活化的 AXL 通過抑制 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡改善酒精相關(guān)性脂肪肝缺血再灌注損傷

        肝臟缺血再灌注（I/R）損傷會導(dǎo)致肝移植和肝切除術(shù)的預(yù)后不良，尤其是酒精相關(guān)性肝病（ALD）患者。細(xì)胞凋亡與肝損傷的不同階段密切相關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和線粒體平衡紊亂導(dǎo)致的肝細(xì)胞死亡可能是肝損傷的關(guān)鍵。由基因axl 編碼的受體酪氨酸激酶AXL 是TAM（TYRO3、AXL和MERTK）家族的成員，它通過與生長停滯特異性蛋白6（Gas6）的配體結(jié)合參與各種生物過程。然而，AXL是否參與細(xì)胞凋亡通路，以及其在肝臟I/R 損傷中的具體機(jī)制仍不清楚。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)在肝移植的人肝組織中，I/R后總AXL 上調(diào)，而磷酸化AXL（p-AXL，AXL的活性形式）下調(diào)。同樣，在小鼠肝臟I/R 損傷過程中，發(fā)現(xiàn)總AXL 上調(diào)，而p-AXL 下調(diào)。在小鼠肝臟I/R 損傷過程中，Gas6的預(yù)處理增加p-AXL的表達(dá)，減少ER 應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡，減輕肝損傷，并恢復(fù)ER和線粒體的超微結(jié)構(gòu)。此外，通過ALD模型發(fā)現(xiàn)ALD小鼠的p-AXL水平較低，更容易受到肝臟I/R損傷。重要的是，活化的AXL通過抑制IRE1和PERK通路來減少ER應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡，從而改善肝損傷?？傊?，活化的AXL通過抑制ER應(yīng)激和線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)酒精相關(guān)性脂肪變性肝臟免受I/R損傷。該研究于2025年1月發(fā)表在《International Journal of Biological Sciences》，IF：8.2。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.肝臟 AXL 的磷酸化在 I/R 損傷期間下調(diào)

        為了研究總AXL/p-AXL在手術(shù)缺血條件下是否失調(diào)，以及它們是否參與了人類肝臟I/R損傷，檢測它們在供體移植物肝臟活檢組織和對照組中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，供體肝臟中總 AXL 的表達(dá)水平高于對照組，而 p-AXL 的表達(dá)趨勢則相反（圖 1A-C）。為了探討肝臟 I/R 期間總 AXL/p-AXL 的變化趨勢，我們構(gòu)建了缺血 60 分鐘后不同再灌注時間的小鼠模型。小鼠血清中的肝酶（ALT/AST）水平在I/R損傷后6小時前逐漸升高，之后隨著時間的推移逐漸恢復(fù)（圖1D）。同樣，AXL的總表達(dá)也在6小時達(dá)到峰值，然后逐漸恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。在此過程中，p-AXL 的表達(dá)在 6 h 時最低（圖 1E&F）。同時，我們在體外對原代肝細(xì)胞進(jìn)行 OGD/R 處理，總 AXL/p-AXL 的表達(dá)與小鼠肝 I/R 期間觀察到的趨勢相同（圖 1G&H）。令人印象深刻的是，檢測肝臟 I/R 小鼠血清中的可溶性 AXL（sAXL）發(fā)現(xiàn) sAXL 大大升高?？扇苄?span> AXL 是總 AXL 的裂解產(chǎn)物，沒有生理活性，但可以競爭性阻斷 AXL 受體。這一結(jié)果為肝臟 I/R 期間總 AXL 的增加和 p-AXL 的減少提供了解釋（圖 1I）。因此，在肝臟 I/R 期間，AXL 的磷酸化會減少。

圖1.肝臟AXL 的磷酸化在I/R 損傷期間下調(diào)

