商品化工程外泌體重大發(fā)現(xiàn)——高效支架蛋白PlexinA1
支架蛋白在EVs的工程化中起著關鍵作用。它們的主要功能是將目的蛋白有效地分選到EVs中，并將其固定在EVs的特定位置。通過與目的蛋白的融合表達，支架蛋白能夠增強EVs對目的蛋白的裝載能力，從而提高EVs作為藥物遞送系統(tǒng)的效率。文章提出了新的篩選標準，簡化了對支架蛋白的要求，主要包括兩點：（1）候選蛋白必須是具有EV分選能力的I型跨膜蛋白；（2）在N端和C端的截短和/或融合修飾不會影響其EV分選能力。這些標準旨在擴大潛在支架蛋白的范圍?？偟膩碚f，文章通過實驗驗證了PLXNA1（PlexinA1）作為一種新型支架蛋白的潛力。PLXNA1的截短形式不僅保留了其全長蛋白的高EV分選能力，還允許目的蛋白在EVs的外表面和腔內(nèi)區(qū)域進行融合表達，單獨或同時實現(xiàn)。研究于2024年11月發(fā)表在《Journal of Extracellular Vesicles》，IF=15.5。
技術路線：
研究結果
1. PlexinA1被鑒定為具有高EV分選能力的潛在支架蛋白
研究者提出了兩個新的標準來鑒定支架蛋白：（1）候選蛋白必須是具有EV分選能力的I型跨膜蛋白；（2）在N端和C端的截短和/或融合修飾不會影響其EV分選能力。為了驗證這些標準的可行性，研究者設計了一個篩選實驗。研究者收獲了野生型293F細胞的培養(yǎng)基，并通過超速離心（UC）后進行密度梯度離心（DGC）的方法進行EV純化。根據(jù)國際細胞外囊泡學會（ISEV）2018年提出的細胞外囊泡研究的最小信息（MISEV）指南，通過透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）和生物標志物檢測對通過DGC分層的EV進行鑒定（圖1a、b、c、e）。為了評估不同蛋白在EV中的分選能力，研究者通過質(zhì)譜分析了293F細胞裂解物（CLs）、通過UC分層的低純度EV和通過DGC分層的高純度EV。研究者通過比較三種樣本中目標肽段的比例生成了熱圖（圖1c）。如圖所示，已知的EV相關蛋白（如MFGE8、CD81、PTGFRN、SDCBP、CD63和TSG101）在DGC組中顯示出顯著優(yōu)勢，其次是UC組，最后是CL組。非EV相關蛋白鈣網(wǎng)蛋白（CANX）顯示出完全不同的譜圖。為了更好地量化這種差異，研究者通過EV/CL的比例計算了蛋白富集度。除了已知的支架蛋白外，研究者注意到PLXNA1在更純的DGC EV中也顯示出高富集度（圖1d），與西方印跡（WB）檢測結果一致（圖1e）。這些數(shù)據(jù)表明PLXNA1是一種具有高EV分選能力的蛋白，符合篩選標準的第一個要求。
圖1 PlexinA1被鑒定為具有高EV分選能力的潛在支架蛋白
2. WB和nanoFCM是評估支架EV分選能力的可行方法
為了評估PLXNA1是否符合研究者篩選標準的第二個要求，研究者開發(fā)了一種實驗方法來確定支架蛋白的EV分選能力。簡言之，將綠色熒光蛋白（GFP）作為模型指示物（目的蛋白）與模型支架蛋白CD63和MFGE8融合。然后，通過瞬時轉染將融合蛋白和游離GFP在293F中過表達。之后，通過低速離心收集細胞培養(yǎng)基（CCM）。細胞沉淀裂解并冷凍以供后續(xù)使用。通過尺寸排阻色譜（SEC）方法從CCM中純化EVs（圖2a），然后進行三項測試以評估相應支架蛋白的EV分選能力。在第一次測試中，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測EVs和CLs中的GFP濃度。通過將EVs中的GFP總量除以CLs中的GFP總量（等量蛋白）來確定蛋白富集度（圖2b）。研究者在第二次測試中進行了西方印跡（WB），并通過灰度分析對蛋白進行定量（圖2c、d）。在第三次測試（圖2e）中，研究者使用納米流式細胞術（nanoFCM）測量GFP負載EVs的熒光信號，代表EVs中GFP的表達水平（Peacock et al., 2022）。盡管ELISA和WB測量的蛋白富集度絕對值略有差異，但這兩個方法的譜圖保持一致（圖2b、c）。歸一化后，GFP-CD63（4-7倍于游離GFP）略優(yōu)于GFP-MFGE8（3-4倍于游離GFP）。