lncRNA新發(fā)現(xiàn)：PART1與ADAMTS9-AS2拮抗調(diào)控前列腺癌AR信號(hào)及細(xì)胞衰老機(jī)制
前列腺癌（PCa）最初是一種激素依賴性疾病，其發(fā)展和擴(kuò)散與雄激素受體（AR）信號(hào)活性緊密相關(guān)。針對(duì) AR 通路的治療，如使用 AR 拮抗劑和雙極雄激素療法中采用的超生理雄激素水平（SAL），是治療 PCa 的標(biāo)準(zhǔn)方法。在此，作者通過檢測(cè) PCa 標(biāo)本、觀察對(duì) AR 拮抗劑或 SAL 的反應(yīng)，以及進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）PART1 和 ADAMTS9-AS2 在一定程度上介導(dǎo)了 PCa 細(xì)胞中的雄激素信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)果顯示PART1 和 ERVH48-1 在 TT 樣本中顯著高表達(dá)，而 ADAMTS9-AS2 在 TT 樣本中的表達(dá)低于 NTAT 樣本。SAL 處理在兩種人類 PCa 細(xì)胞系和患者腫瘤樣本中呈現(xiàn)出相反的調(diào)控作用：ADAMTS9-AS2 表達(dá)上調(diào)，PART1 表達(dá)受抑制。此外，研究數(shù)據(jù)表明，ADAMTS9-AS2 可能作為 AR 信號(hào)的共激活因子，而 PART1 則作為共抑制因子。有趣的是，敲低實(shí)驗(yàn)顯示，ADAMTS9-AS2 和 PART1 均能調(diào)節(jié) AR 活性、蛋白水平，以及 SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)過程。因此，數(shù)據(jù)表明 ADAMTS9-AS2 和 PART1 在 SAL 條件下對(duì) AR 信號(hào)傳導(dǎo)起到調(diào)控作用。這篇文章于2025年3月發(fā)表于《International Journal of Surgery》期刊上，IF:12.5。
研究技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、患者前列腺癌樣本中的差異表達(dá)
PART1 在腫瘤組織（TT）與正常對(duì)照（NC）之間，以及 TT 與腫瘤旁正常組織（NTAT）之間的表達(dá)存在差異（圖 1）。ADAMTS9-AS2 在 NTAT 樣本中的表達(dá)高于 TT 和 NC 樣本。C1QTNF3-AMACR 在三組樣本中的表達(dá)沒有差異。C8orf34-AS1 在 NC 樣本中的表達(dá)高于其他組樣本。ERVH48-1在所有三組比較（TT/NC、TT/NTAT 和 NC/NTAT）中的表達(dá)均存在差異。最后，KIAA0087 和 ENO1-AS1 在 TT 與 NC 之間，以及 NC 與 NTAT 之間的表達(dá)水平不同（圖 1）。
圖 1. 比較正常對(duì)照組織（NC）、腫瘤旁正常組織（NTAT）和前列腺腫瘤組織（TT）中所選 lncRNA 基因的不同表達(dá)模式
PART1 和 ERVH48-1 在 TT 樣本中的表達(dá)水平高于 NTAT 樣本（表達(dá)比值分別為13.1 和 3.6；P 值分別 < 0.0001 和 0.04）。值得注意的是，PART1、KIAA0087、ERVH48-1、C8orf34-AS1 和 ENO1-AS1 在 TT 樣本中的表達(dá)低于 NC 樣本（P 值分別為 0.0002、<0.0001、<0.0001、<0.0001 和 0.04）。雖然 PART1、KIAA0087、ERVH48-1、C8orf34-AS1 和 ENO1-AS1 在 NTAT 樣本中的表達(dá)低于 NC 樣本，但 ADAMTS9-AS2 在 NTAT 樣本中的表達(dá)高于 NC 樣本（表達(dá)比值（95% 置信區(qū)間） = 135（27.3 - 670），P 值 < 0.0001）。詳細(xì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表 S4。這些數(shù)據(jù)表明，除C1QTNF3-AMACR 外，分析的基因在這些樣本中均表現(xiàn)出顯著不同的表達(dá)水平?；?span> NTAT 和 NC 之間三個(gè)基因表達(dá)的顯著差異，數(shù)據(jù)還表明，NTAT 樣本衍生的數(shù)據(jù)不能總是被視為非腫瘤對(duì)照。
在 TT、NTAT 和 NC 樣本中，PART1、KIAA0087、ADAMTS9-AS2、C1QTNF3-AMACR、ERVH48-1、C8orf34-AS1 和 ENO1-AS1 的表達(dá)水平之間存在顯著的成對(duì)相關(guān)性。最強(qiáng)的相關(guān)性出現(xiàn)在 ENO1-ASI和 KIAA0087 之間（相關(guān)系數(shù) = 0.95）；以及 C8orf34-AS1 與另外兩個(gè) lncRNA，即 KIAA0087 和 ERVH48-1 在 TT 樣本中的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù) = 0.95）。同樣，在這些樣本中，ENO1-ASI 的表達(dá)水平與 PART1 和 C8orf34-AS1 的表達(dá)水平相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0.94。然后，作者使用層次聚類方法（Ward 法，歐氏距離）根據(jù)表達(dá)水平將lncRNA 分為四個(gè)簇。C1QTNF3-AMACR和 ADAMTS9-AS2 聚為一組；而 ERVH48-1 和 C8orf34-AS1 被識(shí)別為聚在另一組。最后，PART1 和 KIAA0087 構(gòu)成了另一個(gè)簇。值得注意的是，大多數(shù)患者樣本（TT1-TT50 和 NTAT1-NTAT50）中分析的 lncRNA 表達(dá)水平降低。
