KLF5-糖尿病傷口愈合的靶點(diǎn)

         脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs）已被證明可以通過促進(jìn)新血管生成來加速糖尿病性傷口愈合，盡管其背后的機(jī)制尚未完全了解。本研究旨在探討ADSCs是否通過影響內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的功能來增強(qiáng)糖尿病性傷口愈合。我們構(gòu)建了一個(gè)包含75個(gè)基因的新血管生成相關(guān)特征簽名（NRS）。GO和KEGG分析揭示，NRS主要參與血管發(fā)育和受體-配體活性。確定了七個(gè)樞紐基因（CD34、CXCL12、FGF7、FGF18、FGF1、TEK、KIT）并進(jìn)行驗(yàn)證。在糖尿病小鼠模型中，ADSCs中的CXCL12敲減降低了它們促進(jìn)傷口愈合和血管新生的能力。與正常組織相比，糖尿病潰瘍患者和糖尿病小鼠傷口組織的KLF5表達(dá)較低，而ADSCs治療顯著增加了糖尿病小鼠傷口中的KLF5表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告分析確認(rèn)KLF5是CXCL12的上游轉(zhuǎn)錄因子。此外，ADSCs中敲減KLF5損害了它們對(duì)糖尿病傷口愈合的治療效果。在體外，添加外源性CXCL12重組蛋白在ADSCs中沉默KLF5后，在高糖環(huán)境下恢復(fù)了EPCs的增殖、遷移和血管生成能力。我們的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了KLF5在增強(qiáng)ADSCs中CXCL12轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵作用，從而促進(jìn)EPC介導(dǎo)的血管新生并改善糖尿病傷口愈合。此外，KLF5作為一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)，有望加速糖尿病傷口的組織修復(fù)。本文于2025年3月發(fā)表于“Cellular & Molecular Biology Letters”（IF=9.2）上。

技術(shù)路線 

結(jié)果：

1）ADSCs促進(jìn)糖尿病小鼠傷口新生血管和加速修復(fù)的潛在機(jī)制

         為了探索ADSCs在糖尿病傷口修復(fù)中促進(jìn)血管新生的潛在機(jī)制，我們使用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了在高糖（HG）和低糖（LG）條件下處理人ADSCs 48小時(shí)后的mRNA表達(dá)變化。共鑒定出80個(gè)上調(diào)和269個(gè)下調(diào)的mRNAs，如火山圖和熱圖所示（圖1A，B）。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到包含4830個(gè)基因的與血管新生相關(guān)的基因。通過將349個(gè)DEGs與血管新生相關(guān)基因相交，確定了75個(gè)共享基因以構(gòu)建新血管生成相關(guān)特征簽名（NRS）（圖1C）。GO富集分析（圖1D）和KEGG通路分析（圖1E）用以檢查NRS與特定的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）及通路的關(guān)系。分析結(jié)果顯示，NRS涉及與缺氧反應(yīng)和氧氣水平降低相關(guān)的BP。CC和MF與含有膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)，并參與生長(zhǎng)因子活性、糖胺聚糖結(jié)合和跨膜受體蛋白激酶活性。KEGG通路分析表明，在如下通路中顯著富集：PI3K-Akt、MAPK、鈣信號(hào)傳導(dǎo)、Ras信號(hào)傳導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)和Rap1信號(hào)通路。為了探索蛋白質(zhì)相互作用，我們使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了NRS的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果是一個(gè)包含46個(gè)節(jié)點(diǎn)和116條邊的網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape進(jìn)行可視化（圖1F）。在cytoHubba插件中使用五種算法篩選出了前十個(gè)樞紐基因。通過取所有算法中前十個(gè)基因的交集，確定了七個(gè)樞紐基因（CD34、CXCL12、FGF7、FGF18、FGF1、TEK和KIT）（圖1G）。免疫熒光染色顯示，與正常皮膚相比，糖尿病潰瘍患者的傷口組織中的CXCL12表達(dá)顯著減少（圖1H）。特別是CXCL12，由于其潛在的重要性，被選為進(jìn)一步初步研究的對(duì)象。