2.活化的 AXL 通過抑制細(xì)胞凋亡防止肝臟 I/R 損傷

        為探討AXL抑制是否會導(dǎo)致I/R損傷及其詳細(xì)機(jī)制，使用外源性rmGas6腹腔注射激活AXL。與人體樣本的研究結(jié)果一致，肝臟 I/R 小鼠體內(nèi) p-AXL 的表達(dá)量減少。當(dāng)用rmGas6激活AXL時，p-AXL水平的升高表明AXL被激活了（圖2A）。與假手術(shù)組相比，肝I/R損傷導(dǎo)致肝損傷和血清中ALT和AST水平升高，而注射rmGas6可逆轉(zhuǎn)這些影響。同樣，AXL 的特異性抑制劑 R428 會顯著加劇肝壞死面積以及 ALT 和 AST 血清水平的升高（圖 2B-D）。此外，肝臟 I/R 小鼠體內(nèi)促凋亡蛋白裂解的 Caspase-3（Caspase-3 的活性形式）水平升高，而使用 rmGas6 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)這些趨勢。肝組織切片的TUNEL檢測和裂解的Caspase-3免疫組化染色也證實(shí)，活化的AXL通過抑制體內(nèi)細(xì)胞凋亡保護(hù)肝臟免受I/R損傷（圖2E-H）。這些數(shù)據(jù)表明，激活 AXL 可通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)肝臟免受 I/R 損傷。

圖2.活化的AXL 通過抑制細(xì)胞凋亡防止肝臟I/R 損傷

3.活化的 AXL 可減輕肝臟 I/R 損傷過程中的 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡

        為進(jìn)一步研究AXL是否會影響肝臟I/R過程中的ER，用TEM檢測肝組織的超微結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)ER 在 I/R 后出現(xiàn)異常，擴(kuò)張、空泡化和片狀折疊管狀結(jié)構(gòu)消失。rmGas6預(yù)處理組的損傷得到緩解，ER結(jié)構(gòu)相對完整，而R428則加劇IR誘導(dǎo)的損傷（圖3A）。Western 印跡結(jié)果顯示，BiP、CHOP 和裂解的 Caspase-12（Caspase-12 的活性形式）水平上調(diào)，這表明肝 I/R 導(dǎo)致 ER 應(yīng)激及其相關(guān)的細(xì)胞凋亡。然而，rmGas6預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了這些影響，R428預(yù)處理加重IR誘導(dǎo)的過度ER應(yīng)激和細(xì)胞凋亡（圖3B&C）。肝組織 CHOP 染色免疫組化也表明，rmGas6 預(yù)處理可抑制 CHOP 上調(diào)，從而減輕肝損傷（圖 3D）。在真核細(xì)胞中，有三種ER跨膜蛋白介導(dǎo)典型的UPR：兩種激酶IRE1和PERK，以及轉(zhuǎn)錄因子前體ATF6。至于細(xì)胞凋亡效應(yīng)，前兩個激酶 IRE1 和 PERK 主要參與其中。Western 印跡分析發(fā)現(xiàn)，肝臟 I/R 使磷酸化-IRE1（p-IRE1，IRE1 的活性形式）及其下游效應(yīng)物 XBP1s、磷酸化-PERK（p-PERK，PERK 的活性形式）及其下游 ATF4 水平升高，而 rmGas6 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)所有這些趨勢（圖 3E）。因此，這些研究結(jié)果表明，活化的AXL可抑制ER應(yīng)激中UPR的IRE1和PERK分支，從而保護(hù)肝臟免受I/R損傷。值得注意的是，TEM 觀察到的超微結(jié)構(gòu)變化也表明 I/R 后線粒體腫脹和嵴模糊，而活化的 AXL 也能顯著恢復(fù)線粒體的超微結(jié)構(gòu)（圖 3A）。作為內(nèi)源性凋亡的經(jīng)典途徑，作者還研究了 p-AXL 是否在線粒體相關(guān)凋亡中發(fā)揮作用。結(jié)果顯示，在小鼠肝臟 I/R 損傷過程中，活化的 AXL 可抑制裂解的 Caspase-9（Caspase-9 的活性形式）和 Bax 的水平，同時增加 Bcl-2 的表達(dá)（圖 3F&G）。所有這些都證實(shí)，激活AXL可減輕肝臟I/R損傷過程中的ER應(yīng)激和線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