受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，KIAA0087在區(qū)分 TT 與 NC 樣本（AUC = 0.96）以及 NTAT 與 NC 樣本（AUC = 0.93）方面表現(xiàn)出色。此外，ERVH48-1 在區(qū)分 TT 樣本與 NC 樣本（AUC = 0.91）以及 NTAT 樣本與 NC 樣本（AUC = 0.95）方面表現(xiàn)適宜。TT 樣本中 C1QTNF3-AMACR 的相對(duì)表達(dá)水平與體重指數(shù)（BMI）相關(guān)（P = 0.02）。此外，ADAMTS9-AS2 的表達(dá)水平與前列腺體積相關(guān)（P = 0.05）。前列腺癌患者的年齡與前列腺體積之間存在顯著正相關(guān)（x2=6.41)，P = 0.01）。正如預(yù)期的那樣， Gleason 評(píng)分與前列腺特異性抗原（PSA）濃度之間也存在顯著正相關(guān)（=6.28，P = 0.04）。
2、SAL誘導(dǎo)ADAMTS9-AS2上調(diào)，而PART1下調(diào)
去勢(shì)抵抗性 C4-2 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)顯示，用 SAL 處理后，ADAMTS9-AS2 顯著上調(diào)。用第二代 AR 拮抗劑恩雜魯胺（ENZ）和達(dá)羅他胺（ODM）處理對(duì)該 lncRNA 的表達(dá)沒有顯著影響（圖 2）。另一方面，用 SAL 處理后，PART1 的表達(dá)下調(diào)，用 AR 拮抗劑 ENZ 或 ODM 處理也會(huì)使其下調(diào)。通過分析作者之前的 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，證實(shí)了 SAL 對(duì) PART1 的下調(diào)作用。
圖 2. SAL 處理增強(qiáng)了 lncRNA ADAMTS9-AS2 的表達(dá)，而 lncRNA PART1 的表達(dá)則被 SAL 和第二代 AR 拮抗劑抑制
這表明這兩個(gè) lncRNA 是 AR 信號(hào)通路的一部分，也表明AR 拮抗劑并不總是表現(xiàn)出與雄激素相反的調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)于 PART1 而言，AR 拮抗劑可能不會(huì)使 AR 失活，反而可能賦予 AR 轉(zhuǎn)錄活性。
在雄激素敏感的 LNCaP 細(xì)胞中進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)顯示，用 SAL 處理可有效誘導(dǎo)ADAMTS9-AS2 的表達(dá)。用 Enz 或 ODM 處理也觀察到表達(dá)上調(diào)（圖 3）。相反，用 SAL 或 AR 拮抗劑處理后，LNCaP 細(xì)胞中 PART1 的表達(dá)下調(diào)。因此，數(shù)據(jù)表明 PART1 和 ADAMTS9-AS2 的表達(dá)處于 AR 信號(hào)通路中。有趣的是，PART1 的表達(dá)被 SAL 或 AR 拮抗劑抑制，而 ADAMTS9-AS2 的表達(dá)則被 AR 配體（包括 AR 拮抗劑）激活。
圖 3. SAL 和 AR 拮抗劑增強(qiáng)了 lncRNA ADAMTS9-AS2 的表達(dá)，而 lncRNA PART1 的表達(dá)則被 SAL 和 AR 拮抗劑抑制
3、3D腫瘤球體模型揭示AR調(diào)節(jié)治療的差異效應(yīng)
與傳統(tǒng)的二維貼壁培養(yǎng)相比，3D 腫瘤球體模型被認(rèn)為能更準(zhǔn)確地反映腫瘤的復(fù)雜性。為了更好地模擬腫瘤微環(huán)境，作者使用超低成本貼壁板，從親本 C4-2 或 LNCaP 細(xì)胞生成 LNCaP 和 C4-2 細(xì)胞的 3D 腫瘤球體模型。該模型提供了一個(gè)更符合生理相關(guān)性的系統(tǒng)，用于評(píng)估雄激素受體（AR）調(diào)節(jié)治療（包括 SAL、ENZ 和 ODM）相對(duì)于 DMSO 對(duì)照的影響。
對(duì)球體體積的定量評(píng)估顯示，用 SAL、ENZ 或 ODM 處理后，LNCaP 和 C4-2 球體的腫瘤大小均顯著減?。▓D 4A，4B）。這一減少與之前在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的觀察結(jié)果一致，強(qiáng)調(diào)了這些藥物在破壞腫瘤生長(zhǎng)方面的有效性。