2）ADSCs的表征和CXCL12敲除的驗(yàn)證

         ADSCs在單層中以成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)生長(zhǎng)良好（圖2A）。它們的分化潛能通過油紅O對(duì)脂肪細(xì)胞的陽性染色（圖2B）、阿利辛藍(lán)對(duì)軟骨細(xì)胞的陽性染色（圖2C）和茜素紅對(duì)骨細(xì)胞的陽性染色（圖2D）得到確認(rèn)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，ADSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29（98.58%）和CD90（98.30%），并且造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34（2.67%）和CD45（0.69%）的表達(dá)最小，確認(rèn)了ADSCs的成功分離（圖2E）。為了在實(shí)驗(yàn)期間保持細(xì)胞的一致性，使用了第3至第6代（P3–P6）的ADSCs。為了進(jìn)一步研究CXCL12的生物效應(yīng)，用靶向CXCL12的慢病毒shRNA轉(zhuǎn)染ADSCs。通過RT-qPCR、western blot和ELISA驗(yàn)證了敲減效率，這些方法都表明ADSCs中CXCL12的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低（圖2F–I）。

3）ADSCs通過CXCL12促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合和新生血管形成

         成功建立了糖尿病小鼠模型，每個(gè)小鼠背部創(chuàng)建了一個(gè)圓形的全層皮膚缺損傷口，如圖3A所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，接受shNC ADSCs或重組CXCL12（rCXCL12）治療的小鼠傷口愈合顯著加速。然而，下調(diào)CXCL12表達(dá)抑制了ADSCs對(duì)傷口愈合的治療效果（圖3B–D）。HE染色（圖4A, B）和Masson三色染色（圖4C, D）表明，用shNC ADSCs或rCXCL12治療顯著增加了糖尿病小鼠受損組織的上皮厚度并增強(qiáng)了膠原蛋白沉積。相比之下，用sh-CXCL12 ADSCs治療的組在上皮化和傷口床的膠原蛋白排列方面顯著減少。CD31和α-SMA的免疫染色（圖4E, F）表明，在shNC ADSCs和rCXCL12組中血管生成增強(qiáng)，而CXCL12沉默逆轉(zhuǎn)了shNC ADSCs的促血管生成作用。這些結(jié)果提示，ADSCs主要通過CXCL12顯著刺激傷口愈合，改善重新上皮化，增加膠原蛋白沉積，并在糖尿病傷口中促進(jìn)新血管生成。

4）KLF5作為CXCL12的上游轉(zhuǎn)錄因子

         為了闡明ADSCs中的CXCL12促進(jìn)糖尿病傷口愈合的機(jī)制，我們研究了其上游調(diào)控分子。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了CXCL12的潛在上游轉(zhuǎn)錄因子，揭示了幾種候選分子：KLF5、NFKB1、CREB1、RELA、STAT3、E2F1、PPARG、TFAP2C和TFAP2A。由于KLF5可能涉及糖尿病傷口愈合，我們重點(diǎn)關(guān)注了KLF5。免疫組化染色證實(shí)，糖尿病潰瘍患者和糖尿病小鼠的傷口組織中KLF5表達(dá)較低（圖5A, B）。值得注意的是，在ADSC治療后，糖尿病小鼠傷口組織中的KLF5表達(dá)顯著增加（圖5B）。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫，我們篩選了CXCL12的啟動(dòng)子區(qū)域，并在CXCL12 5' UTR上游的1399 bp區(qū)域內(nèi)鑒定出79個(gè)潛在的KLF5結(jié)合位點(diǎn)。為了確定KLF5是否通過啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)CXCL12的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因分析。KLF5的過表達(dá)導(dǎo)致熒光素酶活性增加，表明CXCL12啟動(dòng)子被激活（圖5C）。通過分別用sh-KLF5和shNC慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，生成了穩(wěn)定的KLF5敲減和對(duì)照ADSCs。Western blot分析確認(rèn)了敲減效率（圖5D, E）。ELISA測(cè)量結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，KLF5敲減ADSCs中的CXCL12表達(dá)顯著降低（圖5F）。這些結(jié)果提示KLF5直接結(jié)合到CXCL12的啟動(dòng)子上并激活其分泌。

