免疫細胞竟靠“吃乳酸”增強戰(zhàn)斗力？《Nature》子刊揭示抗感染代謝關(guān)鍵

         訓(xùn)練有素的免疫力是指先天性免疫細胞的長期記憶。然而，人們對環(huán)境營養(yǎng)供應(yīng)如何影響訓(xùn)練有素的免疫力知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，生理碳源（PCSs）會影響葡萄糖對三羧酸（TCA）循環(huán)的貢獻，并促進訓(xùn)練有素的單核細胞產(chǎn)生細胞因子。本研究證明，訓(xùn)練有素的單核細胞優(yōu)先使用乳酸而不是葡萄糖作為 TCA 循環(huán)底物，乳酸代謝是訓(xùn)練有素的免疫細胞對細菌和真菌感染做出反應(yīng)所必需的。除了對 TCA 循環(huán)的貢獻外，內(nèi)源性乳酸或外源性乳酸還通過調(diào)節(jié)組蛋白乳?；С钟?xùn)練有素的免疫。進一步的轉(zhuǎn)錄組分析、ATAC-seq和CUT&Tag-seq表明，乳酸鹽以依賴組蛋白乳化的方式提高染色質(zhì)的可及性。通過沉默乳酸脫氫酶 A（LDHA）抑制依賴乳酸的新陳代謝，損害以乳酸為燃料的 TCA 循環(huán)和組蛋白乳化。這些發(fā)現(xiàn)表明，乳酸是訓(xùn)練有素的免疫代謝和表觀遺傳程序的樞紐。該研究于2025年4月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：14.7。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. PCSs 在誘導(dǎo)訓(xùn)練有素的免疫過程中影響單核細胞對葡萄糖的利用

         利用 13C 代謝示蹤劑，作者研究了 PCSs 在訓(xùn)練免疫中對葡萄糖代謝的作用（圖 1a）。質(zhì)譜分析（MS）顯示，13C-葡萄糖廣泛標(biāo)記了β-葡聚糖處理單核細胞中糖酵解和 TCA 循環(huán)的中間產(chǎn)物（圖 1b-1d）。相比之下，在經(jīng) β-葡聚糖處理的單核細胞中存在生理濃度的 PCSs 時，13C-葡萄糖對 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物的貢獻明顯受到抑制（圖 1b-1d）。耐人尋味的是，生理濃度下 PCS 的存在會引導(dǎo)葡萄糖流向 PPP 和絲氨酸合成途徑（SSP）（圖 1e 和 1d）。由 TCA 催化產(chǎn)生的代謝物，如谷氨酸和天門冬氨酸也得到了類似的結(jié)果（圖 1g）。結(jié)果顯示，βOHB 和乳酸通過檸檬酸合成酶（M + 2 檸檬酸）以 2 碳進入的方式為 TCA 循環(huán)提供碳，并在β-葡聚糖處理的單核細胞中貫穿整個循環(huán)（圖 1h）。值得注意的是，與葡萄糖濃度（5 毫摩爾）相比，乳酸鹽濃度（1 毫摩爾）更低，訓(xùn)練有素的單核細胞更愿意使用 PCS 而不是葡萄糖進行 TCA 循環(huán)代謝（圖 1h）。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，在訓(xùn)練有素的免疫過程中，PCS 降低了13C 葡萄糖對 TCA 循環(huán)的貢獻，并促使 13C 葡萄糖從糖酵解轉(zhuǎn)向 PPP 和 SSP。