對(duì)關(guān)鍵 AR 調(diào)節(jié)基因和 lncRNA 的分子分析顯示出治療特異性的表達(dá)模式。ADAMTS9-AS2，一種先前被認(rèn)為參與 AR 信號(hào)調(diào)節(jié)的 lncRNA，在用 SAL、ENZ 和 ODM 處理后，在 LNCaP 和 C4-2 球體中的表達(dá)均顯著增加（圖 4A，4B）。這種模式支持其作為 AR 通路中潛在共調(diào)節(jié)因子的作用，并表明 AR 拮抗劑不會(huì)完全使 AR 信號(hào)失活。
相反，AR 靶基因，包括 TMPRSS2、KLK3 和 FKBP5 的表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)治療類型的明顯依賴性。這些 AR 靶基因在用 SAL 處理后上調(diào)，但在用 ENZ 和 ODM 處理的兩種細(xì)胞系中均下調(diào)（分別見圖 4A 和 4B）。這些差異反應(yīng)突出了 SAL 作為 AR 激動(dòng)劑與 ENZ/ODM 作為 AR 拮抗劑的對(duì)比效應(yīng)。
有趣的是，lncRNA PART1 在用 SAL、ENZ 或 ODM 處理的 LNCaP 和 C4-2 球體中均顯示出持續(xù)下調(diào)（圖4A，4B）。這一發(fā)現(xiàn)與其作為 AR 信號(hào)共抑制因子的作用一致，特別是在 AR 通路調(diào)節(jié)的條件下。
這些結(jié)果共同突出了 3D 球體模型捕捉腫瘤特異性基因表達(dá)對(duì) AR 靶向治療反應(yīng)復(fù)雜性的能力。它們還進(jìn)一步證明了 AR 信號(hào)與 lncRNA 調(diào)節(jié)之間的相互作用，強(qiáng)調(diào)了它們?cè)谇傲邢侔┲委熤械南嚓P(guān)性。
圖 4A 和圖 4B. SAL、ENZ 和 ODM 處理抑制 C4-2 和 LNCaP 細(xì)胞中的球體生長(zhǎng)，并調(diào)節(jié)腫瘤球體中 ADAMTS9-AS2 和 PART1 的表達(dá)
4、C4-2細(xì)胞中AR對(duì)PART1和ADAMTS9-AS2基因座的差異招募
染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）分析表明，在 C4-2 細(xì)胞中，雙氫睪酮（DHT）可使 AR 招募到 PART1（內(nèi)含子）基因座（圖 S4A）。此外，ChIP-seq 結(jié)果顯示，在經(jīng) DHT 處理的 C4-2 細(xì)胞中，AR 選擇性地招募到 ADAMTS9-AS2（內(nèi)含子和外顯子）基因座。因此，數(shù)據(jù)表明 PART1 是一種新型的 AR 靶基因，然而，它是一種非經(jīng)典的 AR 靶基因，其表達(dá)被 SAL 處理抑制。
5、體外分析揭示SAL誘導(dǎo)ADAMTS9-AS2和PART1表達(dá)的顯著變化
對(duì)前列腺切除術(shù)后未固定的原生患者前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行 SAL 處理后的表達(dá)變化分析。作者檢測(cè)到用 SAL 處理后，ADAMTS9-AS2和 PART1 的體外表達(dá)水平存在顯著差異（圖 5），證實(shí)了 SAL 對(duì) LNCaP 和 C4-2 細(xì)胞中這些 lncRNA 的調(diào)節(jié)作用。
圖 5. 在原生人類前列腺癌組織中，SAL 處理可控制ADAMTS9-AS2 和 PART1 lncRNA的表達(dá)
與 SAL 誘導(dǎo) ADAMTS - AS2 表達(dá)類似，在經(jīng) SAL 處理的前列腺癌組織中，ADAMTS9-AS2 的體外表達(dá)顯著升高（表達(dá)比值（95% 置信區(qū)間） = 54.2（16.9 - 175），P < 0.0001）。與 ADAMTS - AS2 相反，正如細(xì)胞系數(shù)據(jù)所預(yù)期的那樣，經(jīng) SAL 處理的前列腺癌組織中 PART1 的體外表達(dá)降低（表達(dá)比值（95% 置信區(qū)間） = 0.12（0.02 - 0.77），P = 0.03）。此外，還檢測(cè)到 PSA 水平與 BMI 之間存在顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù) = 0.726，P = 0.027），PART1 表達(dá)與年齡之間存在顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù) = -0.644，P = 0.049），以及 PART1 和 ADAMTS9-AS2 的表達(dá)水平之間存在顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù) = 0.8，P = 0.10）。
6、lncRNA ADAMTS9-AS2是AR的共調(diào)節(jié)因子
獲得的數(shù)據(jù)提出了一個(gè)假設(shè)，即 lncRNA ADAMTS9-AS2 與 AR 之間可能存在相互作用，影響AR 的轉(zhuǎn)錄活性。為此，通過小干擾RNA（siRNA）分別敲低 lncRNA ADAMTS9-AS2 和 PART1，并分析編碼診斷標(biāo)志物前列腺特異性抗原（PSA）的 KLK3、TMPRSS2 和 FKBP5（已知的直接 AR 靶基因）的表達(dá)。在兩種細(xì)胞系中均驗(yàn)證了敲低效果（圖 6a，6b），表明敲低有效。如預(yù)期的那樣，AR 靶基因（FKBP5（b）、TMPRSS2（c）和 KLK3（d））被 SAL 上調(diào)。有趣的是，ADAMTS9-AS2的敲低降低了 SAL 誘導(dǎo)的 AR 靶基因 FKB5、TMPRSS 和 KLK3 的表達(dá)。這一觀察結(jié)果表明，lncRNA ADAMTS9-AS2 可能作為 AR 的共激活因子發(fā)揮作用。因此，數(shù)據(jù)表明 lncRNA ADAMTS9-AS2 是 AR 信號(hào)通路的一部分。