圖3.活化的AXL 可減輕肝臟I/R 損傷過程中的ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡

4.在體外 OGD/R 過程中，激活 AXL 可減輕 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)肝細(xì)胞凋亡

        與圖 3 所示的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，OGD/R 誘導(dǎo)的 ER 應(yīng)激導(dǎo)致終末 UPR 信號（如 BiP、CHOP 和 Caspase-12）反應(yīng)，而 rmGas6 在體外的預(yù)處理可減輕這種反應(yīng)（圖 4A）。熊去氧膽酸（TUDCA）是一種公認(rèn)的ER應(yīng)激抑制劑，它能以劑量依賴的方式充分阻斷OGD/R處理的肝細(xì)胞中的ER應(yīng)激反應(yīng)（圖4B）。正如預(yù)期的那樣，用 rmGas6 激活的 AXL 能顯著抑制體外經(jīng) OGD/R 處理的原代肝細(xì)胞中 p-IRE1、XBP1s、p-PERK 和 ATF4 的水平（圖 4C）。用 rmGas6 預(yù)處理的效果與 TUDCA 相似，而且 TUDCA 的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)了 R428 的有害影響（圖 4D）。此外，rmGas6預(yù)處理通過降低體外OGD/R誘導(dǎo)的線粒體相關(guān)肝細(xì)胞凋亡中裂解的Caspase-9和Bax的表達(dá)，同時提高Bcl-2的水平，阻礙了OGD/R誘導(dǎo)的線粒體相關(guān)肝細(xì)胞凋亡（圖4E）。此外，原代肝細(xì)胞中 JC-1 的免疫熒光染色也表明 OGD/R 期間線粒體膜電位（MMP）降低，表現(xiàn)為 JC-1 聚集體（紅色熒光）減少，JC-1 單體（綠色熒光）增加。值得注意的是，rmGas6 預(yù)處理可恢復(fù) MMP，這也表明活化的 AXL 可減輕肝 I/R 損傷期間線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡（圖 4F）。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)，rmGas6 和 TUDCA 預(yù)處理均可減少 OGD/R 誘導(dǎo)的線粒體凋亡（圖 4F）。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)，rmGas6 和 TUDCA 預(yù)處理均可減少 OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖 4G）。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證 p-AXL 在原代肝細(xì)胞 OGD/R 過程中抑制 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

圖4.在體外OGD/R 過程中，激活AXL 可減輕ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)肝細(xì)胞凋亡

5.ALD小鼠肝臟中磷酸化AXL下調(diào)，對I/R損傷的易感性增加

        一些接受肝切除術(shù)的患者或患有ALD的供體出現(xiàn)肝切除術(shù)后肝功能衰竭的風(fēng)險較高，因?yàn)檫@兩種情況都會加重I/R損傷。因此，采用慢性加暴飲暴食酒精（Gao-binge）喂養(yǎng)，然后進(jìn)行I/R手術(shù)的方法來研究乙醇相關(guān)脂肪變性的肝臟I/R損傷（圖S2A）。觀察到 ALD 小鼠肝臟的宏觀變黃、腫大和龜甲紋細(xì)節(jié)（圖 S2B）。組織病理學(xué)研究顯示，與等熱量配對飼養(yǎng)的小鼠（配對組）相比，ALD 小鼠（ALD 組）出現(xiàn)了明顯的微小骨質(zhì)疏松和大骨質(zhì)疏松，以及肝細(xì)胞氣球化（圖 5A）。油紅 O 染色也證實(shí)了ALD 小鼠嚴(yán)重的肝臟脂肪變性和脂質(zhì)堆積（圖 5B）。ALD 小鼠血清中的 ALT/AST 水平也有所升高（圖 5C）。免疫組化染色顯示，在大量長期飲酒導(dǎo)致的終末期肝病患者的肝臟中，p-AXL 的表達(dá)下調(diào)（圖 5D）。Western 印跡證實(shí) p-AXL 水平在 ALD 小鼠肝臟（圖 5E）中下調(diào)。此外，與配對組相比，TEM 顯示 ALD 小鼠肝臟中有脂滴、相對擴(kuò)張的 ER 管腔、腫脹的線粒體和模糊的嵴（圖 5F）。更重要的是，與配對組相比，ALD小鼠在I/R后出現(xiàn)了更嚴(yán)重的肝損傷，壞死面積更大，血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT/AST）水平更高（圖5G&H）。此外，與Pair組相比，ALD小鼠肝臟I/R后p-AXL水平下調(diào)，而裂解的Caspase-12、裂解的Caspase-9和裂解的Caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖5I）。TEM顯示，與Pair組相比，ALD小鼠肝臟中的ER擴(kuò)張、線粒體腫脹和空泡變性更為嚴(yán)重（圖5J）?？傊@些研究有力地證明酒精相關(guān)肝病誘導(dǎo)ER應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡，增加小鼠肝臟對I/R損傷的易感性，而p-AXL可能參與發(fā)病機(jī)制。