5）KLF5下調(diào)損害糖尿病傷口愈合

         為了評(píng)估KLF5在ADSCs治療效果中的作用，我們建立了一個(gè)糖尿病小鼠傷口模型并應(yīng)用了不同的治療方案（圖6A）。與shNC ADSCs組相比，接受sh-KLF5 ADSCs治療的小組傷口愈合率顯著降低，表明KLF5敲減抑制了ADSC介導(dǎo)的糖尿病小鼠傷口愈合（圖6B–D）。HE染色顯示，sh-KLF5 ADSCs組的傷口上皮化明顯減少，類似于DM組（圖7A, B）。Masson三色染色顯示，與shNC ADSCs組相比，sh-KLF5 ADSCs組的膠原沉積減少且排列紊亂（圖7C, D）。此外，通過CD31和α-SMA的免疫熒光染色確認(rèn)，與shNC ADSCs組相比，sh-KLF5 ADSCs組傷口區(qū)域的血管新生顯著減少（圖7E, F）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了KLF5在ADSCs對(duì)糖尿病傷口愈合的治療效果中的關(guān)鍵作用。

6）ADSCs調(diào)節(jié)KLF5/CXCL12通路，增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移和血管生成能力

         為了研究ADSCs對(duì)EPCs細(xì)胞功能的影響，我們建立了一個(gè)體外HG模型。EdU實(shí)驗(yàn)表明，與shNC ADSCs或rCXCL12共培養(yǎng)24小時(shí)后，與DM組相比，EPCs的增殖能力顯著提高。當(dāng)ADSCs中的KLF5或CXCL12表達(dá)被下調(diào)時(shí)，這種增強(qiáng)作用被抑制。值得注意的是，在ADSCs中敲減KLF5后添加rCXCL12恢復(fù)了EPCs的增殖能力（圖8A–D）。EPCs的遷移和成血管能力也觀察到了類似趨勢(shì)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和管形成實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)與sh-KLF5 ADSCs共培養(yǎng)時(shí)，rCXCL12顯著增加了EPCs的遷移和成血管能力（圖8E–L）。免疫熒光染色揭示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病患者的EPCs表面標(biāo)志物CD133的表達(dá)略有降低。相比之下，CXCR7和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31在糖尿病潰瘍患者的傷口組織中的水平顯著低于正常皮膚。在正常對(duì)照組中，CXCR7陽性細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)與CD133陽性細(xì)胞高度共定位（圖8M）。CXCR7和CD31的減少表明糖尿病潰瘍傷口組織中的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，這可能阻礙EPC的分化并損害血管新生過程。糖尿病患者EPCs表面CXCR7表達(dá)的減少可能有助于這些影響。

結(jié)論：

         局部應(yīng)用ADSCs顯著增強(qiáng)了糖尿病傷口的愈合，其中KLF5通過上調(diào)CXCL12促進(jìn)血管新生，發(fā)揮了關(guān)鍵作用。CXCL12表達(dá)的增加刺激了EPC的增殖、遷移和成血管能力，這些對(duì)于有效的傷口修復(fù)都至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)針對(duì)KLF5/CXCL12途徑的新治療策略，以改善糖尿病傷口的治療提供了寶貴的見解。

實(shí)驗(yàn)方法：

         RNA測(cè)序，ELISA，Western blot，RT?qPCR，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，Transwell，管形成實(shí)驗(yàn)，免疫組化，免疫熒光，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

參考文獻(xiàn)：

         Xie Y, Ni X, Wan X, Xu N, Chen L, Lin C, Zheng X, Cai B, Lin Q, Ke R, Huang T, Hu X, Wang B, Shan X. KLF5 enhances CXCL12 transcription in adipose-derived stem cells to promote endothelial progenitor cells neovascularization and accelerate diabetic wound healing. Cell Mol Biol Lett. 2025 Mar 4;30(1):24. doi: 10.1186/s11658-025-00702-0.