圖 6a 和圖 6b. ADAMTS9-AS2 的敲低降低了 AR 靶基因的表達(dá)
7、PART1 lncRNA敲低作為共抑制因子引發(fā)AR靶基因的過表達(dá)
同樣，作者在 C4-2 和 LNCaP 細(xì)胞系中對(duì) PART1 進(jìn)行了敲低。與 ADAMTS-AS2 的敲低情況相反，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1 的表達(dá)受 SAL 抑制。敲低長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1 會(huì)導(dǎo)致 AR 靶基因表達(dá)增強(qiáng)（圖 7），這表明 PART1 是一種共抑制因子。與該觀察結(jié)果一致的是，在患者前列腺腺癌數(shù)據(jù)集（GEPIA）中，PART1 的表達(dá)與 KLK3和 FKBP5呈顯著正相關(guān)，與 TMPRSS2 的相關(guān)性較弱但也顯著。因此，這些數(shù)據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1可能作為一種共調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié) AR12。
圖 7a 和圖 7b. PART1 的敲低
8、C4-2細(xì)胞中PART1和ADAMTS9-AS2的相互調(diào)節(jié)：對(duì)AR 信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞衰老的影響
在通過 siRNA 介導(dǎo)敲低后，對(duì) C4-2 細(xì)胞中 PART1 和 ADAMTS9-AS2 的表達(dá)分析揭示了一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的相互作用，這種相互作用影響著 AR 信號(hào)傳導(dǎo)（圖 8）。在沒有 SAL 的情況下，siADAMTS9-AS2 敲低會(huì)導(dǎo)致 PART1 表達(dá)增加，PART1 作為共抑制因子抑制 AR 靶基因。相反，siPART1 敲低會(huì)增強(qiáng) ADAMTS9-AS2 的表達(dá)，促進(jìn) AR 激活。這表明這兩種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 之間存在相互作用。在 SAL 處理后，ADAMTS9-AS2 水平上升而 PART1 水平下降，進(jìn)一步證實(shí)了一種相互的交互作用，即一種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 的增加對(duì)應(yīng)著另一種的抑制。這種相互作用表明 AR 被 “超級(jí)激活”，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞衰老。
圖 8 C4-2 細(xì)胞中經(jīng) siRNA 介導(dǎo)敲低和 SAL 處理后 PART1 和 ADAMTS9-AS2 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 的差異表達(dá)
9、RIP 測(cè)定突出了不同的富集模式：PART1被AR抗體顯著富集，而ADAMTS9-AS2則沒有
作者的結(jié)果揭示了在 LNCaP 細(xì)胞中使用 AR 抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，沉淀物中存在獨(dú)特的富集模式。值得注意的是，PART1 轉(zhuǎn)錄本在使用抗 AR 抗體免疫沉淀的物質(zhì)中豐度大幅增加，這表明它與 AR 存在相互作用。與之形成鮮明對(duì)比的是，ADAMTS9-AS2 沒有顯示出顯著的富集，這表明它與 AR 缺乏直接相互作用（圖 9）。
圖 9. AR 與長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1 結(jié)合。使用抗 AR 抗體通過 RIP 分析檢測(cè) RNA 結(jié)合蛋白（RBP）AR 與 PART1 和 ADAMTS9-AS2 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 的關(guān)聯(lián)
10、siRNA介導(dǎo)的ADAMTS9-AS2敲低降低了SAL誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的能力