圖1. PCS 影響葡萄糖在訓(xùn)練有素的免疫系統(tǒng)中的利用

2. 乳酸激活訓(xùn)練有素的免疫

         由于在上述 PCSs 中，乳酸對 TCA 循環(huán)的調(diào)控作用最為顯著（圖 1h），作者接下來研究了乳酸在白僵菌感染時對訓(xùn)練有素的免疫系統(tǒng)的作用（圖 2a）。由于乳酸脫氫酶（Ldh）通過使用 NAD+/NADH 作為輔助因子來相互轉(zhuǎn)化乳酸和丙酮酸，作者提問LDHA 是否在訓(xùn)練有素的免疫中發(fā)揮作用。首先，采用他莫昔芬誘導(dǎo)的LDHA基因敲除小鼠（LDHA-/-）。為研究乳酸鹽對訓(xùn)練單核細胞功能的作用，用β-葡聚糖訓(xùn)練小鼠，然后用白僵菌挑戰(zhàn)小鼠（圖 2a）。不出所料，訓(xùn)練過的β-葡聚糖 Wt 小鼠會誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-6 和 TNF-α，而 LDHA-/- 小鼠則不會（圖 2b）。肺組織的組織學(xué)分析表明，在隨后的感染過程中，事先進行β-葡聚糖處理可限制肺損傷（圖 2c）。與接受過β-葡聚糖訓(xùn)練的Wt小鼠相比，LDHA-/-小鼠的肺損傷更為嚴(yán)重（圖2c）。因此，LDHA-/-小鼠極易受到白僵菌誘導(dǎo)的致死影響，同時肺部和腎臟組織中的細菌負荷也較高（圖 2d 和 2e）。

         此外，作者還研究了乳酸鹽在應(yīng)對白僵菌感染時對訓(xùn)練有素的免疫力的作用。為排除乳酸鹽通過改變酸度來影響訓(xùn)練有素的免疫力的可能性，在本手稿的所有體外實驗中，培養(yǎng)基的 pH 值都被調(diào)整到相同水平。乳酸鹽的存在增加白僵菌誘導(dǎo)的 IL-6 和 TNF-α水平，同時降低腎臟和肺組織中的真菌負擔(dān)（圖 2f-2h）。令人震驚的是，乳酸鹽增加了訓(xùn)練有素的單核細胞對致命的全身性白僵菌感染的保護性反應(yīng)（圖 2i）。這些研究結(jié)果表明，乳酸對于訓(xùn)練有素的免疫系統(tǒng)對白茨球菌感染的保護性反應(yīng)是不可或缺的。

圖2. 乳酸調(diào)控訓(xùn)練有素的免疫

3. 乳酸是誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫過程中的一種生理燃料

         為評估葡萄糖和乳酸鹽在 TCA 循環(huán)代謝中的競爭情況，用 13C 葡萄糖和濃度逐漸增加的未標(biāo)記乳酸鹽培養(yǎng)處理過的單核細胞。即使在生理葡萄糖濃度（5 mM）下，β-葡聚糖處理過的單核細胞也會使用低濃度乳酸（1-2 mM）作為 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物的碳源（圖 3a-3d）。相比之下，低濃度乳酸鹽（1 mM）引導(dǎo)葡萄糖（5 mM）從 OxPhos 流向 SSP 和 PPP（圖 3a-3f）。在乳酸鹽處理的單核細胞中，葡萄糖衍生的大量標(biāo)記 SAM（包括 m + 5（通過 PPP）和 m + 6-9（通過 PPP 和 SSP））顯著增加（圖 3g 和 3h），表明葡萄糖在乳酸鹽存在的情況下被用于生物合成。由于乳酸有助于 TCA 循環(huán)代謝，接下來研究了乳酸對訓(xùn)練有素的單核細胞生物能的作用。通過使用以線粒體（Mito，mtAT1.03）為靶點的基于福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的 ATP 傳感器，發(fā)現(xiàn)乳酸鹽的存在或β-葡聚糖的處理增強 ATP 的產(chǎn)生（圖 3i）。同時處理β-葡聚糖和乳酸鹽可顯著協(xié)同誘導(dǎo) ATP 的產(chǎn)生（圖 3i）。與 13C 代謝物數(shù)據(jù)一致，乳酸增加了β-葡聚糖誘導(dǎo)的乙酰-CoA、檸檬酸鹽和蘋果酸鹽的水平（圖 3j）。最后研究了葡萄糖在β-葡聚糖處理過程中對乳酸促成的 TCA 循環(huán)代謝的作用。如圖 3k 所示，在含有葡萄糖（1-10 mM）的培養(yǎng)基中，低乳酸濃度（1 mM）仍然有助于β-葡聚糖處理過程中的 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物。當(dāng)葡萄糖濃度比乳酸濃度高 25 倍時，13C-乳酸不能為 TCA 循環(huán)提供碳（圖 3k）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在生理條件下，即使有葡萄糖，乳酸也是訓(xùn)練有素的單核細胞的 TCA 循環(huán)底物。