圖5.ALD小鼠肝臟中磷酸化AXL下調(diào)，對I/R損傷的易感性增加

6.通過減少 ALD 小鼠的 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡，激活 AXL 可減輕肝臟 I/R 損傷

        如上所述，ALD 小鼠因ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡而遭受更嚴(yán)重的肝臟 I/R 損傷。接下來研究活化的 AXL 對 ALD 小鼠的 I/R 損傷是否也有保護(hù)作用。rmGas6預(yù)處理可減輕紅外誘導(dǎo)的肝損傷，這表現(xiàn)在壞死面積減少（圖 6A&B）和血清轉(zhuǎn)氨酶水平（ALT/AST）降低（圖 6C）。此外，用 rmGas6 預(yù)處理可減輕 ALD 小鼠肝臟 I/R 損傷過程中線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡（圖 6D），還可減少 ER 應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡（圖 6E）。此外，TUNEL也表明，AXL的激活減少了IR誘導(dǎo)的小鼠肝組織凋亡（圖6F）。此外，TEM直觀地顯示，rmGas6預(yù)處理有助于ER和線粒體從肝臟I/R損傷中恢復(fù)。相反，用 R428 抑制 AXL 會加劇 ER 的擴(kuò)張和細(xì)胞凋亡，從而大大加重肝臟 I/R 損傷（圖 6G）。綜上所述，這些研究為活化的AXL在ALD小鼠肝臟I/R損傷過程中抑制ER應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡的保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

圖6.通過減少ALD 小鼠的ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)凋亡，激活AXL 可減輕肝臟I/R 損傷

結(jié)論

        綜上所述，本研究表明，激活 AXL 可抑制 ER 應(yīng)激和線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)酒精性脂肪肝免受缺血再灌注損傷。這些研究結(jié)果表明，以AXL為靶點(diǎn)可能是治療肝臟缺血再灌注損傷的一種有前途的策略，特別是對于酒精性脂肪肝的邊緣肝臟供體。

實(shí)驗(yàn)方法

        基因和蛋白表達(dá)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、Western blot、免疫組化、免疫熒光染色、細(xì)胞培養(yǎng)、OGD/R模型構(gòu)建、細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)、肝臟I/R模型構(gòu)建、ALD模型構(gòu)建、肝功能分析、組織病理學(xué)檢查、透視電子顯微鏡

參考文獻(xiàn)

        Fang Q, Yan Q, Liu X, Zhang X, Zha L, Zhang R, Gao Z, Du J, Chen L. Activated AXL Ameliorates Alcohol-associated Steatotic Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting ER stress and Mitochondria-associated Apoptosis. Int J Biol Sci. 2025 Jan 20;21(3):1294-1307. doi: 10.7150/ijbs.103789. PMID: 39897049; PMCID: PMC11781187.