用 SAL 處理前列腺癌細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，這在體外處理的患者前列腺癌標(biāo)本、前列腺癌 3D 腫瘤球體以及小鼠異種移植物中均有體現(xiàn)。由于長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 調(diào)節(jié) AR 信號(hào)傳導(dǎo)，作者假設(shè)它們調(diào)節(jié) SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)過程。通過 siRNA 介導(dǎo)的敲低實(shí)驗(yàn)，作者的結(jié)果顯示，靶向降低 ADAMTS9-AS2 的表達(dá)會(huì)顯著減弱 SAL 在兩種細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的能力（圖 10）。這表明，被 SAL 上調(diào)的 ADAMTS9AS2 促進(jìn)了 SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老。在研究 siRNA 介導(dǎo)的 PART1 敲低的影響時(shí)，作者觀察到兩種細(xì)胞系對(duì) SAL 誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老水平的細(xì)胞反應(yīng)均有所降低。具體而言，在 C4-2 和 LNCaP 細(xì)胞中，降低 PART1 的表達(dá)會(huì)顯著降低 SAL 誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的能力。這種增強(qiáng)的敏感性意味著 PART1 和 ADAMTS9-AS2 在雄激素敏感和去勢(shì)抵抗的前列腺癌細(xì)胞系中，在 AR 介導(dǎo)的衰老過程中均發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。
圖 10. 敲低長(zhǎng)鏈非編碼 RNA ADAMTS9-AS2 會(huì)降低，而敲低 PART1 會(huì)增強(qiáng) SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老
11、ADAMTS9-AS2和PART1敲低對(duì)C4-2 和LNCaP細(xì)胞中p15INK4B mRNA和蛋白水平的不同影響
在 C4-2 和 LNCaP 細(xì)胞中，分析了編碼 p15INK4B 蛋白的 CDKN2B mRNA 水平，實(shí)驗(yàn)分為敲低 ADAMTS9-AS2 和未敲低的情況。結(jié)果表明，SAL 上調(diào)的 p15INK4B 的 mRNA 和蛋白水平均有所降低（圖 11A - C），并且敲低 ADAMTS - AS2 會(huì)下調(diào)兩種細(xì)胞系中 CDKN2B mRNA 和 p15INK4B 蛋白的水平（圖 11C）。這一發(fā)現(xiàn)表明 ADAMTS9-AS2 在衰老誘導(dǎo)因子 p15INK4B 的表達(dá)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。作者的數(shù)據(jù)也與衰老相關(guān) β- 半乳糖苷酶（SA-β-gal）檢測(cè)結(jié)果一致，該檢測(cè)也顯示敲低 ADAMTS9-AS2 后細(xì)胞衰老減少。因此，作者的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，敲低ADAMTS9-AS2 會(huì)降低 SAL 誘導(dǎo)衰老的能力，并表明 ADAMTS9-AS2 在一定程度上介導(dǎo)了 SAL 誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
與 si - ADAMTS9-AS2 的情況相反，在 LNCaP 和 C4-2 前列腺癌細(xì)胞系中敲低PART1，會(huì)顯著誘導(dǎo)p15INK4B 的 mRNA 和蛋白水平升高。這一觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了 PART1 在調(diào)節(jié) p15INK4B 表達(dá)中的作用，表明 PART1 通?？赡茏鳛?span> p15INK4B 表達(dá)的抑制因子。作者還分析了另一種細(xì)胞周期抑制劑 p21，結(jié)果表明，與 ADAMTS9-AS2 不同，敲低長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1 會(huì)增強(qiáng) p21 蛋白水平，這表明 p21 也是 PART1 的作用靶點(diǎn)。有趣的是，在存在 SAL 的情況下，由于敲低兩種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老減少，p21 水平也會(huì)降低（圖 11C）。
這些發(fā)現(xiàn)表明，SAL 介導(dǎo)的 PART1 下調(diào)是前列腺癌細(xì)胞中 SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)過程的一部分。敲低 PART1 后 p15NK4B 的上調(diào)也表明了 PART1 促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展，甚至可能增強(qiáng)其侵襲性的潛在機(jī)制。與該觀察結(jié)果一致，來自患者前列腺癌樣本的數(shù)據(jù)集顯示 PART1 與 CDKN2B 之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。值得注意的是，在兩種細(xì)胞系中，敲低 PART1 或 ADAMTS9-AS2 都會(huì)增強(qiáng) AR 的蛋白水平（圖 11C），這表明這兩種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性 AR 蛋白水平來調(diào)節(jié) AR 活性16。