圖3. 乳酸是誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫過程中的一種生理燃料

4. 乳酸通過 LDHA 增強訓(xùn)練有素的免疫力

         接下來研究 LDHA 在訓(xùn)練免疫中對乳酸生物能功能的作用。如圖 4a 和 4b 所示，在 LDHA-/- 單核細胞中觀察到 13C 乳酸衍生的檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、谷氨酸鹽和天門冬氨酸鹽的豐度在β-葡聚糖處理后有所下降。13C 乳酸也有助于乙酰-CoA 相關(guān)代謝物的產(chǎn)生，包括 Ac-肉堿和 Ac-丙氨酸，這些代謝物存在于經(jīng) β-葡聚糖處理的 Wt 單核細胞中，但不存在于經(jīng) β-葡聚糖處理的 LDHA-/- 單核細胞中（圖 4c）。通過使用線粒體 ATP 探針 mtAT，β-葡聚糖處理可提高 Wt 單核細胞的 ATP 產(chǎn)量，但 LDHA-/- 單核細胞經(jīng)β-葡聚糖處理后的 ATP 產(chǎn)量則不會提高（圖 4d）。同樣，LDHA 基因敲除抑制β-葡聚糖誘導(dǎo)的乙酰-CoA、檸檬酸鹽和蘋果酸鹽的水平（圖 4e）。接下來，通過注入 13C 代謝物來探索宿主是否將乳酸作為體內(nèi)訓(xùn)練免疫的燃料。在體內(nèi)系統(tǒng)中，完全標(biāo)記的（M + 3）13C-乳酸鹽在血清和肺中富集了約 80%（圖 4f 和 4g）。與體內(nèi)外數(shù)據(jù)一致的是，輸注的 13C 乳酸在體內(nèi)很容易標(biāo)記出 TCA 循環(huán)衍生的代謝物，這與β-葡聚糖處理 Wt 小鼠的結(jié)果一致，但在 LDHA-/- 小鼠體內(nèi)則沒有（圖 4h 和 4i）。這些研究結(jié)果表明，通過 LDHA 處理乳酸是訓(xùn)練免疫的一個關(guān)鍵代謝節(jié)點。

圖4. Ldha 可影響新陳代謝和訓(xùn)練有素的免疫功能

5. 在誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫過程中，乳酸鹽通過 LDHA 調(diào)節(jié)單核細胞中組蛋白的乳化作用

         先前的研究表明，賴氨酸乳酰化（Kla）是一種新型組蛋白標(biāo)記，可被乳酸鹽刺激；作者推測β-葡聚糖調(diào)節(jié)的高水平乳酸鹽對訓(xùn)練免疫中組蛋白乳?；挠绊憽Ｃ庖哂≯E分析表明，組蛋白 Kla 水平升高，但組蛋白乙?；?span>Kac）水平輕度升高，且在β-葡聚糖處理的單核細胞中呈時間依賴性（圖 5a）。組蛋白 Kla 水平的升高早在β-葡聚糖處理后 6 小時就被檢測到（圖 5a）。耐人尋味的是，高組蛋白 Kla 水平從第 1 天一直維持到第 9 天（圖 5b）。不出所料，β-葡聚糖挑戰(zhàn)以劑量依賴性方式誘導(dǎo)組蛋白 Kla 水平，并輕度誘導(dǎo) Kac 水平（圖 5c）。因此，使用 13C 葡萄糖或 13C 乳酸鹽進行代謝標(biāo)記實驗，然后進行 MS/MS 分析，結(jié)果表明，β-葡聚糖可直接促進葡萄糖或外源乳酸鹽的組蛋白乳化作用（圖 5d-5g）。此外，β-葡聚糖處理增加 Wt 單核細胞中組蛋白 Kla 的水平，而 LDHA-/- 單核細胞中的組蛋白 Kla 水平卻沒有增加（圖 5h）。這些研究結(jié)果表明，細胞內(nèi)乳酸水平過高會導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化。

