(jìn)一步表明METTL1增強(qiáng)了ETC II的活性（圖5C）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明METTL1可能增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞中ETC II的活性。隨后，我們使用ETC II抑制劑α-生育酚（α-Toc；50μM）來抑制METTL1過表達(dá)的HGC-27和MKN1細(xì)胞中ETC II活性。我們發(fā)現(xiàn)METTL1過表達(dá)會(huì)增加胃癌細(xì)胞中的ATP水平、EOC、增殖和轉(zhuǎn)移能力，而ETC II抑制劑則產(chǎn)生了相反的效果。值得注意的是，用α-生育酚抑制ETC II的活性消除了METTL1過表達(dá)在胃癌細(xì)胞中引起的ATP水平、EOC、增殖和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)效果（圖5D–F）。這些結(jié)果證明了ETC II在介導(dǎo)METTL1在胃癌中的功能中的關(guān)鍵作用。

         ETC II由四個(gè)亞單位蛋白組成（SDHA、SDHB、SDHC和SDHD）。METTL1影響了SDHA和SDHB的表達(dá)，但并未影響SDHC或SDHD（圖5G）。我們在METTL1敲減的胃癌細(xì)胞中單獨(dú)過表達(dá)SDHA和SDHB，以及共同過表達(dá)兩者進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)。SDHA或SDHB的重新表達(dá)部分恢復(fù)了METTL1敲減的胃癌細(xì)胞中的ETC II活性、ATP水平、增殖和轉(zhuǎn)移能力，而同時(shí)過表達(dá)SDHA和SDHB則產(chǎn)生了更強(qiáng)的效果（圖5H，5I）。此外，我們評(píng)估了METTL1敲減對(duì)SDHA和SDHB mRNA水平和翻譯效率的影響。結(jié)果顯示，METTL1敲減后，SDHA和SDHB mRNA的水平及其翻譯效率沒有顯著變化（圖5J），這表明SDHA和SDHB不是直接由METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)控的?？紤]到SDHA和SDHB蛋白表達(dá)減少的主要原因是泛素化水平增加，我們接著檢查了METTL1敲減的胃癌細(xì)胞中SDHA和SDHB的泛素化水平。結(jié)果顯示，METTL1敲減可以促進(jìn)它們的泛素化水平，并減弱SDHA和SDHB之間的相互作用和結(jié)合（圖5K和S6E）。總的來說，這些結(jié)果表明METTL1通過增強(qiáng)胃癌中依賴SDHA和SDHB的ETC II活性，促進(jìn)氧化磷酸化和惡性進(jìn)展。

6）SDAHAF4是METTL1在GC中增強(qiáng)ETC II活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)

         鑒于METTL1并未影響胃癌細(xì)胞中SDHA或SDHB的翻譯效率，我們分析了RNC-seq數(shù)據(jù)，以確定由METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾直接調(diào)控的、與ETC II活性相關(guān)的關(guān)鍵靶基因。我們發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞呼吸和線粒體ETC復(fù)合物II組裝的SDHAF4基因含有高豐度的m7G tRNA解碼密碼子。因此，我們假設(shè)SDHAF4是METTL1在胃癌中增強(qiáng)ETC II活性的關(guān)鍵靶基因。SDHAF4的翻譯效率在METTL1敲減的細(xì)胞中降低，而其mRNA水平保持不變，表明METTL1/WDR4通過m7G tRNA修飾調(diào)控SDHAF4的表達(dá)（圖6A）。此外，METTL1或WDR4耗竭時(shí)，胃癌細(xì)胞和異種移植腫瘤中的SDHAF4蛋白水平降低（圖6B，6C）為了加強(qiáng)我們的結(jié)論，即METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾通過調(diào)控SDHAF4的翻譯和表達(dá)增強(qiáng)了胃癌中ETC II的活性和惡性進(jìn)展，我們在METTL1過表達(dá)的HGC-27細(xì)胞中使用了針對(duì)SDHAF4的siRNA，并通過西方印跡定量蛋白水平（圖6D）。SDHAF4的敲減顯著抑制了METTL1過表達(dá)引起的ATP水平、EOC、ETC II活性和細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的增加（圖6E–G）。相應(yīng)地，METTL1敲減的MKN1細(xì)胞中恢復(fù)SDHAF4表達(dá)挽救了這些因素（圖6E，6H，6I）。在皮下異種移植模型中，接受MKN45-shM1#1細(xì)胞治療的小鼠腫瘤進(jìn)展比接受MKN45-shNC細(xì)胞治療的小鼠慢。值得注意的是，SDHAF4的過表達(dá)減弱了METTL1敲減對(duì)腫瘤進(jìn)展的抑制效果（圖6J）。此外，METTL1敲減降低了Ki-67、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達(dá)，而過表達(dá)SDHAF4則逆轉(zhuǎn)了METTL1敲減對(duì)Ki-67、SDHA和SDHB表達(dá)的抑制效果（圖6K）。同樣，METTL1敲減組的肺轉(zhuǎn)移顯著減少，而在體內(nèi)重新過表達(dá)SDHAF4部分恢復(fù)了這些特性（圖6L）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明SDHAF4對(duì)于METTL1增強(qiáng)胃癌中依賴SDHA和SDHB的ETC II活性和惡性進(jìn)展至關(guān)重要。

7）靶向METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸可能是一種很有前景的GC治療策略

         最后，我們評(píng)估了針對(duì)METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸的治療是否可以作為胃癌的潛在治療方法，以及這個(gè)軸是否對(duì)胃癌患者具有臨床意義。METTL1的過表達(dá)顯著加速了胃癌的進(jìn)展，而α-生育酚對(duì)腫瘤生長表現(xiàn)出抑制效果，表明α-生育酚可能是高METTL1表達(dá)的胃癌患者的可行治療選擇（圖7A）。免疫組化證實(shí)，METTL1過表達(dá)時(shí)Ki-67、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達(dá)增加，而α-生育酚治療逆轉(zhuǎn)了這一效果（圖7B）。在肺轉(zhuǎn)移模型中，METTL1在體內(nèi)顯著促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移，而α-生育酚治療減輕了這種效果（圖7C）。Kaplan–Meier分析顯示，SDHAF4、SDHA和SDHB水平與胃癌患者的預(yù)后不良呈正相關(guān)（圖7D–F）。METTL1、SDHAF4、SDHA和SDHB的表達(dá)水平之間存在正相關(guān)（圖7G–I）。此外，免疫組化染色驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)（圖7J）。總的來說， METTL1/m7G/SDHAF4/SDHA/SDHB/ETC II軸在胃癌生長和轉(zhuǎn)移中廣泛參與，這表明針對(duì)這個(gè)軸的治療可能作為胃癌治療的充滿希望的治療策略。

結(jié)論：

         我們的研究闡明了METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在胃癌進(jìn)展中的致癌作用。此外，我們通過綜合的體外、體內(nèi)和臨床樣本數(shù)據(jù)揭示了通過m7G tRNA修飾在胃癌中調(diào)控特定mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為針對(duì)胃癌開發(fā)治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         qPCR，Northern，northwestern，western blotting，IHC，TRAC-seq，RNC- seq。

參考文獻(xiàn)：

         Xu X, Huang Z, Han H, Yu Z, Ye L, Zhao Z, Qian Y, Li Y, Zhao R, Zhang T, Liu Y, Cai J, Lin S, Zhai E, Chen J, Cai S. N7-methylguanosine tRNA modification promotes gastric cancer progression by activating SDHAF4-dependent mitochondrial oxidative phosphorylation. Cancer Lett. 2025 Apr 10;615:217566. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217566.