圖 11. 細(xì)胞周期抑制劑和衰老標(biāo)志物 p15 的水平受 SAL 以及敲低長(zhǎng)鏈非編碼 RNAs ADAMTS9-AS2 和 PART1 的影響
12、前列腺癌中ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
在構(gòu)建包含長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）、微小 RNA（miRNA）和信使 RNA（mRNA）的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)時(shí)，研究人員聚焦于表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的 miRNA。如果在 miRNA - mRNA 和 lncRNA - miRNA 相互作用對(duì)中，lncRNA 和 mRNA 與這些 miRNA 呈現(xiàn)相反的關(guān)聯(lián)關(guān)系，那么它們就會(huì)被納入研究范圍。作者運(yùn)用 miRcode來探究 lncRNA 和 miRNA 之間的聯(lián)系。分析結(jié)果顯示，在 9 種差異表達(dá)的 lncRNA 中，有 6 種可能靶向 55 種 miRNA 中的 17 種。作者使用 miRNAmeConverter 軟件包（版本 1.30.0），將 miRNA 的名稱轉(zhuǎn)換為 miRbase v22 數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)的名稱。隨后，利用 multimiR 軟件包（版本 1.24.0）來識(shí)別 miRNA 的靶 mRNA。為了優(yōu)化結(jié)果，作者剔除了那些不在差異表達(dá) mRNA 范圍內(nèi)的 miRNA 靶向 mRNA。通過數(shù)據(jù)分析，作者確定了 13 種與前列腺癌相關(guān)的 miRNA，它們有可能靶向 266 種差異表達(dá) mRNA 中的 107 種。此外，依據(jù) ceRNA 網(wǎng)絡(luò)理論，作者去除了 lncRNA 與 miRNA 之間、miRNA 與 mRNA 之間存在相反表達(dá)模式的相互作用。借助 Cytoscape 3.9 軟件，作者構(gòu)建了一個(gè)涵蓋 3 種 lncRNA、13 種 miRNA 和 107 種 mRNA 的綜合 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含 123 個(gè)節(jié)點(diǎn)和 124 條邊。
作者使用 cytoHubba插件，基于最大團(tuán)中心性、度中心性、介數(shù)中心性、徑向中心性和離心率中心性，確定了 15 個(gè)樞紐基因。進(jìn)一步分析這些樞紐基因的交集后，作者發(fā)現(xiàn)了一組包含 ADAMTS9 - AS2、hsa - miR - 10b - 5p、hsa - miR - 148a - 3p、hsa - miR - 183 - 5p、hsa - miR - 18b - 5p、hsa - miR - 199b - 5p、hsa - miR - 200a - 3p、hsa - miR - 203a - 3p、hsa - miR - 26b - 5p、hsa - miR - 301a - 3p、hsa - miR - 454 - 3p、hsa - miR - 7 - 5p 和 hsa - miR - 98 - 5p 的基因。作者還根據(jù) ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中的 mRNA 構(gòu)建了蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用中心性分析。最后，通過共享這些中心性樞紐基因之間的相互作用，作者得到了 CAV1 和 FLNA 這兩個(gè)樞紐 mRNA（圖 11）。這些樞紐基因在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，對(duì)于理解它們?cè)谘芯矿w系中的重要性至關(guān)重要。
對(duì)前列腺腺癌數(shù)據(jù)集的分析表明，CAV1 和 FLNA 的高表達(dá)水平與患者更高的生存概率呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)凸顯了這兩個(gè)樞紐基因在前列腺癌病理生理學(xué)中的潛在重要性。該相關(guān)性與作者的生物信息學(xué)分析結(jié)果高度吻合，后者將 CAV1 和 FLNA 確定為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分。這些結(jié)果表明，這些基因的上調(diào)可能通過調(diào)節(jié)參與腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)移行為的關(guān)鍵分子通路，為患者帶來生存優(yōu)勢(shì)。不過，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，來闡明 CAV1 和 FLNA 的確切機(jī)制作用，并探索它們作為前列腺癌管理中的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的潛力。