圖5. β-葡聚糖通過 Ldha 調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化

6. 在訓(xùn)練有素的免疫誘導(dǎo)過程中，乳酸通過組蛋白乳化作用維持單核細胞中染色質(zhì)的可及性

         為研究乳酸鹽的產(chǎn)生對訓(xùn)練有素的免疫力的機械影響，利用高通量測序（ATAC-seq）分析法（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）比較了Wt單核細胞、Wt單核細胞和LDHA-/-訓(xùn)練有素的單核細胞之間染色質(zhì)區(qū)域的可及性變化。確定了 2,848 個染色質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)可及性變化（圖 6a）。為評估乳酸對轉(zhuǎn)錄的功能性影響，對 Wt 單核細胞、Wt 單核細胞和 LDHA-/- 訓(xùn)練有素的單核細胞進行生物重復(fù)的 RNA 序列分析（圖 6a）。首先探討染色質(zhì)可及性變化與基因表達之間的關(guān)系。將每個差異可及區(qū)域（DARs）分配到與其最近的轉(zhuǎn)錄起始位點，并檢測基因表達差異。觀察到染色質(zhì)可及性的變化與鄰近基因的表達之間存在明顯的相關(guān)性（圖 6b）。接下來確定了在 Wt 單核細胞、Wt 和 LDHA-/- 訓(xùn)練單核細胞中上調(diào)的 836 個基因，這些基因也標(biāo)記有染色質(zhì)可及性的改變（圖 6c）。對這些基因進行的基因本體（GO）生物過程分析顯示了生物通路的顯著富集，包括免疫反應(yīng)、乳酸代謝和 HIF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖 6d）。選擇H3賴氨酸27（H3K27la）（該賴氨酸殘基也有乙?；?span>H3K27ac）），利用新型的全基因組免疫系留測定法CUT&Tag來闡明組蛋白乳?；谟?xùn)練有素的免疫中的潛在功能意義。全基因組分布分析表明，H3K27la 和 H3K27ac 組蛋白修飾主要位于啟動子區(qū)域（圖 6e）。正如預(yù)期的那樣，在 Wt 訓(xùn)練的單核細胞中，H3K27la 峰在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSSs）附近增加，而在 LDHA-/- 訓(xùn)練的單核細胞中則沒有增加（圖 6f）。比較H3K27la標(biāo)記基因在Wt非訓(xùn)練單核細胞、Wt和LDHA-/-訓(xùn)練單核細胞中的表達。在三組共 7547 個共有峰中，發(fā)現(xiàn)有 248 個峰發(fā)生顯著變化（圖 6g）。GO通路分析顯示，炎癥反應(yīng)、乳酸代謝和細胞粘附等生物過程與ATAC-seq數(shù)據(jù)一致（圖6h）。為檢驗 H3K27la 和 H3K27ac 在訓(xùn)練有素的單核細胞功能中的作用，將 ATAC-seq 數(shù)據(jù)集和 CUT&Tag 數(shù)據(jù)集整合到整合基因組學(xué)瀏覽器（Integrative Genomics Viewer）中，以檢查它們在基因上的結(jié)合情況。在 Wt 訓(xùn)練的單核細胞中，包括 IL-6、TNF-α、PSGL 和 ICAM-1 在內(nèi)的炎癥因子和細胞粘附分子的關(guān)鍵基因啟動子上的 H3K27la 峰高度富集，而在 LDHA-/- 訓(xùn)練的單核細胞中則沒有（圖 6i、6j）。然后使用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-qPCR 試驗評估 H3K27la 和 H3K27ac 對穩(wěn)定效應(yīng)基因表達的影響。事實上，在Wt-訓(xùn)練的單核細胞中，IL-6、TNF-α、PSGL和ICAM-1啟動子區(qū)域的H3K27la招募增加，但在LDHA-/-訓(xùn)練的單核細胞中卻沒有增加（圖6k）。與 Wt 非訓(xùn)練型單核細胞相比，Wt 訓(xùn)練型單核細胞中 IL-6、TNF-α、PSGL 和 ICAM-1 啟動子區(qū)域的 H3K27ac 募集僅存在微小差異（圖 6l）。這些發(fā)現(xiàn)表明，內(nèi)在乳酸鹽的產(chǎn)生改變了訓(xùn)練有素的單核細胞中炎癥因子和細胞粘附分子啟動子上乙酰化依賴性表觀遺傳編程。

圖6. 在誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的過程中，乳酸通過 Ldha 調(diào)節(jié)單核細胞中組蛋白的乳酸化