鑒于WB可以反映融合蛋白的分子量，研究者決定在后續(xù)實驗中使用WB和nanoFCM來評估候選支架的EV分選能力。nanoFCM測量的平均熒光強度（MFI）結果表明，融合蛋白GFP-MFGE8優(yōu)于GFP-CD63，與蛋白富集度不同。這是因為GFP MFI僅反映了EVs中融合蛋白的相對表達水平，而不管細胞中剩余的融合蛋白量是多少。然而，蛋白富集度代表了這兩種不同融合蛋白形式的比率。因此，如果兩種融合蛋白在生產(chǎn)細胞中的表達水平差異足夠大，就會出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這也與WB的條帶強度一致（圖2c）。根據(jù)這些結果，研究者決定在后續(xù)實驗中使用WB和nanoFCM來評估候選支架的EV分選能力。
圖2 WB和納米流式細胞術（nanoFCM）是評估支架EV分選能力的可行方法
3. 截短的PLXNA1保持高EV分選能力
盡管PLXNA1具有高EV分選能力，但由于其功能域和較大的分子量（約211 kDa），它不適合用于裝載目的蛋白。刪除或替換其功能域的PLXNA1截短形式可能適合與目的蛋白融合。由于實驗方法已經(jīng)確定，研究者進入下一步，驗證PLXNA1是否符合研究者篩選標準的第二個要求，換句話說，截短和/或融合修飾是否會影響其EV分選能力。為了實現(xiàn)這一目標，研究者選擇了五種不同的截短形式，并將它們與不同的貨物分子（例如白介素12和GFP）在N端和C端同時融合。隨后，從293F細胞培養(yǎng)上清液中分離EVs，并使用之前建立的方法進行檢測。WB實驗表明，除了PLXNA1（1046-1300）外，所有這些截短形式均顯著富集于EVs中，符合研究者篩選標準的第二個要求（圖3a、b）。然而，由于在其他四組中蛋白富集度幾乎沒有差異，因此僅憑這一單一指標的結果無法確定最佳截短形式。因此，研究者還考慮了通過納米流式細胞術（nanoFCM）測量的平均熒光強度（MFI）結果（圖3c），并縮小了候選范圍至PLXNA1（863-1316）、PLXNA1（863-1300）和PLXNA1（1143-1300）。在排除了顯示出更明顯降解的PLXNA1（1143-1300）之后，研究者最終選擇了PLXNA1（863-1316）用于所有后續(xù)實驗，因為它在蛋白富集度方面略占優(yōu)勢。為了直觀展示EV分選能力，研究者對攜帶hIL12-PLXNA1（863-1316）或小鼠IL12（mIL12）-PLXNA1（863-1316）的單個EV進行了成像。與四跨膜蛋白相比，貨物（hIL12和mIL12）的熒光斑點更為顯著。這也證明了PLXNA1（863-1316）具有高EV分選能力。為了排除EV分選能力可能依賴于貨物的可能性，研究者將PLXNA1（863-1316）與不同的目的蛋白（例如IL12、RVG肽和ALFA標簽的納米抗體[ NbALFA]以及帶有Flag標簽的蛋白）融合。從293F細胞培養(yǎng)上清液中分離EVs，并使用WB進行檢測。IL12、RVG肽和NbALFA也在EVs中顯著富集（圖3d、e）。這表明這種截短形式的PLXNA1能夠有效地促進各種蛋白貨物的主動分選。這些結果表明，PLXNA1截短形式是EV工程的潛在支架蛋白，并證明了研究者篩選標準的可行性。
圖3 截短的PLXNA1保持高EV分選能力
4. PLXNA1上的一個七氨基酸殘基的基序是EV分選所必需的
Plexins是包含九個成員的蛋白質(zhì)家族中的跨膜受體（Hota & Buck, 2012）。研究者想知道這個家族中其他蛋白的截短形式是否具有類似的EV分選能力。因此，研究者基于PLXNA1（863-1316）的參考構建了這個家族中其他蛋白的截短形式，分別是PLXNA2（857-1306）、PLXNB1（1068-1558）、PLXNB2（802-1267）、PLXNC1（661-1003）和PLXND1（886-1341）。同樣地，IL12和GFP被置于這些截短體的兩端。有趣的是，只有PLXNA2（857-1306）在EVs中顯示出顯著的富集（圖4a-c），盡管其EV分選能力弱于PLXNA1（863-1316）（蛋白富集度>2.5，MFI>5000）。為了研究這種差異的原因，研究者對PLXNA1、PLXNA2、PLXNB1和PLXNB2進行了序列比對。