對(duì)前列腺腺癌患者中 CAV1和 FLNA 表達(dá)進(jìn)行的 Kaplan - Meier 生存分析顯示，它們與患者的預(yù)后存在顯著關(guān)聯(lián)。高 CAV1 表達(dá)（n = 334）與較低表達(dá)（n = 146）相比，患者的生存概率更高，這表明它有可能成為一種良好的預(yù)后標(biāo)志物。同樣，FLNA 的高表達(dá)與更好的總體生存率相關(guān)，這表明它在前列腺癌進(jìn)展過程中具有保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)突出了 CAV1 和 FLNA 在前列腺腺癌預(yù)后方面的重要性。
13、ceRNA網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵軸
為了選擇關(guān)鍵軸，作者通過樞紐基因之間的交集來獲取基因。具體來說，在 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中，作者利用樞紐基因之間的共享相互作用來選擇 lncRNA 和 miRNA；對(duì)于 mRNA 的選擇，作者則利用 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中 mRNA 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)里基因樞紐之間的共享相互作用。包括 CAV1 和 FLNA 在內(nèi)的 mRNA 位于主要 PPI 網(wǎng)絡(luò)的最終基因樞紐中。這些關(guān)鍵軸包括 ADAMTS9 - AS2/hsa - miR - 7 - 5p/CAV1 和 ADAMTS9 - AS2/hsa - miR - 98 - 5p/FLNA（圖 12）。
圖 12. 基于樞紐基因的 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵軸
14、lncRNA - miRNA相互作用
此外，作者利用LncBase 數(shù)據(jù)庫，探究了 miRNA 與 ADAMTS9 - AS2 和 PART1 之間的相互作用。作者實(shí)施了多種篩選條件來優(yōu)化分析，例如通過組織篩選進(jìn)行聚焦，將 miRNA 置信度篩選設(shè)置為 “高” 以確保 miRNA 相互作用的可靠性，并使用 “已驗(yàn)證” 篩選條件，僅納入經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的相互作用。分析結(jié)果顯示，PART1 與兩種 miRNA，即 hsa - miR - 99a - 5p 和 hsa - miR - 150 - 5p 之間存在顯著相互作用。此外，作者還發(fā)現(xiàn) ADAMTS9 - AS2 與兩種 miRNA，hsa - miR - 7 - 5p 和 hsa - miR - 98 - 5p 之間存在值得關(guān)注的相互作用。
15、lncRNA相互作用
通過 RNAinter 數(shù)據(jù)庫，作者識(shí)別出 ADAMTS9 - AS2 和 PART1 與組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、蛋白質(zhì)和 miRNA 的多種相互作用，這表明它們?cè)谌旧|(zhì)動(dòng)態(tài)變化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。ADAMTS9 - AS2 與活躍染色質(zhì)標(biāo)記，如H3K4me3（得分：0.8377）和 H3K27ac（0.7737），以及抑制性標(biāo)記 H3K27me3（0.7579）都有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，這表明它在激活和抑制基因表達(dá)方面具有雙重作用。它還與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括 CTCF（0.6255）和 AR（0.4822），以及蛋白質(zhì) POLR2A（0.528）相互作用，這凸顯了它作為染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的潛力。同樣，PART1 與活躍組蛋白標(biāo)記H3K4me3（0.6952）相關(guān)，并與轉(zhuǎn)錄因子，如 FOXA1（0.5984）和 AR（0.5479）相互作用，這表明它參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，尤其是在激素驅(qū)動(dòng)的通路中。這些發(fā)現(xiàn)突出了 lncRNA 在調(diào)節(jié)前列腺癌基因表達(dá)和細(xì)胞過程中的關(guān)鍵作用。
16、miR - 98 - 5p的表達(dá)上調(diào)，與ADAMTS9 - AS2存在顯著相關(guān)性