7. 外源性乳酸鹽通過促進 TCA 循環(huán)和組蛋白乳化作用，支持訓(xùn)練有素的免疫力

         作者的數(shù)據(jù)顯示，β-葡聚糖能溫和地誘導(dǎo)組蛋白乙?；?。因此推測，乳酸被吸收后很容易通過 LDHA 轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后在丙酮酸脫氫酶（PDHA）和 ATP 檸檬酸裂解酶（ACLY）的兩種酶催化反應(yīng)中分別轉(zhuǎn)化為細胞質(zhì)乙酰-CoA33（圖 7a）。為此，比較了葡萄糖和乳酸對乙酰-CoA 生成的作用。如圖 7b 所示，高葡萄糖（HG）和低葡萄糖（LG）都不影響β-葡聚糖調(diào)節(jié)乙酰-CoA 的生成，但乳酸鹽處理可誘導(dǎo)β-葡聚糖調(diào)節(jié)乙酰-CoA 的生成，表明β-葡聚糖通過乳酸鹽促進乙酰-CoA 的生成。但葡萄糖卻不能（圖 7b）。為剖析乙酰-CoA生成所涉及的乳酸代謝的關(guān)鍵步驟，分別采用LDHA抑制劑（草氨酸鈉，Oxa）、丙酮酸轉(zhuǎn)運體抑制劑（UK5099）和ACLY抑制劑（BMS303141，BMS）等一系列針對LDHA、PDHA和ACLY的藥理學(xué)方法（圖7a）。有趣的是，Oxa、UK5099 和 BMS 可抑制β-葡聚糖誘導(dǎo)的乙酰-CoA 生成（圖 7c）。以乙酰-CoA 的同位素為重點的 LC/MS 分析表明，乳酸碳標(biāo)記大部分乙酰-CoA。m + 2 乙酰-CoA同位素顯示了來自乳酸碳的最重要的標(biāo)記模式（圖 7d 和 7e）。為明確乳酸促進組蛋白乙酰化的途徑，假設(shè)這涉及氧化代謝，尤其是 ACLY。令人吃驚的是，BMS能抵消β-葡聚糖介導(dǎo)的組蛋白乙?；?，但不能抵消組蛋白乳酸化（圖 7f）。令人驚訝的是，ACLY抑制劑并不影響β-葡聚糖介導(dǎo)的IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，也不影響體外和體內(nèi)肺和腎組織中的細菌負荷（圖7g-7i）。此外，BMS 處理抑制 H3K27ac 和 H3K18ac，但不能抑制 H3K27la 和 H3K18la 在 IL-6、TNF-α 和 PSGL 啟動子區(qū)域的招募（圖 7j-7m）。這些結(jié)果表明，乳酸是乙酰-CoA 生成的重要底物。與乳酸介導(dǎo)的組蛋白乙?；啾?，乳酸介導(dǎo)的組蛋白乳酸化在訓(xùn)練免疫中起著主導(dǎo)作用。

圖7. 外源性乳酸鹽通過促進 TCA 循環(huán)和組蛋白乳化作用，支持訓(xùn)練有素的免疫

結(jié)論

         綜上所述，本研究證明乳酸是訓(xùn)練有素的免疫細胞的生理燃料，比葡萄糖更受青睞，并能調(diào)節(jié)訓(xùn)練有素的免疫細胞的細胞因子產(chǎn)生。從機理上講，一些固有的乳酸鹽功能是乙酰-CoA 合成的重要底物，并為 TCA 循環(huán)提供燃料。另一種固有乳酸則進入細胞核，通過組蛋白乳酸化作用調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)確定了訓(xùn)練免疫中的主要代謝物（乳酸），有助于我們了解先天性免疫記憶，并開辟新的治療途徑。

實驗方法：

         單核細胞和外周血單核細胞分離，細胞培養(yǎng)，Western blot，細胞因子測量，ChIP-seq，CUT&Tag seq，ATAC seq，細菌培養(yǎng)，ChIP-qPCR，質(zhì)譜，流式細胞量化線粒體 ATP 水平

參考文獻

         Cai H, Chen X, Liu Y, Chen Y, Zhong G, Chen X, Rong S, Zeng H, Zhang L, Li Z, Liao A, Zeng X, Xiong W, Guo C, Zhu Y, Deng KQ, Ren H, Yan H, Cai Z, Xu K, Zhou L, Lu Z, Wang F, Liu S. Lactate activates trained immunity by fueling the tricarboxylic acid cycle and regulating histone lactylation. Nat Commun. 2025 Apr 4;16(1):3230. doi: 10.1038/s41467-025-58563-2. PMID: 40185732; PMCID: PMC11971257.