一個保守的基序SDSLLTL僅在PLXNA1和PLXNA2的跨膜結構域旁邊的細胞外區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，而不在PLXNB1或PLXNB2中（圖4d）。為了確認SDSLLTL是否是EV分選所必需的，研究者比較了原始截短體PLXNA1（863-1316）和沒有SDSLLTL基序的截短體PLXNA1（863-1236, 1244-1316）。如圖所示，在刪除這個SDSLLTL基序后，蛋白富集度和GFP MFI顯著降低，這意味著這個基序與PLXNA1融合蛋白向EVs的主動分選有關（圖4e-g）。除了缺失實驗外，研究者還進行了點突變和插入實驗，以進一步研究這個基序如何影響PLXNA1截短形式的EV分選能力。結果表明，這個基序中每個氨基酸的重要性不同。此外，第一個和最后四個氨基酸（除了D和第二個S外）在維持這一功能方面發(fā)揮了更突出的作用（圖4h）。
圖4 PLXNA1上的一個七氨基酸殘基的基序是EV分選所必需的
5. PLXNA1截短形式比已知支架更具優(yōu)勢
為了進一步闡明PLXNA1截短形式在EV分選中的潛在優(yōu)勢，研究者將PLXNA1（863-1316）與兩種公認的支架蛋白進行了比較，即在HEK293來源的EVs中廣泛應用于工程化EVs的LAMP2B和在EV臨床應用中已知的具有高EV分選能力的PTGFRN。按照相同的目的蛋白裝載，PLXNA1（863-1316）顯著顯示出比LAMP2B和PTGFRN更強的EV分選能力，它們都是I型跨膜蛋白（圖5）。為了研究PLXNA1（863-1316）作為一種支架蛋白是否適用于其他細胞，研究者在MCF-7細胞系中重復了上述實驗。同樣地，PLXNA1（863-1316）在MCF-7來源的EVs中顯示出比LAMP2B和PTGFRN更高的EV分選能力。這表明PLXNA1截短形式可以作為一種通用支架蛋白，不僅限于HEK293細胞。按照研究者的篩選標準，PLXNA1截短形式被鑒定出來，并顯示出在EV蛋白工程中具有顯著的應用價值。
圖5 PLXNA1截短形式比已知支架更具優(yōu)勢
6. 與PLXNA1截短形式融合的目的蛋白保持其活性
由于PLXNA1截短形式能夠使目的蛋白在EVs中富集，另一個關注點是裝載到EVs中的目的蛋白是否仍然具有生物活性。為了回答這個問題，研究者設計了額外的實驗，分別驗證EVs腔內(nèi)和外表面的目的蛋白的活性。首先，使用核糖體蛋白L7AE的RNA結合單元進行腔內(nèi)修飾，以測試融合表達是否剝奪了其RNA結合能力，這反過來可能影響目標mRNA的裝載。簡言之，將表達PLXNA1（863-1316）和L7AE融合蛋白的質(zhì)粒以及表達目標mRNA（即NanoLuc mRNA，其尾部融合了C/D盒序列）的另一個質(zhì)粒共轉染到293F細胞中。將得到的EVs加入培養(yǎng)基中，并與HepG2細胞共孵育。如果L7AE單元成功表達并保持其RNA結合能力，目標mRNA（帶有C/D盒的NanoLuc）水平及其相應的蛋白應在受體細胞中顯著上調(diào)（圖6a）。研究者進行了液滴數(shù)字PCR（ddPCR）實驗，以分析囊泡中目標mRNA的豐度。與僅轉染目標mRNA質(zhì)粒的對照組（以下簡稱為NanoLuc-EV）相比，共轉染兩種質(zhì)粒的組（以下簡稱為NanoLuc-L7AE-EV）中每個囊泡的NanoLuc mRNA拷貝數(shù)超過10倍。為了驗證受體細胞中的NanoLuc活性是否來源于EVs遞送的mRNA，研究者進行了孵育實驗，并發(fā)現(xiàn)用NanoLuc-L7AE-EV處理的HepG2細胞中NanoLuc mRNA水平是用NanoLuc-EV處理的HepG2細胞的4倍以上（圖6b）。此外，研究者還使用ddPCR分析了HepG2細胞中NanoLuc mRNA的豐度。用NanoLuc-L7AE-EV處理的HepG2細胞中NanoLuc mRNA的豐度是用NanoLuc-EV處理的HepG2細胞的10倍以上。如預期所示，當在EV孵育前向HepG2細胞中轉染針對NanoLuc mRNA的siRNA時，可以觀察到用NanoLuc-L7AE-EV處理的HepG2細胞中NanoLuc mRNA的量減少了40%。