為了驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的結(jié)果，作者檢測(cè)了臨床樣本中 miR - 98 - 5p 和 miR - 7 - 5p 的表達(dá)水平（圖 13A）。與 NTAT 樣本相比，這兩種 miRNA 在 TT 樣本中的表達(dá)均下調(diào)（表達(dá)比值（95% 置信區(qū)間）分別為0.033±0.76（0.011 - 0.097）和 29.65±0.6（12.85 - 68.4）；miR - 98 - 5p 和 miR - 7 - 5p 的 P 值分別 < 0.0001 和 0.001）。另一方面，與 NTAT 樣本相比，miR - 99a - 3p 和 miR - 150 - 5p 在 TT 樣本中的表達(dá)也下調(diào)（表達(dá)比值（95% 置信區(qū)間）分別為19.22±0.46（10.1 - 36.8）和 0.32±0.56（0.15 - 0.71）；miR - 99a - 3p 和 miR - 150 - 5p 的 P 值分別 < 0.0001 和 0.006）。生物信息學(xué)分析與患者數(shù)據(jù)集驗(yàn)證的結(jié)合，揭示了 ADAMTS9AS2 的一條新通路和一個(gè)新的 miRNA 網(wǎng)絡(luò)。
為了進(jìn)一步探究潛在的相互作用，作者進(jìn)行了 Spearman 相關(guān)性分析。在前列腺癌患者的腫瘤組織樣本中，miR - 99a - 3p 和 miR - 150 - 5p 的表達(dá)水平與 PART1 的相關(guān)性較弱（圖 13B）。同樣，miR - 7 - 5p 和 miR - 99 - 5p 與 ADAMTS9 - AS2 的相關(guān)性也較弱（圖 13D）。盡管這些相關(guān)性未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但觀察到的趨勢(shì)，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和表達(dá)驗(yàn)證，表明存在一個(gè)涉及 ADAMTS9 - AS2 的潛在 miRNA 網(wǎng)絡(luò)，值得進(jìn)一步研究。
圖 13A. 使用患者樣本驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果
圖 13B. 前列腺癌樣本中 miRNA 與 lncRNA 的相關(guān)性分析
結(jié)論：
綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)了新的 AR 信號(hào)通路，這些通路涉及在前列腺癌腫瘤發(fā)生過程中被 SAL 反向調(diào)節(jié)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA。在雙極雄激素治療中使用的SAL，可誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA ADAMTS9 - AS2 的表達(dá)，同時(shí)抑制長(zhǎng)鏈非編碼 RNA PART1 的表達(dá)。這兩種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 均在 AR 信號(hào)通路中發(fā)揮作用，調(diào)控 SAL 介導(dǎo)的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)過程。盡管它們受 SAL 的調(diào)控作用相反，但都參與了AR 信號(hào)傳導(dǎo)，這表明在前列腺癌的AR 信號(hào)通路中存在新的途徑和網(wǎng)絡(luò)。這些發(fā)現(xiàn)有助于理解BAT所涉及的分子機(jī)制，為前列腺癌的治療提供了潛在的新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。不過，本研究存在一定的局限性，未來研究應(yīng)注重體內(nèi)驗(yàn)證，并采用患者來源的異種移植或類器官模型，以便更深入地探究這些發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性。
實(shí)驗(yàn)方法：
差異表達(dá)分析、GO分析、通路富集分析、構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)、相關(guān)性分析、生存分析、ChIP-seq、q-PCR、Western blot、RIP、細(xì)胞培養(yǎng)，siRNA敲低細(xì)胞轉(zhuǎn)染、3D腫瘤球體模型構(gòu)建、細(xì)胞衰老誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、小鼠異種移植物實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)：
Taheri M, Schindler K, Baniahmad A. The LncRNAs PART1 and ADAMTS9-AS2 act in an Antithetic Manner on AR Signaling and Induction of Cellular Senescence in Prostate Cancer Cells. Int J Surg. 2025 Mar 26. doi: 10.1097/JS9.0000000000002334. Epub ahead of print. PMID: 40143747.