關于受體細胞中的蛋白功能實驗，野生型EVs和僅表達L7AE融合蛋白的EVs幾乎不顯示任何NanoLuc活性（圖6c）。與此同時，用NanoLuc-L7AE-EV處理的HepG2細胞的NanoLuc催化活性是用NanoLuc-EV處理的HepG2細胞的4倍（圖6c），這表明L7AE工程化EVs在遞送目標mRNA方面的優(yōu)勢。此外，在存在siRNA的情況下，用NanoLuc-L7AE-EV處理的細胞的活性減少了30%（圖6c），這進一步證實了受體細胞中的NanoLuc催化活性來源于mRNA遞送。相反，siRNA并未影響用NanoLuc-EV處理的細胞的活性（圖6c）。由于目標mRNA也可以在供體細胞（HEK293F）中翻譯成蛋白，因此由NanoLuc-C/D BOX轉染的細胞分泌的EVs也可能攜帶NanoLuc蛋白。因此，一個可能的解釋是，對于NanoLuc-EV處理的HepG2細胞，其NanoLuc活性主要來源于EVs攜帶的蛋白。為了進一步排除兩組（NanoLuc-EV和NanoLuc-L7AE-EV）處理的受體細胞之間的催化活性差異是由于它們攜帶的NanoLuc蛋白量不等，而不是由于受體細胞中目標mRNA表達的蛋白所導致的，研究者還測試了兩組EVs中的NanoLuc活性。結果表明，NanoLuc-L7AE-EV的NanoLuc催化活性并不優(yōu)于NanoLuc-EV。這支持了結論，即受體細胞中觀察到的NanoLuc活性主要歸因于目標mRNA表達的蛋白，兩組（NanoLuc-L7AE-EV和NanoLuc-EV）之間的差異確實與mRNA的豐度有關。接下來，將NanoLuc蛋白直接融合并表達在PLXNA1（863-1316）的C端。與之前的實驗不同，這種情況下表達的NanoLuc蛋白被錨定在EVs的內(nèi)膜上。在隨后的體外實驗中，NanoLuc負載的EVs和重組NanoLuc顯示出劑量依賴性的底物催化活性（圖6d）。在另一個實驗中，選擇白介素12（IL12）作為分子貨物，以測試N端融合對蛋白活性的影響。通過與PLXNA1（863-1316）的N端融合，將小鼠IL12（mIL12）展示在EVs的外膜上。在體外實驗中，將不同量的重組mIL12（rmIL12）和與mIL12相關的EVs（EVmIL12）加入小鼠外周血單個核細胞（mPBMCs）的培養(yǎng)基中。孵育后，rmIL12和EVs mIL12均以相同的量級誘導IFN-γ激活（EV-mIL12的EC50 = 0.8824，rmIL12的EC50 = 0.252）（圖6e）。這些結果表明，與PLXNA1截短形式的N端或C端融合對蛋白貨物的功能影響有限。為了驗證PLXNA1截短形式是否能夠在體內(nèi)模型中維持目的蛋白的活性，研究者研究了攜帶MC38腫瘤的小鼠。研究者比較了rmIL12和EVmIL12在劑量范圍內(nèi)的腫瘤生長抑制活性，每隔一天在腫瘤內(nèi)注射三次（第0天、第2天和第4天）（圖6f）。與等劑量的rmIL12（100 ng）相比，EVmIL12在MC38模型中顯示出更有效的腫瘤生長抑制活性（圖6f、g）。在第16天注射后，rmIL12處理的小鼠的平均腫瘤重量被抑制了11%。然而，在第16天注射后，EVmIL12處理的小鼠的平均腫瘤重量分別在100 ng劑量時被抑制了72%，在500 ng劑量時被抑制了80%，表明EVmIL12在相同劑量下優(yōu)于rmIL12，并且EVmIL12的治療效果呈劑量依賴性（圖6g）。與研究者之前的研究一起，這些數(shù)據(jù)表明，與重組目的蛋白相比，融合到EVs中的PLXNA1截短形式的目的蛋白不僅保持了其活性，甚至在效力上更勝一籌。
圖6 與PLXNA1截短形式融合的目的蛋白保持其活性
7. 基于PLXNA1截短形式支架建立了一種新的細胞外目的蛋白裝載方法
PLXNA1作為EV支架蛋白的穩(wěn)健性得到了證明，特別是其允許在兩端單獨或同時進行融合修飾的特性。因此，研究者嘗試基于PLXNA1（863-1316）和一種名為NbALFA的納米抗體的融合，開發(fā)一種通用的工程化EV。眾所周知，ALFA標簽及其納米抗體NbALFA具有非常高的親和力和選擇性。在這個系統(tǒng)中，通過與PLXNA1（863-1316）的融合表達，將NbALFA呈現(xiàn)在EVs的外表面。通過簡單孵育，這些EVs可以進一步用攜帶ALFA標簽的目的蛋白進行標記（圖7a）。為了評估這個系統(tǒng)的可行性，將帶有ALFA標簽的重組GFP與NbALFA EVs（GFP分子/EV顆粒 = 1000）共孵育，約51.5%的EVs呈GFP陽性（圖7b），而其他對照組未觀察到熒光信號。除了GFP外，研究者還構建了幾種帶有ALFA和HA標簽的重組肽和蛋白，包括NanoLuc、RVG和EGFR納米抗體（7D12）。這些肽和蛋白也與NbALFA EVs共孵育。之后，這些EVs進一步用抗HA熒光抗體標記，并使用納米流式細胞術（nanoFCM）進行熒光分析（圖7c）。所有這些重組肽或蛋白都成功標記在EVs上，無論它們的分子量差異如何。為了研究目的蛋白的活性是否受到NbALFA EVs與ALFA標簽目的蛋白相互作用的影響，研究者將帶有ALFA標簽的NanoLuc用于EVs表面的裝載，然后評估NanoLuc的催化活性。此外，研究者還在體外實驗中評估了7D12修飾的EVs對EGFR陽性細胞系的選擇性結合。首先，用DSPE-PEG3000-FITC標記的對照EVs和7D12修飾的EVs具有相似的熒光強度。隨后，它們分別與EGFR陽性和EGFR陰性細胞共孵育。與EGFR陰性細胞組（22VR1）和野生型EV組（對照）相比，7D12修飾的EVs在不同劑量下對EGFR陽性細胞組（A431）顯示出強烈顯著且特異性的親和力（圖7d），表明目的蛋白在EV表面具有功能性。研究者還想知道基于NbALFA/ALFA相互作用的目的蛋白裝載EVs是否在保存過程中足夠穩(wěn)定。因此，用重組GFP-ALFA標記NbALFA EVs。然后，使用納米流式細胞術（nanoFCM）分析重復凍融循環(huán)和不同保存條件對EVs的GFP熒光的影響。結果表明，基于NbALFA/ALFA相互作用的EVs可以抵抗至少三次凍融循環(huán)，GFP信號僅在八次凍融循環(huán)后降低了20%（圖7e）。此外，這些EVs中的GFP MFI在4°C或-80°C保存至少4周后得以保持（圖7f）。因此，研究者的數(shù)據(jù)表明，這種基于NbALFA/ALFA系統(tǒng)的EV工程化方法是一種高度通用且穩(wěn)定的方法。
圖7 基于PLXNA1截短形式支架建立了一種新的細胞外目的蛋白裝載方法
結論
通過提出新的篩選標準，研究者們成功鑒定了PlexinA1（PLXNA1）截短形式作為一種新型的細胞外囊泡（EVs）支架蛋白，它不僅具有高效的EVs分選能力，還允許感興趣的蛋白質(zhì)（目的蛋白）在EVs的外表面和腔內(nèi)區(qū)域單獨或同時進行融合表達，顯著提高了EVs的蛋白裝載能力和工程化靈活性，且在藥物遞送效率上優(yōu)于傳統(tǒng)重組蛋白，為開發(fā)新型EVs治療載體提供了有力的技術支持和廣闊的應用前景。
實驗方法：
質(zhì)粒構建與轉染、細胞外囊泡分離、透射電子顯微鏡檢測、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)濃度檢測（BCA法）、Western blot與蛋白富集計算、納米流式細胞術檢測（NanoFCM）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、NanoLuc熒光素酶活性檢測、定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（ddPCR）、體外細胞實驗、體內(nèi)腫瘤抑制實驗、穩(wěn)定性檢測、流式細胞術分析。
參考文獻
Zhao H, Li Z, Liu D, Zhang J, You Z, Shao Y, Li H, Yang J, Liu X, Wang M, Wu C, Chen J, Wang J, Kong G, Zhao L. PlexinA1 (PLXNA1) as a novel scaffold protein for the engineering of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2024 Nov;13(11):e70012. doi: 10.1002/jev2.70012. PMID: 39508411; PMCID: PMC11541859.